一種鏈霉菌菌株及由它制備的具抗植物病原真菌的化合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種鏈霉菌FTY2菌株及由它制備的環(huán)己酰亞胺類化合物及其應(yīng)用。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株為鏈霉菌(Streptomycessp.)FTY2,該菌株已于2014年5月8日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)：CGMCCNo.9133，菌種由16SrDNA鑒定。與現(xiàn)有的抗植物病原真菌農(nóng)藥相比，本發(fā)明具有對(duì)環(huán)境無(wú)污染、成本低、抗植物病原真菌效果較好的優(yōu)點(diǎn)。首次發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物的環(huán)己酰亞胺類化合物(cycloheximide)具抗真菌，能作為制備抗植物病原真菌藥制劑和前體物質(zhì)的應(yīng)用。還提供了所'述的鏈霉菌FTY2菌株和環(huán)己酰亞胺化合物在制?備抗植物病原真菌的農(nóng)藥中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種鏈霉菌菌株及由它制備的具抗植物病原真菌的化合物 及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種鏈霉菌（Streptomyces sp. )FTY2菌株，及 由其制備的具有抑制植物病原真菌的化合物及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 農(nóng)作物病蟲(chóng)草鼠害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要生物災(zāi)害，是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高 效和持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。我國(guó)農(nóng)作物病蟲(chóng)草鼠等生物災(zāi)害種類多，糧食作物的主要 病蟲(chóng)害有近200種（胡伯海.2002)。眾多病蟲(chóng)害發(fā)生重、范圍廣，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損 失，約為農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的20%?25% (王長(zhǎng)燕等，2006)，因而嚴(yán)重影響我國(guó)的糧食生產(chǎn)和品 質(zhì)安全。植物保護(hù)作為防治農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害的重要措施，對(duì)促進(jìn)我國(guó)糧食生產(chǎn)安全和保障糧食 安全的可持續(xù)發(fā)展有著十分重要的意義。因此，研究開(kāi)發(fā)高效低毒的生物病蟲(chóng)害制劑已成 為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要問(wèn)題。現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)有一種鏈霉菌（Streptomyces sp.)FTY2 菌株制備兩個(gè)環(huán)己酰亞胺化合物（cycloheximide)以及它們抗植物病原真菌活性的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一類來(lái)源于榧樹(shù)的內(nèi)生鏈霉菌的鏈霉菌（Streptomyces sp. )FTY2菌株，由其制備的具有抑制植物病原真菌的化合物及其制備方法和應(yīng)用。該 化合物具有抗病原真菌（小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis)、棉紅腐病菌 (Fusarinum moniliforme)、三七絲核病菌（Verticillium cinnabarium)以及水稻稻癌病 菌（Phyricularia oryzae))的活性。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0005] -種分離自榧樹(shù)的內(nèi)生鏈霉菌（Streptomyces sp.)菌株，編號(hào)為FTY2,由16S rDNA鑒定菌株，保藏號(hào)為CGMCC No. 9133。
[0006] 如所述的鏈霉菌FTY2菌株，其DNA由下述方法制備而得：
[0007] (1)將FTY2接種于液體淀粉培養(yǎng)基中，25°C，200rpm培養(yǎng)14天，過(guò)濾收集菌絲體；
[0008] (2)選取適量菌絲體放入I. 5mL離心管（EP管）中，同時(shí)在離心管中加入少量的石 英砂和少量的PVP (聚乙烯吡咯烷酮）；
[0009] (3)在離心管（內(nèi)有研磨好的材料粉末）中加入750 μ L 65°C水浴預(yù)熱的4X CTAB 提取液，充分研磨后，放入65°C水浴鍋中溫浴2-4h，期間每30min搖勻一次；
[0010] (4)將溫浴的材料取出置于室溫下，待冷卻至室溫后加入等體積（750 μ L)的苯 酚-氯仿-異戊醇混合液（25:24:1)，搖勻3?5min，12000rpm室溫離心IOmin ;
[0011] (5)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的I. 5mL的離心管中，再加入等體積的氯仿-異戊醇 (500-550 μ L)混合液（若顏色較深可前兩次使用苯酚-氯仿-異戊醇混合液，最后一次使 用氯仿-異戊醇），搖勻3?5min，12000rpm，室溫離心IOmin ;(
[0012] (6)將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL的離心管中，加入2/3體積（約35〇μυ 的-20°C預(yù)冷的異丙醇（凝固點(diǎn)低，沉降DNA)，沉降DNA，充分混勻后（一定要充分搖勻，否 則會(huì)冰凍），于_20°C冰箱中靜置保存2h ;
[0013] (7)將冷凍保存的離心管取出后置于室溫中，待溫度至室溫后12000rpm室溫離心 15min?？梢?jiàn)底部沉降DNA;
[0014] (8)棄去上清液，用500 μ L的70 %的乙醇和無(wú)水乙醇各沖洗1-2次，每次 12000rpm室溫離心Imin后棄上清液（直接倒掉上清液即可，注意不要將DNA倒掉，倒的過(guò) 程中可輕輕旋轉(zhuǎn)使DNA貼在壁上），然后將離心管置于37°C恒溫箱中約20?30min使乙醇 充分揮發(fā)（也可以開(kāi)蓋使其自然干燥），干燥后加入滅菌的蒸餾水；
[0015] (9)置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0016] 如所述的鏈霉菌FTY2菌株，其來(lái)源于榧樹(shù)的內(nèi)生鏈霉菌。
[0017] 所述的鏈霉菌FTY2菌株的制備方法，采自海拔2190m的云南省迪慶州維西縣云 南榧Torreya yunnanensis的新鮮枝條置于冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后，將新鮮枝葉用自來(lái) 水沖洗15min，晾干后置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行表面消毒，先用75%乙醇浸泡約lmin，用無(wú)菌 水涮洗3次，接著用15%的NaClO浸泡15min，用無(wú)菌水涮洗3次。取消毒后的3g葉片置 于無(wú)菌研缽中加5mL無(wú)菌水研磨呈勻漿狀，用三角涂布棒將200 μ L研磨液均勻涂布于含有 重鉻酸鉀（50mg/L)的高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基（可溶性淀粉20g/L，KN03lg/L，K 2HPO4O. 5g/L， MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 01g/L，瓊脂 20g/L，pH 7· 2 ?7· 4)上， 在25°C條件下培養(yǎng)20天，一個(gè)鏈霉菌菌落在平板上長(zhǎng)出，挑取單一菌落，用劃線法純化后， 菌株編號(hào)為FTY2。
[0018] 從所述的鏈霉菌FTY2菌株的固體發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯部分分離得到的如下結(jié)構(gòu) 式所示的兩個(gè)環(huán)己酰亞胺化合物，
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離自植樹(shù)的內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces sp.菌株，編號(hào)為FTY2,由16S rDNA 鑒定菌株，保藏號(hào)為CGMCC No. 9133。
2. 如權(quán)利要求1所述的鏈霉菌FTY2菌株，其特征在于其DNA由下述方法制備而得： (1) 將FTY2接種于液體淀粉培養(yǎng)基中，25°C，200rpm培養(yǎng)14天，過(guò)濾收集菌絲體； (2) 選取適量菌絲體放入I. 5mL離心管即EP管中，同時(shí)在離心管中加入少量的石英砂 和少量的PVP聚乙烯吡咯烷酮； ⑶在內(nèi)有研磨好的材料粉末的離心管中加入750 μ L 65°C水浴預(yù)熱的4XCTAB提取 液，充分研磨后，放入65°C水浴鍋中溫浴2-4h，期間每30min搖勻一次； (4) 將溫浴的材料取出置于室溫下，待冷卻至室溫后加入等體積750 μ L的25:24:1的 苯酚-氯仿-異戊醇混合液，搖勻3?5min，12000rpm室溫離心IOmin ; (5) 將上清液轉(zhuǎn)移至一新的I. 5mL的離心管中，再加入等體積500-550 μ L的氯仿-異 戊醇混合液，當(dāng)顏色較深時(shí)，前兩次使用苯酚-氯仿-異戊醇混合液，最后一次使用氯 仿-異戊醇，搖勻3?5min，12000rpm，室溫離心IOmin ; (6) 將上清液轉(zhuǎn)移至一新的I. 5mL的離心管中，加入2/3體積的-20°C預(yù)冷的異丙醇， 沉降DNA，充分混勻后，于-20°C冰箱中靜置保存2h ; (7) 將冷凍保存的離心管取出后置于室溫中，待溫度至室溫后12000rpm室溫離心 15min，底部沉降DNA ; (8) 棄去上清液，用50(^1^的70%的乙醇和無(wú)水乙醇各沖洗1-2次，每次12000印111室 溫離心Imin后棄上清液，直接倒掉上清液，倒的過(guò)程中輕輕旋轉(zhuǎn)使DNA貼在壁上，然后將離 心管置于37°C恒溫箱中20?30min使乙醇充分揮發(fā)或開(kāi)蓋使其自然干燥，干燥后加入滅菌 的蒸餾水； (9) 置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 3. 如權(quán)利要求1所述的鏈霉菌FTY2菌株，其特征在于其來(lái)源于榧樹(shù)的內(nèi)生鏈霉菌。
4. 權(quán)利要求1所述的鏈霉菌FTY2菌株的制備方法，取云南榧Torreya yunnanensis 的新鮮枝條置于冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后，將新鮮枝葉用自來(lái)水沖洗15_20min，晾干后置于 超凈工作臺(tái)上進(jìn)行表面消毒，先用75%乙醇浸泡l-2min，用無(wú)菌水涮洗3次，接著用15% 的NaClO浸泡15-20min，用無(wú)菌水涮洗3次，取消毒后的3g葉片置于無(wú)菌研缽中加5mL無(wú) 菌水研磨呈勻漿狀，用三角涂布棒將200 μ L研磨液均勻涂布于含有50mg/L的重鉻酸鉀的 高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基組成為：可溶性淀粉20g/L，KN0 3lg/L，K2HPO4O. 5g/L， MgSO4 ·7Η200· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，F(xiàn)eS04 ·7Η20 0· 01g/L，瓊脂 20g/L，pH 7· 2 ?7· 4,在 25°C 條件下培養(yǎng)20天，一個(gè)鏈霉菌菌落在平板上長(zhǎng)出， 挑取單一菌落，用劃線法純化后，菌株編號(hào)為FTY2。
5. 從權(quán)利要求1所述的鏈霉菌FTY2菌株的固體發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯部分分離得到的 如下結(jié)構(gòu)式所示的兩個(gè)環(huán)己酰亞胺化合物，
6. 制備權(quán)利要求5所述化合物1-2的方法，將鏈霉菌FTY2用固體平板的方式用燕麥培 養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述燕麥培養(yǎng)基為：燕麥粉20. Og，微量兀素母液ImL,蒸饋水IOOOmL, pH 7. 2 ;所述微量元素母液配方為：FeSO4 · 7H20 0· lg，MnCl2 · 4H20 0· lg，ZnS04 · 7H20 〇. lg，蒸餾水IOOmL ;121°C滅菌20min ;在26°C發(fā)酵培養(yǎng)21d，發(fā)酵20L ;固體發(fā)酵物切割后 用80% :15% :5%的乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸冷浸提取三次，提取液過(guò)濾減壓濃縮除去有 機(jī)相后溶于水中，加入相等體積的乙酸乙酯萃取三次，合并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后得粗提物； 浸膏經(jīng)200?300目硅膠柱色譜，以10:1 - 6:4的石油醚-乙酸乙酯及10:1 - 0:100的 氯仿-甲醇梯度洗脫得10個(gè)組分Fr. I-Fr. 10 ;組分Fr. 8經(jīng)200?300目硅膠，用100:15 的石油醚-丙酮進(jìn)行洗脫得到5個(gè)亞組分；Fr. 8. 3為白色粉末狀，經(jīng)S印hadex LH-20氯 仿-甲醇1: 1，得到Fr. 8. 3. 1和Fr. 8. 3. 2 ;Fr. 8. 3. 2經(jīng)半制備HPLC得到化合物1及2,具 體條件為：環(huán)境溫度下，使用250mmX IOmm的RP-C18,流動(dòng)相為水-甲醇溶液，水從60%降 至〇%，流速為3mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。
7. 權(quán)利要求1所述的鏈霉菌FTY2菌株在制備抗植物病原真菌的農(nóng)藥中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求5所述的環(huán)己酰亞胺化合物在制備抗植物病原真菌的農(nóng)藥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK104212742SQ201410418250
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】趙沛基, 周曉雪, 李靖, 楊銀河, 曾英 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所