一種無血清懸浮培養(yǎng)狂犬病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及疫苗生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是通過無血清培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合懸浮培養(yǎng)的方式，實現(xiàn)狂犬病毒的大規(guī)模擴增。利用本發(fā)明所述方法，BHK21種子細(xì)胞的活力高于95％，密度達(dá)到5×106cell/ml，狂犬病毒滴度大于或等于108。所述方法生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，能有效降低生產(chǎn)成本，顯著提高產(chǎn)品質(zhì)量。
【專利說明】一種無血清懸浮培養(yǎng)狂犬病毒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疫苗生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體提供了一種無血清懸浮培養(yǎng)狂犬病毒的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]1962年，Capstick等對BHK21細(xì)胞馴化實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，并用于獸用疫苗生產(chǎn)。1967年，Van Wezel開發(fā)了微載體并實現(xiàn)在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)與微載體培養(yǎng)標(biāo)志著細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的開始，細(xì)胞生產(chǎn)病毒疫苗也成為細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)生物制品的第一次浪潮。到了 20世紀(jì)八九十年代，CHO細(xì)胞實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，治療性抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展極大地推動著生物反應(yīng)器在生物制藥行業(yè)中的應(yīng)用，到20世紀(jì)末已進(jìn)入萬升級規(guī)模。2000年以后，隨著流加培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、個性化細(xì)胞培養(yǎng)基等技術(shù)的發(fā)展，作為大規(guī)模培養(yǎng)主要設(shè)備的生物反應(yīng)器規(guī)模也趨向大型化和簡單化。當(dāng)今生物制藥的主流技術(shù)是在大型機械攪拌式反應(yīng)器中，用無血清培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)工藝懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。
[0003]狂犬病俗稱“恐水癥”，是由狂犬病毒引起的人獸共患中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，臨床表現(xiàn)以恐水、畏光、吞咽困難、狂躁等為主要特征，是迄今為止人類唯一病死率高達(dá)100%的急性傳染病?！吨腥A人民共和國傳染病防治法》將狂犬病列為乙類傳染病。最早制造狂犬疫苗的是法國的巴斯德。1882年它成功地應(yīng)用連續(xù)傳代減弱病毒毒力的方法，用適應(yīng)毒種來制造疫苗。中國現(xiàn)在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接種于原代地鼠腎細(xì)胞，培養(yǎng)后，收獲毒液，經(jīng)濃縮、純化、精制并加氫氧化鋁佐劑，經(jīng)全面檢定合格后即為預(yù)防狂犬病的疫苗。
[0004]如何通過無血清培養(yǎng)和生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)一步提高獸用狂犬疫苗的質(zhì)量和產(chǎn)量，是目前本領(lǐng)域的研究熱點和難點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種培養(yǎng)狂犬病毒的方法。具體是通過無血清培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合懸浮培養(yǎng)的方式，實現(xiàn)狂犬病毒的大規(guī)模擴增，能有效降低生產(chǎn)成本，顯著提高產(chǎn)品質(zhì)量。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種無血清懸浮培養(yǎng)狂犬病毒的方法，包括如下步驟:
[0007]I)種子細(xì)胞活化
[0008]將液氮凍存的種子細(xì)胞先用血清含量為5%的培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)兩代后，再用血清含量為2%的培養(yǎng)基培養(yǎng)2代；
[0009]2)種子細(xì)胞的無血清馴化
[0010]從2%濃度開始，逐漸降低培養(yǎng)基中血清的含量，連續(xù)馴化種子細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力；待細(xì)胞完全適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)基之后，停止馴化；
[0011]3)種子細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)
[0012]在生物反應(yīng)器中接入馴化后的種子細(xì)胞(初始密度50萬/ml)，反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定為:轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為37°C，溶氧為30-45%，pH值為7.2-7.4 ;采用半連續(xù)流加方式培養(yǎng)細(xì)胞；
[0013]4)狂犬病毒株的增殖
[0014]將狂犬病毒株以2% (v/v)比例接種生長良好的單層種子細(xì)胞，培養(yǎng)48-72小時，當(dāng)病變達(dá)到80-100%時，收獲狂犬病毒液，測定病毒滴度；
[0015]5)接種病毒
[0016]當(dāng)生物反應(yīng)器中種子細(xì)胞的濃度達(dá)到100萬/mL時，按MOI = 0.1接種步驟4)獲得的狂犬病毒液；
[0017]6)病毒大規(guī)模擴增
[0018]生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為:轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/分鐘，DO值40%，溫度為32°C ；
[0019]7)病毒收獲
[0020]狂犬病毒接種72小時后開始收毒，每次收毒2/3體積，隔天再收一次并添加新鮮無血清培養(yǎng)基，收毒2-5次之后，細(xì)胞活力降低到80%以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0021]其中所述種子細(xì)胞為BHK21細(xì)胞或vero細(xì)胞；
[0022]所述生物反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器，反應(yīng)器容積為5L、50L或300L ；
[0023]步驟3)所述半連續(xù)流加方式培養(yǎng)細(xì)胞，是將50倍氨基酸-維生素濃縮液，按照第3 天 10% (v/v),第 5 天 10% (v/v),第 6 天 10% (v/v),第 7 天 10% (v/v),第 8 天 5% (v/V),第9天5% (v/v),第10天5% (v/v),第11天5% (v/v)流加入反應(yīng)器中用于培養(yǎng)細(xì)胞；
[0024]所述狂犬病毒株為Flury或AG毒株；
[0025]本發(fā)明另一方面提供了上述方法在狂犬病毒疫苗制備中的應(yīng)用。
[0026]有益效果
[0027]利用本發(fā)明所述方法，BHK21種子細(xì)胞的活力高于95%，密度達(dá)到5X106cell/ml，狂犬病毒滴度大于或等于108。所述方法生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，能有效降低生產(chǎn)成本，顯著提高產(chǎn)品質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為BHK21細(xì)胞無血清馴化過程。
[0029]圖2為無血清批式培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞生長曲線。
[0030]圖3為無血清批式培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞活力變化情況。
[0031]圖4為BHK21細(xì)胞無血清流加培養(yǎng)生長曲線。
[0032]圖5為培養(yǎng)12天的BHK21細(xì)胞涂片。

【具體實施方式】
[0033]實施例1:BHK21細(xì)胞的無血清馴化
[0034]1.1種子細(xì)胞培養(yǎng):
[0035]在150ml搖瓶中添加30ml細(xì)胞基本培養(yǎng)基，按2% (v/v)比例加入新生牛血清(石家莊宏偉生物)，制備得到低血清培養(yǎng)基；使用該培養(yǎng)基連續(xù)換液擴增BHK21懸浮細(xì)胞株。
[0036]1.2無血清馴化:
[0037]從2%的濃度起始，逐漸降低培養(yǎng)基中血清的含量，增加無血清培養(yǎng)基(Sfm-NB207，北京鈕因公司)的比例，按照圖1所述方式連續(xù)馴化細(xì)胞，用細(xì)胞活力是否能夠穩(wěn)定在90%以上作為馴化是否良好的一個指標(biāo)。
[0038]具體方法如下:按50萬/ml初始密度接入種子細(xì)胞，采用血清含量為2%的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。然后依循如下順序逐步降低培養(yǎng)基中血清的含量至1%、0.5%、0.1%,0%，分這四個階段馴化細(xì)胞，各階段馴化穩(wěn)定的標(biāo)志為:連續(xù)3天細(xì)胞活力保持高于90%，每個階段馴化穩(wěn)定之后再進(jìn)入下一階段。等待細(xì)胞完全適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)之后，停止馴化。
[0039]在150ml搖瓶中，將馴化完畢的BHK-21細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基(Sfm_NB207，北京鈕因公司)中作模擬的批式懸浮培養(yǎng)，其生長曲線與細(xì)胞活力變化情況如圖2，圖3所示，最大細(xì)胞密度達(dá)到300萬/ml以上，細(xì)胞活力大部分時間可以維持在90%以上。表明該細(xì)胞完全適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。
[0040]實施例2:生物反應(yīng)器半流加培養(yǎng)BHK21細(xì)胞
[0041]將馴化后的種子細(xì)胞按初始密度50萬/ml接入7.5L攪拌罐生物反應(yīng)器中，反應(yīng)器轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為37°C，溶氧為30-45% ;pH值為7.2-7.4.
[0042]采用半連續(xù)流加方式培養(yǎng)細(xì)胞。所述半連續(xù)流加方式培養(yǎng)細(xì)胞，是將50倍氨基酸-維生素濃縮液(Sfm-NB207 -avt50，北京鈕因公司)，按照第3天10% (v/v)，第5天10%(v/v)，第 6 天 10 % (v/v),第 7 天 10 % (v/v),第 8 天 5 % (v/v),第 9 天 5 % (v/v),第 10 天5% (v/v)，第11天5% (v/v)流加入反應(yīng)器中用于培養(yǎng)細(xì)胞，，連續(xù)培養(yǎng)二周以上。BHK-21細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中，第5天達(dá)到最高活細(xì)胞密度400萬以上(圖4)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好(圖5)，維持在80%以上存活率的時間達(dá)到12天，基本滿足下一步進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)連續(xù)生產(chǎn)狂犬病毒的需要。
[0043]實施例3:狂犬病毒的大規(guī)模擴增
[0044]將狂犬病毒以2% (v/v)比例接種生長良好的單層BHK21細(xì)胞，培養(yǎng)48_72小時，當(dāng)病變達(dá)到80-100%時，收獲病毒液，測定病毒滴度。
[0045]當(dāng)生物反應(yīng)器中種子細(xì)胞的濃度達(dá)到100萬/mL時,按MOI = 0.1接種上述獲得的狂犬病毒液；生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為:轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/分鐘，DO值40%，溫度為32°C，進(jìn)行病毒大規(guī)模擴增。
[0046]接入病毒之后的72小時開始第一次收毒，每次收毒2/3體積，隔天收一次并添加新鮮培養(yǎng)基，收液2-5次之后細(xì)胞活力降低到80%以下停止收毒(同時病毒滴度也降低到了 6.01ogLD50/ml左右)，合并液病毒滴度在IX 106-8個病毒/ml之間。其間最大細(xì)胞密度可以超過5X 106cells/ml,病毒滴度峰值達(dá)到8.31ogLD50/ml。
【權(quán)利要求】
1.一種無血清懸浮培養(yǎng)狂犬病毒的方法，包括如下步驟: 1)種子細(xì)胞活化 將液氮凍存的種子細(xì)胞先用血清含量為5%的培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)兩代后，再用血清含量為2%的培養(yǎng)基培養(yǎng)2代； 2)種子細(xì)胞的無血清馴化 從2%濃度開始，逐漸降低培養(yǎng)基中血清的含量，連續(xù)馴化種子細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力；待細(xì)胞完全適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)基之后，停止馴化； 3)種子細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng) 在生物反應(yīng)器中接入馴化后的種子細(xì)胞(初始密度50萬/ml)，反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定為-M速80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度37°C，溶氧為30-45%，pH值為7.2-7.4 ;采用半連續(xù)流加方式培養(yǎng)細(xì)胞； 4)狂犬病毒株的增殖 將狂犬病毒株以2% (v/v)比例接種生長良好的單層種子細(xì)胞，培養(yǎng)48-72小時，當(dāng)病變達(dá)到80-100%時，收獲狂犬病毒液，測定病毒滴度； 5)接種病毒 當(dāng)生物反應(yīng)器中種子細(xì)胞的濃度達(dá)到100萬/mL時，按MOI = 0.1接種步驟4)獲得的狂犬病毒液； 6)病毒大規(guī)模擴增 生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為:轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/分鐘，DO值40%，溫度為32°C ； 7)病毒收獲 狂犬病毒接種72小時后開始收毒，每次收毒2/3體積，隔天再收一次并添加新鮮無血清培養(yǎng)基，收毒2-5次之后，細(xì)胞活力降低到80%以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述種子細(xì)胞為BHK21細(xì)胞或veix)細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器，反應(yīng)器容積為5L、50L或300L。
4.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟3)所述半連續(xù)流加方式培養(yǎng)細(xì)胞，是將50倍氨基酸-維生素濃縮液，按照第3天10% (v/v)，第5天10% (v/v)，第6天10% (v/V),第 7 天 10 % (v/v),第 8 天 5 % (v/v),第 9 天 5 % (v/v),第 10 天 5 % (v/v),第 11 天5% (v/v)流加入反應(yīng)器中用于培養(yǎng)細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述狂犬病毒株為Flury或AG毒株。
6.權(quán)利要求1-5任一所述方法在狂犬病毒疫苗制備中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/00GK104178459SQ201410419552
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】凌紅麗, 易建中, 韓成昊, 馬子敏 申請人:青島蔚藍(lán)生物制品有限公司