一種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，以及豬肺炎支原體的培養(yǎng)方法。豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法可同時(shí)培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體，不僅可同時(shí)增殖豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體的滴度，還可獲得高滴度的豬圓環(huán)病毒。利用該培養(yǎng)方法制備出的豬圓環(huán)病毒抗原，外加豬肺炎支原體抗原，制備的疫苗組合物可預(yù)防和/或治療豬圓環(huán)病毒、豬肺炎支原體所引發(fā)的疾病。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法及其應(yīng) 用，以及豬肺炎支原體的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 1974年，德國(guó)學(xué)者Tischer等從連續(xù)傳代的豬腎細(xì)胞系PK15細(xì)胞中檢出一種細(xì) 胞污染物，是一種不能引起細(xì)胞病變的病毒樣粒子。1982年，該學(xué)者進(jìn)一步研究證實(shí)：該 病毒的基因組由單股環(huán)狀的DNA組成，因而將其命名為豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus， PCV)。
[0003] 豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病 毒，直徑平均為17 nm。根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差異，PCV 被劃為無(wú)致病性PCV1和致病性PCV2兩個(gè)基因型，其中PCV2主要引起豬多系統(tǒng)衰弱 綜合征（Pig Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)，還會(huì)引起豬皮炎腎病綜合 征（Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome，F(xiàn)ONS)、豬呼吸道疾病綜合征 (Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC)、增生性壞死性肺炎（Proliferative and Necrotizing Pneumonia，PNP)、先天性震顫（Congenital Tremors，CT)等疾病，總稱(chēng)為豬 圓環(huán)病毒病（Procine Circovirus Disease，PCVD)。在臨床上，PCV2主要侵害豬的肺泡巨 噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，主要感染5-12周齡的仔豬，病豬的臨床癥狀為：漸進(jìn)性消瘦或生長(zhǎng)遲 緩、營(yíng)養(yǎng)不良、咳嗽、呼吸困難、黃疸、腹瀉、皮膚蒼白、淋巴結(jié)腫大、腎臟灰白水腫等，可成為 僵豬，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。
[0004] PCV2感染可引起豬的免疫抑制，從而使機(jī)體更易感染其他病原，這也是豬圓環(huán)病 毒與豬的許多疾病混合感染有關(guān)的原因。最常見(jiàn)的混合感染有豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒，呈二重感 染或三重感染，導(dǎo)致病豬的病死率也將大大提高，有的可達(dá)25% -40%。
[0005] 豬肺炎支原體會(huì)引發(fā)豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS), 該病又稱(chēng)豬氣喘?。ɡ顝┟?，張映.豬肺炎支原體生物學(xué)研究進(jìn)展，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn) 展，2003, 24 (3) : 25-27)或豬地方性流行性肺炎，是一種豬接觸性慢性呼吸道疾病，分布十 分廣泛，以慢性、接觸性、高度傳染性、高發(fā)病率以及低死亡率等為特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為咳嗽和 呼吸困難，解剖時(shí)以肺部病變?yōu)橹?，尤以?xún)煞涡娜~、中間葉和尖葉出現(xiàn)胰樣變和肉樣變?yōu)槠?特征。衣阿華大學(xué)Ross研究發(fā)現(xiàn)：Mhp感染后淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力下降，細(xì)胞免疫力 下降，肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T細(xì)胞的活動(dòng)增強(qiáng)，導(dǎo)致呼吸 道免疫力減弱，抗病力下降，從而使其他病原體更容易侵入，可繼發(fā)感染豬繁殖與呼吸綜合 征、豬圓環(huán)等，從而導(dǎo)致多種疫苗接種失敗。
[0006] PCV2的生物學(xué)特性比較特殊，雖然可以在體內(nèi)長(zhǎng)期以高滴度存在，但在體外培 養(yǎng)中其增殖滴度反而較低且不穩(wěn)定，在國(guó)際上應(yīng)用PK15傳代細(xì)胞培養(yǎng)PCV2的最高含量 很難超過(guò)l〇 3 5TCID5(l/ml ;而且免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示受PCV2感染的PK15細(xì)胞比例僅有 20%-30%，因而PCV2產(chǎn)毒滴度較低，這與當(dāng)前大規(guī)模動(dòng)物疫苗生產(chǎn)不相適應(yīng)（沈璐.豬圓 環(huán)病毒2型熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及培養(yǎng)工藝的初步探討.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位 論文）。
[0007] 豬肺炎支原體的培養(yǎng)難度較大，影響了其在遺傳、生化、免疫等方面的研究（邵國(guó) 青.豬肺炎支原體分子生物學(xué)研究進(jìn)展.中國(guó)人獸共患病雜志，1999,15 (2) :68-73)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明人在試驗(yàn)過(guò)程中意外地發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體共同培養(yǎng)時(shí)，豬 圓環(huán)病毒的滴度有較大幅度的提高。通過(guò)這種培養(yǎng)方法，可以獲得高滴度的豬圓環(huán)病毒，并 且利用此培養(yǎng)方法制備出的豬圓環(huán)病毒還可應(yīng)用于制備豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體的疫 苗組合物。
[0009] 由此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包 括：（1)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，（2)將豬圓環(huán)病毒、豬肺炎支原體分別接種于動(dòng)物細(xì)胞上，以同時(shí)培 養(yǎng)豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體。
[0010] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)方法中動(dòng)物細(xì)胞為豬腎傳代細(xì)胞系、非洲綠猴腎細(xì)胞系、猴胚胎 腎上皮細(xì)胞系和豬睪丸細(xì)胞系中任一細(xì)胞系中的細(xì)胞。
[0011] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)方法中動(dòng)物細(xì)胞為PK15細(xì)胞、PKK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、Marcl45細(xì) 胞和ST細(xì)胞中的任一種。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述培養(yǎng)方法中動(dòng)物細(xì)胞為PK15細(xì)胞或PKK細(xì)胞。
[0013] 術(shù)語(yǔ)"PKK細(xì)胞"是指普萊柯生物工程股份有限公司從PK15細(xì)胞中克隆出的一株 PCV2高敏感的細(xì)胞，該細(xì)胞已公開(kāi)于彭武平等（彭武平，王延輝，胡東波等.豬圓環(huán)病毒2 型細(xì)胞適應(yīng)毒株的培育.第四次豬病學(xué)術(shù)研討會(huì)會(huì)議論文集，263-265)的文獻(xiàn)中。
[0014] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)方法中動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方式為單層貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)或固定 化培養(yǎng)。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述培養(yǎng)方法中動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方式為單層貼壁培養(yǎng)。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含 5% (V/V)胎牛血清的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMR1640培養(yǎng)基和 199培養(yǎng)基中的任一種。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中將豬圓環(huán)病毒、豬肺炎支原體分別同時(shí)接種于培養(yǎng)好的 動(dòng)物細(xì)胞上。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟⑵中豬圓環(huán)病毒、豬肺炎支原體分別按0.01-0.05M0I、 1%-10% (V/V)同時(shí)接種于培養(yǎng)好的動(dòng)物細(xì)胞上。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中豬圓環(huán)病毒為豬圓環(huán)病毒2型全病毒毒株，豬肺炎支原體 為豬肺炎支原體全菌菌株。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟⑵中豬圓環(huán)病毒為SH株、SD株、D株、WH株、LG株、ZJ/C株、 ZJ/H株、DBN-SX07株和V201312株中的任一毒株，豬肺炎支原體為HN0613株、P株、J株、 168 株、P-5722-3 株、BQ14 株、NJ 株、HDZK-Mhp57 株、AN306 株、DJ-166 株和 NM04/41259 株 中的任一菌株。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"SH株"的保藏號(hào)為CGMCC No. 23890,保藏日期為2008年3月4日，保藏單 位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN101240264A 中公開(kāi)。
[0022] 術(shù)語(yǔ)"SD株"的保藏號(hào)為CGMCC No. 7707,保藏日期為2013年5月31日，保藏單 位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN103421748A 中公開(kāi)。
[0023] 術(shù)語(yǔ)"D株"的保藏號(hào)為CGMCC No. 7245,保藏日期為2013年4月24日，保藏單位 為中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN103275938A中公 開(kāi)。
[0024] 術(shù)語(yǔ)"WH株"的保藏號(hào)為CCTCC N〇:V201333,保藏日期為2013年7月19日，保藏 地址為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN103409374A中公開(kāi)。
[0025] 術(shù)語(yǔ)"LG株"來(lái)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（LG 株）所用的豬圓環(huán)病毒2型毒株。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"ZJ/C株"來(lái)自浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗 (ZJ/C株）所用的豬圓環(huán)病毒2型毒株。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"ZJ/H株"的保藏號(hào)為CGMCC No. 6391，保藏日期為2012年7月17日，保藏單 位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN102787100A 中公開(kāi)。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"DBN-SX07株"的保藏號(hào)為CGMCC No. 3064,保藏日期為2009年5月12 日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利 CN101549155A 中公開(kāi)。
[0029] 術(shù)語(yǔ)"V201312株"的保藏號(hào)為CCTCC N〇:V201312,保藏日期為2013年5月28日， 保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN103436498A中公開(kāi)。
[0030] 術(shù)語(yǔ)"HN0613株"的保藏號(hào)為CCTCC No. M2012230,保藏日期為2012年6月13日， 保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該菌株已在專(zhuān)利申請(qǐng)CN103083655A中公開(kāi)。
[0031] 術(shù)語(yǔ)"P株"來(lái)自美國(guó)普泰克國(guó)際有限公司生產(chǎn)豬支原體肺炎滅活疫苗（P株）所 用的豬肺炎支原體菌株。
[0032] 術(shù)語(yǔ)" J株"來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心ATCC，并且指定ATCC登記號(hào)25934和27715， 該菌株已在中國(guó)專(zhuān)利CN101883581A中公開(kāi)。
[0033] 術(shù)語(yǔ)"168株"來(lái)自南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn)的豬支原體肺炎活疫苗（168 株）所用的豬肺炎支原體菌株。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"P-5722-3株"來(lái)自美國(guó)輝瑞公司林肯廠生產(chǎn)豬支原體肺炎滅活疫苗 (P-5722-3株）所用的豬肺炎支原體菌株。
[0035] 術(shù)語(yǔ)"BQ14株"來(lái)自梅里亞有限公司法國(guó)生產(chǎn)廠生產(chǎn)豬支原體肺炎滅活疫苗 (BQ14株）所用的豬肺炎支原體菌株。
[0036] 術(shù)語(yǔ)"NJ株"的保藏號(hào)為CCTCC N〇:M2012286,保藏日期為2012年7月16日，保 藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN103585622A中公開(kāi)。
[0037] 術(shù)語(yǔ)"HDZK-Mhp57株"的保藏號(hào)為CGMCC No. 8096,保藏日期為2013年8月15 曰，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，該菌株已在中國(guó)專(zhuān) 利 CN103484414A 中公開(kāi)。
[0038] 術(shù)語(yǔ)"AN306株"的保藏號(hào)為CCTCC N〇.M2012431，保藏日期為2012年10月25日， 保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN103740625A中公開(kāi)。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"DJ-166株"的保藏號(hào)為CGMCC No. 4545,保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心保藏，該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN103184171A中公開(kāi)。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"NM04/41259株"的保藏號(hào)為NM04/41259株，保藏單位為國(guó)家計(jì)量研究院（澳 大利亞），該毒株已在中國(guó)專(zhuān)利CN102458462A中公開(kāi)。
[0041] 優(yōu)選地，所述步驟（2)培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體用細(xì)胞維持液培養(yǎng)，所 述細(xì)胞維持液為含4% (V/V)犢牛血清和2mmol/l D-氨基葡萄糖鹽酸的培養(yǎng)基，或含1.5% (V/V)胎牛血清的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMR1640培養(yǎng)基和199 培養(yǎng)基中的任一種。
[0042] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬肺炎支原體的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括： (1)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，（2)將豬肺炎支原體接種于動(dòng)物細(xì)胞上，以培養(yǎng)豬肺炎支原體。
[0043] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包含免疫量的所述 豬圓環(huán)病毒培養(yǎng)方法制備的豬圓環(huán)病毒抗原、免疫量的豬肺炎支原體抗原和/或獸醫(yī)學(xué)上 可接受的佐劑。
[0044] 優(yōu)選地，所述豬圓環(huán)病毒抗原的含量為9. OX 107_5TCID5(l/ml，所述豬肺炎支原體抗 原的含量為 2. 7X 109_°MHCDE/ml。
[0045] 術(shù)語(yǔ)"獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑"可包括鋁膠佐劑；皂苷（saponin)，如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Incorporation, Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL);油包水乳劑；水包油乳劑；水包油包水 乳劑；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物 選出的化合物。
[0046] 術(shù)語(yǔ)"乳劑"可尤其基于輕液體石錯(cuò)油（European Pharmacopea類(lèi)型）；因烯經(jīng)寡 聚產(chǎn)生的類(lèi)異戊二烯油（isoprenoid oil),如角藍(lán)燒（squalane)或角藍(lán)烯油（squalene oil)，尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線(xiàn)性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇 二_(辛酸酯/葵酸酯）、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇 的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優(yōu)選非離子表面活性 齊U，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇（mannide)的酯（如無(wú)水甘露醇油酸酯）、脂肪族二元 醇（glycol)的酯、聚甘油（polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異硬脂酸的酯、 蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們?nèi)芜x乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚 物，尤其Pluronic產(chǎn)品，特別是L121。參見(jiàn)Hunter等編寫(xiě)的《The theory and practical application of adjuvants》（Ed.by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等編寫(xiě)的《Vaccine》（1997, 15:564-570)。例如，可使用 Powell Μ 和 Newman M 編寫(xiě)的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach)) (Plenum Press, 1995)第147頁(yè)描述的SPT乳劑及第183頁(yè)描述的MF59乳劑。
[0047] 術(shù)語(yǔ)"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"優(yōu)選為交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物， 尤其是與糖（sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯(lián)，這些化合物已知被稱(chēng)為卡波姆（Carbomer， 商品名Carbopol) (Phameuropa, 1996, 8 (2))。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利 US2909462,其描述了這類(lèi)丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯(lián)，所述化合物具有至 少3個(gè)羥基，優(yōu)選不超過(guò)8個(gè)，其中至少3個(gè)羥基的氫原子被具有至少2個(gè)碳原子的不飽和 脂經(jīng)基（aliphatic radical)取代。優(yōu)選的基團(tuán)是那些含有2-4個(gè)碳原子的基團(tuán)，例如乙烯 基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團(tuán)（ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團(tuán) 自身可包含其它取代基，如甲基。這些產(chǎn)品以卡波普的名義出售，（BF Goodrich, Ohio, USA) 特別合適。它們與烯丙基鹿糖或與烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol)交聯(lián)。這其 中可提及卡波普974P、934P和971P，最優(yōu)選使用卡波普971P。
[0048] 術(shù)語(yǔ)"順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物"也可考慮順丁烯二酸酐與乙烯 的共聚物EMA(Monsanto)，這些聚合物在水中溶解產(chǎn)生酸性溶液，經(jīng)中和，優(yōu)選中和至生理 pH，以便產(chǎn)生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。
[0049] 術(shù)語(yǔ)"佐劑"還包括，但不限于，RIBI佐劑系統(tǒng)（Ribi Incorporation)、 Block co-polymer (CytRx, Atlanta GA)、SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、單憐醜脂質(zhì) A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素（重組或其 它）、霍亂毒素 、MS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐劑等。
[0050] 優(yōu)選地，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI 佐劑系統(tǒng)、Block co-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不 耐熱腸毒素、霍亂毒素、頂S 1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述佐 劑為Gel佐劑。
[0051] 優(yōu)選地，所述佐劑在所述疫苗組合物中的體積比為5 % -30 %。
[0052] 本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"豬"是指任何屬于豬科（Suidae)成員的動(dòng)物，如豬。
[0053] 本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：
[0054] (1)所述豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法可同時(shí)增殖豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體的滴度；
[0055] (2)所述豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法可一次培養(yǎng)制備2種抗原，從而減低疫苗成本。

【具體實(shí)施方式】
[0056] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0057] 本發(fā)明實(shí)施例中所采用豬肺炎支原體攻毒用菌株為CVCC354株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥 品監(jiān)察所。
[0058] 本發(fā)明實(shí)施例中所采用的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式以單層貼壁培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng) 為例進(jìn)行闡述，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
[0059] 本發(fā)明實(shí)施例以丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物中的Carbopol作為佐劑，并以體 積比為10 %的佐劑，制備疫苗組合物為例進(jìn)行闡述，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不 構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
[0060] 本發(fā)明實(shí)施例中所用稀釋液為無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液，即pH7. 4的PBS，其1L體積配 方為：NaCl 8. 0g、KCl 0· 2g、Na2HP04 · 12H20 2. 9g、KH2P040. 24g，加適量蒸餾水溶解后，再用 蒸餾水定容至1L，調(diào)pH值至7. 4,高壓消毒滅菌112Kpa、20min，冷卻后，保存于4°C冰箱中 備用。
[0061] 本發(fā)明中所用到的化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。
[0062] 本發(fā)明實(shí)施例中豬圓環(huán)病毒的發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)以仔豬免疫攻毒法為例進(jìn)行，攻毒后需滿(mǎn) 足的條件：攻毒對(duì)照組應(yīng)至少4頭發(fā)病，免疫組應(yīng)至少4頭保護(hù)。根據(jù)體溫、相對(duì)日增重和 病毒抗原檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)豬圓環(huán)病毒的發(fā)病進(jìn)行判定，詳情如下：
[0063] (1)體溫標(biāo)準(zhǔn)，體溫升高（彡40°C )(每日上午10點(diǎn)左右測(cè)定仔豬體溫一次），至 少持續(xù)3日；
[0064] (2)相對(duì)日增重標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)每頭豬的個(gè)體相對(duì)日增重計(jì)算每組豬的平均相對(duì)日增 重，并將各組的平均相對(duì)日增重與空白對(duì)照組的平均相對(duì)日增重進(jìn)行比較。當(dāng)平均相對(duì)日 增重顯著低于空白對(duì)照組（P〈〇. 05)時(shí)，判定該組所有豬有臨床癥狀，其中，按照以下公式 計(jì)算個(gè)體相對(duì)日增重：
[0065]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括：（1)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞， (2)將豬圓環(huán)病毒、豬肺炎支原體分別接種于培養(yǎng)好的動(dòng)物細(xì)胞上，以同時(shí)培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒 和豬肺炎支原體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法中動(dòng)物細(xì)胞為豬腎傳代 細(xì)胞系、非洲綠猴腎細(xì)胞系、猴胚胎腎上皮細(xì)胞系和豬睪丸細(xì)胞系中任一細(xì)胞系中的細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法中動(dòng)物細(xì)胞為PK15細(xì)胞、 PKK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、Marcl45細(xì)胞和ST細(xì)胞中的任一種，優(yōu)選為PK15細(xì)胞或PKK細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法中動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方式 為單層貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)或固定化培養(yǎng)，優(yōu)選為單層貼壁培養(yǎng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟（1)中培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用細(xì)胞培 養(yǎng)液培養(yǎng)，所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含5% (V/V)胎牛血清的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基、 DMHM培養(yǎng)基、RPMR1640培養(yǎng)基和199培養(yǎng)基中的任一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟（2)中將豬圓環(huán)病毒、豬肺炎 支原體分別同時(shí)接種于培養(yǎng)好的動(dòng)物細(xì)胞上；優(yōu)選地，所述步驟（2)中豬圓環(huán)病毒、豬肺炎 支原體分別按0.01-0. 〇5MOI、l%-10% (V/V)同時(shí)接種于培養(yǎng)好的動(dòng)物細(xì)胞上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟（2)中豬圓環(huán)病毒為豬圓環(huán) 病毒2型全病毒毒株，豬肺炎支原體為豬肺炎支原體全菌菌株；優(yōu)選地，所述步驟（2)中豬 圓環(huán)病毒為SH株、SD株、D株、WH株、LG株、ZJ/C株、ZJ/H株、DBN-SX07株和V201312株中 的任一毒株，豬肺炎支原體為HN0613株、P株、J株、168株、P-5722-3株、BQ14株、NJ株、 HDZK-Mhp57 株、AN306 株、DJ-166 株和 NM04/41259 株中的任一菌株。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟（2)中培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型 和豬肺炎支原體用細(xì)胞維持液培養(yǎng)，所述細(xì)胞維持液為含4% (V/V)犢牛血清和2mmol/l D_氨基葡萄糖鹽酸的培養(yǎng)基，或含1. 5% (V/V)胎牛血清的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng) 基、DMHM培養(yǎng)基、RPMR1640培養(yǎng)基和199培養(yǎng)基中的任一種。
9. 一種豬肺炎支原體的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括：（1)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì) 胞，（2)將豬肺炎支原體接種于動(dòng)物細(xì)胞上，以培養(yǎng)豬肺炎支原體。
10. -種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述培養(yǎng)方 法制備的豬圓環(huán)病毒抗原、免疫量的豬肺炎支原體抗原和/或獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK104250636SQ201410420796
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 王延輝, 王瑩, 田克恭 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司