一種半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系的構建與應用方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種海水經濟魚類半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系的建立方法，從而建立半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系，為研究半滑舌鰨性別分化和性別反轉調控機制提供基礎。本發(fā)明的構建方法是利用半滑舌鰨偽雄魚性腺組織成功建立了半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系，建立的細胞系可以連續(xù)傳代，經過這種方法所獲得的傳代細胞可傳60代以上，能提供大量的偽雄魚性腺細胞。可廣泛用于外源基因、質粒的轉染，性別相關基因功能的研究，也可用于魚類常見病毒的繁殖及病毒與細胞相互作用機制的研究，還可以進行環(huán)境污染物檢測等，具有重要的實際應用價值。
【專利說明】一種半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系的構建與應用方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于海水魚類細胞培養(yǎng)【技術領域】，具體涉及一種海水魚類半滑舌鰨 (Cynoglossus semilaevis)偽雄魚性腺組織細胞系的構建與應用方法。

【背景技術】
[0002] 半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis)是我國北方沿海經濟海水魚類，其雌雄個 體間存在明顯的生長速度差異，雌魚生長速度為雄魚的2?4倍。研究表明半滑舌鰨屬于 ZW/ZZ型性別決定機制，雌魚具有異型W染色體。此外，經研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨中存在自然性 逆轉現(xiàn)象，自然性逆轉魚的遺傳性別為雌性，而表現(xiàn)出的生理性別為雄性，其染色體為異型 (ZW型），被稱為偽雄魚。據(jù)檢測半滑舌鰨偽雄魚占總數(shù)的比例約為14%。性逆轉的偽雄魚 (ZW)與雌魚交配（ZW)會得到75 %的雌性個體和25 %的雄性個體，因此研究半滑舌鰨自然 性逆轉現(xiàn)象具有重要的經濟意義和理論研究價值。
[0003] 經組織學觀察發(fā)現(xiàn)偽雄魚性腺組織中有大量的精母細胞，細胞形態(tài)與正常雄魚的 一致，但數(shù)量比正常雄魚的略少。且偽雄魚精巢組織中除生殖細胞外，還有大量的體細胞。 生殖細胞和體細胞之間的相互作用在魚類早期的性別決定和精巢發(fā)育中起著重要作用。精 巢中serdoli細胞的主要作用是為生殖細胞提供支持、營養(yǎng)以及合成大量的類固醇激素來 調節(jié)精細胞的自我更新及發(fā)育分化為成熟的精子。
[0004] 半滑舌鰨偽雄魚性腺體細胞系能夠正常表達性腺特異功能基因，從而可應用于性 別相關基因的功能研究，對于研究魚類性別分化及性別決定具有重要的實際意義。此外半 滑舌鰨偽雄魚性腺體細胞系的建立對于研究生殖細胞與體細胞相互關系以及精原細胞分 化為成熟精子的調控機制具有重要的應用價值。性腺體細胞系還可廣泛應用到病毒學、免 疫學、基因組學、發(fā)育生物學及環(huán)境毒理學等研究領域。
[0005] 傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方法并不適合半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系的建立，例如酶消化 方法處理組織后獲得的細胞數(shù)量很少，無法啟動原代培養(yǎng)；而傳統(tǒng)組織塊法啟動原代培養(yǎng) 時，組織塊難于貼壁且培養(yǎng)瓶底部雜質太多細胞無法從組織塊中遷出。鲆鰈魚類性腺組織 細胞系的建立一直是魚類細胞培養(yǎng)中的難點，到目前為止半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系 仍未見報道。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種海水經濟魚類半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系的建立 方法，從而建立半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系，為研究半滑舌鰨性別分化和性腺成熟調 控機制提供基礎。
[0007] 本發(fā)明的半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系的構建，包括如下的步驟：
[0008] 1)在無菌條件下取下半滑舌鰨偽雄魚性腺組織，在培養(yǎng)液中將組織剪成小塊，將 組織塊用PBS溶液反復沖洗5次以上；
[0009] 所述培養(yǎng)液為5 % FBS-DMEM/F12完全培養(yǎng)液；
[0010] 2)離心去掉PBS溶液后，用DMEM/F12無血清培養(yǎng)基懸浮組織塊后，均勻接種到培 養(yǎng)瓶中，不添加培養(yǎng)液倒置于24°C生化培養(yǎng)箱中；
[0011] 3)然后補加專用培養(yǎng)液，并將細胞培養(yǎng)瓶正置，添加 DMEM/F12專用培養(yǎng)液。
[0012] 4)原代培養(yǎng)過程中每2天更換一半專用培養(yǎng)液，細胞長滿單層后進行傳代培養(yǎng)， 傳至60代完成偽雄魚性腺細胞系的構建。
[0013] 其中，專用培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清（FBS)、100IU/ml青霉素、lOOyg/ml鏈霉 素、30 μ g/ml鹽酸四環(huán)素、5?10ng/ml的人重組堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)、20? 40ng/ml的類胰島素樣細胞生長因子I (IGF-1)、80?100IU/ml人絨毛膜促性腺激素 (HCG)和10?20IU/ml孕馬血清促性腺激素（PMSG)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液。
[0014] 步驟1)的PBS溶液沖洗次數(shù)為5?7次；
[0015] 步驟2)的組織塊均勻接種后，將細胞培養(yǎng)瓶倒置放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使組織塊干 貼，倒置干貼的最適時間為6?8小時；
[0016] 步驟3)干貼結束后先補加培養(yǎng)液2?2. 5ml，再將培養(yǎng)瓶正置，正置過程需緩慢進 行，持續(xù)時間約1?3min，否則培養(yǎng)液容易沖擊組織塊，將組織塊沖掉；
[0017] 步驟4)的傳代培養(yǎng)，其步驟為：卵巢細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，向 每個培養(yǎng)瓶中加入〇. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化后；吸去胰蛋白酶溶液，每個培養(yǎng)瓶 中加入培養(yǎng)液，吹打培養(yǎng)瓶底鐘制成卵巢細胞懸液；取出卵巢細胞懸液，加入到新的培養(yǎng)孔 中，每個培養(yǎng)孔補加培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
[0018] 本發(fā)明的構建方法是利用半滑舌鰨偽雄魚性腺組織成功建立了半滑舌鰨偽雄魚 性腺細胞系，建立的細胞系可以連續(xù)傳代，經過這種方法所獲得的傳代細胞可傳60代以 上，能提供大量的偽雄魚性腺細胞。可廣泛用于外源基因、質粒的轉染，性別相關基因功能 的研究，也可用于魚類常見病毒的繁殖及病毒與細胞相互作用機制的研究，還可以進行環(huán) 境污染物檢測等，具有重要的實際應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1 :半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系細胞原代及傳代光鏡照片：
[0020] 其中：A，原代半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞長成單層；B，半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞第 15代；C，半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞第30代；D，半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞第60代。標尺= 100 μ m ；
[0021] 圖2 :半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系細胞生長曲線；
[0022] 圖3 :半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系核型分析；
[0023] 圖4 :半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系凍存與復蘇；
[0024] 圖5 :半滑舌鰨偽雄魚性腺組織生理性別鑒定；
[0025] 其中：A，建系所用半滑舌鰨偽雄魚性腺組織HE切片（40倍）；B，建系所用半滑舌 鰨偽雄魚性腺組織HE切片（100倍）。標尺=100 μ m。
[0026] 圖6 :半滑舌觸偽雄魚性腺細胞系細胞遺傳性別鑒定；
[0027] 其中0V為卵巢，TE為精巢，pmGO為偽雄魚性腺，pmCSG為偽雄魚性腺細胞系。
[0028] 圖7 :半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系細胞轉染pEGFP-N3質粒的光鏡及熒光照片；
[0029] 其中，A，轉染pEGFP-N3質粒后性腺細胞光鏡照片；B，同一視野下轉染pEGFP-N3質 粒后細胞熒光照片。
[0030] 圖8 :半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系細胞轉染帶有cy3熒光標記的siRNA后光鏡及 熒光照片；
[0031] A，轉染siRNA后性腺細胞光鏡照片；D，同一視野下轉染siRNA后細胞熒光照片。
[0032] 圖9 :半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系細胞功能基因的表達分析。

【具體實施方式】
[0033] 由于半滑舌鰨偽雄魚性腺組織在生理結構和生長代謝上存在一定特殊性，已有的 細胞培養(yǎng)添加物和原代培養(yǎng)方法無法啟動細胞原代培養(yǎng)并進行傳代。因此 申請人:在長期研 究該細胞生長規(guī)律的基礎上對培養(yǎng)液添加物進行了優(yōu)化，對組織塊培養(yǎng)法進行了改進，從 而獲得了本發(fā)明。
[0034] 本發(fā)明構建方法的總體步驟如下：
[0035] 1.健康半滑舌鰨在70%乙醇中消毒1分鐘，無菌超凈臺中取下偽雄魚性腺組織， 剝離組織最外層膜，在5% FBS-DMEM/F12完全培養(yǎng)液中將組織剪成1mm3的小塊，PBS沖洗 5?7遍，性腺組織中粘液及雜質較多，如果清洗不干凈則不利于組織塊貼壁及細胞遷出。 用lml不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮組織塊，（如果添加血清不利于組織塊貼壁），接種 到25cm 2細胞培養(yǎng)瓶中，倒置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0036] 2. 6?8小時后補加專用培養(yǎng)液2?2. 5ml，并緩慢將細胞培養(yǎng)瓶正置，48小時后 補加專用培養(yǎng)液lml，此后每2天更換一半培養(yǎng)液。細胞長成單層后用胰酶消化法傳代培 養(yǎng)，傳代至60代以上完成了半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系的構建。
[0037] 3.偽雄魚性腺細胞系專用培養(yǎng)液的配制：取DMEM/F12培養(yǎng)基粉末三蒸水溶解后 調pH值為7. 0,用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌備用；取80ml配好的DMEM/F12液體培養(yǎng) 基，加入胎牛血清20ml、10000IU青霉素、10mg鏈霉素、1?5mg鹽酸四環(huán)素、1?2μ g的人 重組堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)、l?2yg的類胰島素樣細胞生長因子I (IGF-1)、 8000?10000IU人絨毛膜促性腺激素（HCG)和1000?2000IU孕馬血清促性腺激素即為本 發(fā)明的偽雄魚性腺細胞專用培養(yǎng)液。
[0038] 4、半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞的繼代培養(yǎng)：待偽雄魚性腺細胞長成單層后，吸出培 養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，向每個培養(yǎng)瓶中加入lml濃度為0. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化0. 5? 1. 5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)瓶中加入2毫升的上述專用培養(yǎng)液，用移液器吹打培 養(yǎng)瓶底1?3分鐘制成偽雄魚性腺細胞懸液；從培養(yǎng)瓶中取出1毫升偽雄魚性腺細胞懸液， 加入到新的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶補加上述專用培養(yǎng)液2毫升，使之最終體積至3毫升；待 偽雄魚性腺細胞再次長成單層后，仍以上述方法進行傳代培養(yǎng)。
[0039] 實施例1
[0040] 健康半滑舌鰨在70%乙醇中消毒1分鐘，無菌超凈臺中取下偽雄魚性腺組織，剝 離偽雄魚性腺組織最外層膜，在5% FBS-DMEM/F12完全培養(yǎng)液中將組織剪成1mm3的小塊， PBS沖洗5遍，用lml不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮組織塊，均勻接種到25cm2細胞培養(yǎng) 瓶中，倒置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0041] 配制100ml專用培養(yǎng)液，取DMEM/F12液體培養(yǎng)基80ml，加入胎牛血清20ml， 10000IU青霉素、10mg鏈霉素、lmg鹽酸四環(huán)素、0. 5 μ g的人重組堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、2μ g的類胰島素樣細胞生長因子I (IGF-1)、1000IU人絨毛膜促性腺激素（HCG)和 8000IU孕馬血清促性腺激素（PMSG)。
[0042] 6小時后，添加 2ml專用培養(yǎng)液，并將細胞培養(yǎng)瓶以1分鐘/每瓶的速度正置過 來，平放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0043] 待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，向每個培養(yǎng)瓶中加入1ml濃度為 〇. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化0. 5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)瓶中加入2毫升的 上述專用培養(yǎng)液，用移液器吹打培養(yǎng)瓶底2分鐘制成偽雄魚性腺細胞懸液；從培養(yǎng)瓶中取 出1毫升偽雄魚性腺細胞懸液，加入到新的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶補加上述專用培養(yǎng)液2毫 升，使之最終體積至3毫升；待偽雄魚性腺細胞再次長成單層后，仍以上述相同方法進行傳 代培養(yǎng)。
[0044] 實施例2
[0045] 健康半滑舌鰨在70%乙醇中消毒1分鐘，無菌超凈臺中取下偽雄魚性腺組織，剝 離偽雄魚性腺組織最外層膜，在5% FBS-DMEM/F12完全培養(yǎng)液中將組織剪成1mm3的小塊， PBS沖洗6遍，用lml不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮組織塊，均勻接種到25cm2細胞培養(yǎng) 瓶中，倒置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0046] 配制100ml專用培養(yǎng)液，取DMEM/F12液體培養(yǎng)基80ml，加入胎牛血清20ml， 10000IU青霉素、10mg鏈霉素、3mg鹽酸四環(huán)素、0. 8 μ g的人重組堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、3 μ g的類胰島素樣細胞生長因子I (IGF-1)、1500IU人絨毛膜促性腺激素（HCG)和 9000IU孕馬血清促性腺激素（PMSG)。
[0047] 7小時后，添加 2ml專用培養(yǎng)液，并將細胞培養(yǎng)瓶以2分鐘/每瓶的速度正置過 來，平放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0048] 待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，向每個培養(yǎng)瓶中加入lml濃度為 〇. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化1分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)瓶中加入2毫升的上 述專用培養(yǎng)液，用移液器吹打培養(yǎng)瓶底3分鐘制成偽雄魚性腺細胞懸液；從培養(yǎng)瓶中取出1 毫升偽雄魚性腺細胞懸液，加入到新的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶補加上述專用培養(yǎng)液2毫升， 使之最終體積至3毫升；待偽雄魚性腺細胞再次長成單層后，仍以上述相同方法進行傳代 培養(yǎng)。
[0049] 實施例2建立的半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系傳至76代，生長分裂依然很旺盛（如 圖1、2所示）；染色體雖然出現(xiàn)了非整倍體和異倍體，但具有正常的二倍體核型的細胞占 50%，并且具有一條典型的雌性特有的W染色體（如圖3所示）；細胞每2?3天傳代一次， 凍存復蘇后形態(tài)活性基本不變（如圖4所示）；細胞系原代培養(yǎng)啟動所用的性腺組織在生 理性別上為雄性，遺傳性別上為雌性（如圖5,6所示）；細胞系轉染pEGFP-N3質粒的效率 可達30%，轉染小RNA的效率可達90%以上（如圖7, 8所示）；可正常表達偽雄魚性腺組 織的sox9a等功能基因（如圖9所不）。
[0050] 實施例3
[0051] 健康半滑舌鰨在70%乙醇中消毒1分鐘，無菌超凈臺中取下偽雄魚性腺組織，剝 離偽雄魚性腺組織最外層膜，在5% FBS-DMEM/F12完全培養(yǎng)液中將組織剪成1mm3的小塊， PBS沖洗7遍，用lml不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮組織塊，均勻接種到25cm2細胞培養(yǎng) 瓶中，倒置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0052] 配制100ml專用培養(yǎng)液，取DMEM/F121液體培養(yǎng)基80ml，加入胎牛血清20ml， 10000IU青霉素、10mg鏈霉素、5mg鹽酸四環(huán)素、1 μ g的人重組堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、4 μ g的類胰島素樣細胞生長因子I (IGF-1)、10000IU人絨毛膜促性腺激素（HCG) 和2000IU孕馬血清促性腺激素（PMSG)。
[0053] 8小時后，添加 2ml專用培養(yǎng)液，并將細胞培養(yǎng)瓶以3分鐘/每瓶的速度正置過 來，平放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0054] 待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，向每個培養(yǎng)瓶中加入1ml濃度為 〇. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化1. 5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)瓶中加入2毫升的 上述專用培養(yǎng)液，用移液器吹打培養(yǎng)瓶底4分鐘制成偽雄魚性腺細胞懸液；從培養(yǎng)瓶中取 出1毫升偽雄魚性腺細胞懸液，加入到新的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶補加上述專用培養(yǎng)液2毫 升，使之最終體積至3毫升；待偽雄魚性腺細胞再次長成單層后，仍以上述相同方法進行傳 代培養(yǎng)。
[0055] 本研究細胞專用培養(yǎng)液中鹽酸四環(huán)素能夠有效保證半滑舌鰨偽雄魚性的增殖能 力，且能夠補充青鏈霉素對微生物的抗性缺失部分。經過實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中缺少其中任何 一種生長因子時細胞生長速度均減慢，尤其是PMSG能極大的促進細胞增殖分裂。且DMEM/ F12培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富，比MEM、L15培養(yǎng)基更適合性腺細胞生長。
[0056] 構建的半滑舌鰨偽雄魚性腺細胞系，對于外源質粒和siRNA的轉染效率較高，可 廣泛用于外源基因、質粒的轉染，應用于RNA干擾技術中，對于研究性別相關功能基因和性 反轉重要功能基因具有重要意義，此外也可用于魚類常見病毒的繁殖及病毒與細胞相互作 用機制的研究，還可進行環(huán)境污染物檢測等，具有重要的實際應用價值。
【權利要求】
1. 一種半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系的構建方法，其特征在于，所述的方法包括如 下的步驟： 1) 在無菌條件下取下半滑舌鰨偽雄魚性腺組織，在培養(yǎng)液中將組織剪成小塊，將組織 塊用PBS溶液反復沖洗5次以上； 2) 離心去掉PBS溶液后，用DMEM/F12無血清培養(yǎng)基懸浮組織塊后，均勻接種到培養(yǎng)瓶 中，不添加培養(yǎng)液倒置于24°C生化培養(yǎng)箱中； 3) 干貼結束后補加專用培養(yǎng)液，并將細胞培養(yǎng)瓶正置； 4) 原代培養(yǎng)過程中每2天更換一半專用培養(yǎng)液，細胞長滿單層后進行傳代培養(yǎng)，傳至 60代完成偽雄魚性腺組織細胞系的構建。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟1)中的培養(yǎng)液為5% FBS-DMEM/ F12完全培養(yǎng)液。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟1)的PBS溶液沖洗次數(shù)為5?7 次。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2)中的專用培養(yǎng)液為含有20% 胎牛血清FBS、100IU/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、5?10ng/ml的人重組堿性成纖維細胞 生長因子bFGF、20?40ng/ml的類胰島素樣細胞生長因子I (IGF-1)、80?100IU/ml人絨 毛膜促性腺激素 HCG和10?20IU/ml孕馬血清促性腺激素 PMSG的DMEM/F12完全培養(yǎng)液。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2)的組織塊均勻接種后，將細胞 培養(yǎng)瓶倒置放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使組織塊干貼，倒置干貼時間為6?8小時。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)干貼結束后先補加培養(yǎng)液2? 2. 5ml，再將培養(yǎng)瓶正置，正置過程需緩慢進行，持續(xù)時間1?3min。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟4)的傳代培養(yǎng)，其步驟如下：卵 巢細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，向每個培養(yǎng)瓶中加入〇. 25%的胰蛋白酶溶液， 靜置消化后；吸去胰蛋白酶溶液，每個培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液，吹打培養(yǎng)瓶底鐘制成卵巢細胞 懸液；取出卵巢細胞懸液，加入到新的培養(yǎng)孔中，每個培養(yǎng)孔補加培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
8. -種半滑舌鰨偽雄魚性腺組織細胞系，其特征在于，所述的細胞系是由權利要求1 所述的方法構建的。
【文檔編號】C12N5/071GK104152402SQ201410422656
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權日:2014年8月26日
【發(fā)明者】孫愛, 陳松林, 沙珍霞, 王娜 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所