多色高危hpv熒光檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了多色高危HPV熒光檢測試劑盒，包括熱啟動Taq酶系統(tǒng)、通用引物、熒光探針、陰性對照和陽性對照，熒光探針為HPV特異性MGB探針。本發(fā)明的試劑盒適用于定性檢測宮頸脫落細(xì)胞和生殖泌尿道分泌物樣本中18種可引起宮頸癌的高風(fēng)險HPV基因型。本試劑盒應(yīng)用多重?zé)晒釶CR技術(shù)實現(xiàn)了在同一管擴(kuò)增體系中檢測18種HPV基因型，同時本試劑盒在同時檢測15種常見高風(fēng)險HPV基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）時，還可檢測三種少見高風(fēng)險HPV基因型（26、53、73）。本發(fā)明的檢測試劑盒，檢測通量高，大大降低了篩查成本。
【專利說明】多色高危HPV熒光檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種HPV熒光檢測試劑盒，特別涉及一種多色高危HPV熒光檢測試劑 盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。原位癌高發(fā)年齡為30?35歲，浸潤癌為45? 55歲，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢。宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療是有效治療宮頸癌的關(guān)鍵。
[0003] 現(xiàn)有研究表明，宮頸癌的主要病因是由高危型人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染或反復(fù)感染所致。90%以上的宮頸癌伴有高危型HPV感 染，高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要危險因素。因此，HPV DNA檢測在世界范圍內(nèi)多個 國家已經(jīng)成為宮頸癌篩查和健康管理的一個重要部分。人乳頭瘤病毒有多種基因型，依據(jù) 不同型別與宮頸癌發(fā)生危險性的高低可將其分為低危型和中高危型HPV。HPV DNA檢測的 主要意義在于：1)基于液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果決定患者是否需要進(jìn)一步進(jìn)行陰道鏡檢查；2)液基 細(xì)胞學(xué)異常而陰道鏡檢或活檢陰性患者隨訪；3)高級別宮頸上皮內(nèi)病變患者臨床處理后治 療結(jié)果預(yù)測；4)年齡> 30歲女性聯(lián)合巴氏涂片針對宮頸癌早期篩查。
[0004] 現(xiàn)有的運用熒光PCR方法進(jìn)行高危型人乳頭瘤病毒基因分型檢測的技術(shù)的缺點 主要是擴(kuò)增靈敏度低，耗時長。前期一般都需要經(jīng)過步驟繁瑣的核酸提取，然后運用普通 Taqman探針的方法進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，而且一般都是FAM和HEX兩通道檢測，無法具體分區(qū) 高危HPV型別，難以滿足實際使用的需要。
[0005] 開發(fā)出可以快速、高效的HPV高危型檢測試劑盒，具有非常實際的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種多色高危HPV熒光檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 多色高危HPV熒光檢測試劑盒，包括熱啟動Taq酶系統(tǒng)、通用引物、熒光探針、陰性對照 和陽性對照，熒光探針為HPV特異性MGB探針，HPV特異性MGB探針的序列如下： 探針 1 TTGGCATAATCAATTAITT 探針 2 TGGGGCAATCAGTTRTTTGT 探針 3 CTGATTGTTCCARCARATG 探針 4 AATCAGTTGTTTGTTACTGT 探針 5 TTTRTTACCTGTGTTGATAC 探針 6 TAACTGTTGTGGATACCAC 探針 7 TATATGTTGGCACAATCAA 探針 8 TGGTTACCCCAACAAATG 探針 9 TAATTGATTATGCCAGCAAACA 探針 10 TTACCTGTGTTGATACYAC 探針 11 CTGATTGCCCCAACAAAT 探針 12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA 探針 13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA 探針 14 ACTACAGTAACAAAYAATTG 探針 15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC 探針 16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC 探針 17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG 探針 18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC ； 上述探針的3'端連接有MGB，5'端連接有熒光基團(tuán)，其中，三色高危HPV熒光檢測試劑 盒探針1?15分別用于檢測15種常見高風(fēng)險HPV基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59、66、68、82 ;探針16?18分別用于檢測三種少見高風(fēng)險HPV基因型26、53、73。四 色高危HPV熒光檢測試劑盒探針1用于檢測常見高風(fēng)險HPV基因型16型；探針2用于檢測 常見高風(fēng)險HPV基因型18型；探針3?18分別用于檢測另外13種常見高風(fēng)險HPV基因型 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82 和三種少見高風(fēng)險 HPV 基因型 26、53、73。
[0008] 優(yōu)選的，上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的通用引物為： 引物 1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG 引物 2 GCTCAGGGITTAAACAATGG 引物 3 GCCCAGGGCCACAATAATGG 引物 4 GCNCAGGGNCACAATAATGG 引物 5 GCNCAGGGNCATAACAATGG 引物 6 GCNCAGGGNCATAATAATGG 引物 7 CGTCCMARRGGAWACTGATC 引物 8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 引物 9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA 引物 10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC ; 引物中的N指肌苷。
[0009] 優(yōu)選的，上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒設(shè)有內(nèi)標(biāo)引物及內(nèi)標(biāo)探針，內(nèi)標(biāo)引物 如下： 引物 11 CAACTTCATCCACGTTCACC 引物 12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 內(nèi)標(biāo)探針的序列如下： 探針 19，TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC。
[0010] 優(yōu)選的，上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的熱啟動Taq酶系統(tǒng)中添加 有UDG酶。
[0011] 優(yōu)選的，上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的熱啟動Taq酶系統(tǒng)含有經(jīng) 過化學(xué)修飾的熱啟動Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份體系中熱啟動Taq酶為5U，dNTPs 為 0· 2mmol/L，UDG 酶為 0· 3U。
[0012] 優(yōu)選的，上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒還設(shè)有DNA提取液，DNA提取液的組成 為EDTA的濃度為0. 25mol/L、乙酸鈉的濃度為25mmol/L和DTT的濃度為lmmol/L。
[0013] 優(yōu)選的，上述三色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的探針16?18連接的熒光 基團(tuán)不同于探針1?15連接的熒光基團(tuán)。
[0014] 優(yōu)選的，上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒為三色高危HPV熒光檢測試劑盒，其中 所使用的內(nèi)標(biāo)探針上連接的熒光基團(tuán)不同于探針1?18的。
[0015] 優(yōu)選的，上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒為四色高危HPV熒光檢測試劑盒，其中 所使用的探針1連接的熒光基團(tuán)不同于探針2, 3?18連接的熒光基團(tuán)。
[0016] 優(yōu)選的，上述四色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的探針2連接的熒光基團(tuán)不 同于探針1，3?18連接的熒光基團(tuán)。
[0017] 優(yōu)選的，上述四色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的內(nèi)標(biāo)探針上連接的熒光基 團(tuán)不同于探針1?18的。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的試劑盒適用于定性檢測宮頸脫落細(xì)胞和生殖泌尿道分泌物樣本中18種可引 起宮頸癌的高風(fēng)險HPV基因型。本發(fā)明應(yīng)用多重?zé)晒釶CR技術(shù)實現(xiàn)了在同一管擴(kuò)增體系中 檢測18種HPV基因型，同時三色高危HPV熒光檢測試劑盒在同時檢測15種常見高風(fēng)險HPV 基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)時，還可檢測三種少見高風(fēng)險 HPV基因型（26、53、73)。四色高危即￥熒光檢測試劑盒在同時檢測13種常見高風(fēng)險即￥ 基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)和三種少見高風(fēng)險冊￥基因型（26、 53、73)，同時還能具體分型高風(fēng)險HPV基因型16型和18型，本發(fā)明的檢測試劑盒，檢測通 量高，大大降低了篩查成本。
[0019] 通過加入m)G酶防污染，使得本發(fā)明試劑盒的靈敏度更高，最低檢出量為1.0E+03 拷貝/反應(yīng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1?6是本試劑盒檢測范圍內(nèi)的檢測結(jié)果示意圖。

【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0022] 三色高危HPV熒光檢測試劑盒，包括DNA提取液、熱啟動Taq酶系統(tǒng)、通用引物、熒 光探針、陰性對照和陽性對照，熒光探針為HPV特異性MGB探針，HPV特異性MGB探針的序 列如下： 探針 1 TTGGCATAATCAATTATTT (SEQ ID N0:1) 探針 2 TGGGGCAATCAGTTRTTTGT (SEQ ID N0:2) 探針 3 CTGATTGTTCCARCARATG (SEQ ID N0:3) 探針 4 AATCAGTTGTTTGTTACTGT (SEQ ID N0:4) 探針 5 TTTRTTACCTGTGTTGATAC (SEQ ID N0:5) 探針 6 TAACTGTTGTGGATACCAC (SEQ ID N0:6) 探針 7 TATATGTTGGCACAATCAA (SEQ ID N0:7) 探針 8 TGGTTACCCCAACAAATG (SEQ ID NO ：8) 探針 9 TAATTGATTATGCCAGCAAACA (SEQ ID NO ：9) 探針 10 TTACCTGTGTTGATACYAC (SEQ ID NO： 10) 探針 11 CTGATTGCCCCAACAAAT (SEQ ID NO： 11) 探針 12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA (SEQ ID NO： 12) 探針 13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA (SEQ ID NO： 13) 探針 14 ACTACAGTAACAAAYAATTG (SEQ ID NO： 14) 探針 15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC (SEQ ID NO： 15) 探針 16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC (SEQ ID NO： 16) 探針 17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG (SEQ ID NO： 17) 探針 18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC (SEQ ID NO： 18)； 上述探針的3'端連接有MGB，5'端連接有熒光基團(tuán)，其中，探針1?15連接的熒光基 團(tuán)為FAM，探針16?18連接的熒光基團(tuán)為R0X。
[0023] 四色高危HPV熒光檢測試劑盒，包括DNA提取液、熱啟動Taq酶系統(tǒng)、通用引物、熒 光探針、陰性對照和陽性對照，熒光探針為HPV特異性MGB探針，HPV特異性MGB探針的序 列如下： 探針 1 TTGGCATAATCAATTATTT (SEQ ID N0:1) 探針 2 TGGGGCAATCAGTTRTTTGT (SEQ ID N0:2) 探針 3 CTGATTGTTCCARCARATG (SEQ ID N0:3) 探針 4 AATCAGTTGTTTGTTACTGT (SEQ ID N0:4) 探針 5 TTTRTTACCTGTGTTGATAC (SEQ ID N0:5) 探針 6 TAACTGTTGTGGATACCAC (SEQ ID N0:6) 探針 7 TATATGTTGGCACAATCAA (SEQ ID N0:7) 探針 8 TGGTTACCCCAACAAATG (SEQ ID N0:8) 探針 9 TAATTGATTATGCCAGCAAACA (SEQ ID NO ：9) 探針 10 TTACCTGTGTTGATACYAC (SEQ ID NO :10) 探針 11 CTGATTGCCCCAACAAAT (SEQ ID NO :11) 探針 12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA (SEQ ID NO :12) 探針 13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA (SEQ ID NO :13) 探針 14 ACTACAGTAACAAAYAATTG (SEQ ID NO :14) 探針 15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC (SEQ ID NO :15) 探針 16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC (SEQ ID NO :16) 探針 17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG (SEQ ID NO :17) 探針 18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC (SEQ ID NO :18); 上述探針1?18的3'端連接有MGB，5'端連接有熒光基團(tuán)，其中，探針1連接的熒光 基團(tuán)為HEX，探針2連接的熒光基團(tuán)為R0X，3?18連接的熒光基團(tuán)為FAM。
[0024] 上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的通用引物為： 引物 1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG (SEQ ID N0:19) 引物 2 GCTCAGGGTTTAAACAATGG (SEQ ID N0:20) 引物 3 GCCCAGGGCCACAATAATGG (SEQ ID N0:21) 引物 4 GCNCAGGGNCACAATAATGG (SEQ ID N0:22) 引物 5 GCNCAGGGNCATAACAATGG (SEQ ID N0:23) 引物 6 GCNCAGGGNCATAATAATGG (SEQ ID N0:24) 引物 7 CGTCCMARRGGAWACTGATC (SEQ ID N0:25) 引物 8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC (SEQ ID N0:26) 引物 9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA (SEQ ID N0:27) 引物 10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC (SEQ ID N0:28); 引物中的N指肌苷，可與A、T、C、G中的任一種配對。
[0025] 上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒設(shè)有內(nèi)標(biāo)引物及內(nèi)標(biāo)探針，內(nèi)標(biāo)引物如下： 引物 11 CAACTTCATCCACGTTCACC (SEQ ID N0:29) 引物 12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC (SEQ ID N0:30) 內(nèi)標(biāo)探針的序列如下： 探針 19，TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC (SEQ ID N0:31)，三色高危 HPV 熒光檢測試劑 盒探針的5'端連接熒光基團(tuán)HEX，3'端連接有MGB ;四色高危HPV熒光檢測試劑盒探針的 5'端連接熒光基團(tuán)CY5,3'端連接有MGB。
[0026] 上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的熱啟動Taq酶系統(tǒng)含有經(jīng)過化學(xué) 修飾的熱啟動Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份體系中熱啟動Taq酶為5U，dNTPs為 0· 2mmol/L，UDG 酶為 0· 3U。
[0027] 上述多色高危HPV熒光檢測試劑盒中所使用的DNA提取液的組成為EDTA的濃度 為0. 25mol/L、乙酸鈉的濃度為25mmol/L和DTT的濃度為lmmol/L，120〇μ1 /管。
[0028] 陰性質(zhì)控品：滅菌純化水，ιοομ? /管； HPV陽性質(zhì)控品：HPV-18型樣本，10〇μ1 /管。
[0029] 檢測操作如下： 1.樣本處理與DNA提取 1.1向?qū)m頸刷保存管中加入2ml滅菌生理鹽水(務(wù)必使拭子頭完全浸入液體中)，震蕩 60秒(使細(xì)胞充分落入液體，滅菌生理鹽水變渾濁)，將全部洗滌液轉(zhuǎn)至相應(yīng)編號的2ml離 心管； 1. 2編好號的樣品10, OOOrpm離心3分鐘，棄上清； 1. 3樣品沉淀中加入lml滅菌生理鹽水，洗漆沉淀，10, OOOrpm離心3分鐘，棄上清； 1. 4樣品沉淀中加入5〇μ1病毒提取液，震蕩60秒，充分懸浮細(xì)胞沉淀，備用。
[0030] DNA的提取也可以使用其他公知的方法進(jìn)行。
[0031] 2.質(zhì)控品處理 取裝有HPV陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品的離心管，10, OOOrpm離心30秒，然后按1. 3?1. 4 的提取步驟操作。
[0032] 3.核酸擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū)，冰上操作） 1) 從試劑盒中取出HR HPV PCR反應(yīng)管，瞬時離心備用； 2) 往上述反應(yīng)管中分別加入提取后的待測樣本核酸2〇μ1 (如樣本不足2〇μ1，請用滅菌 純化水補足2〇μ1后加樣)、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品各2〇μ1。蓋緊管蓋，5000rpm離心30秒 后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測區(qū)。
[0033] 4. PCR 擴(kuò)增 PCR參數(shù)為： 50〇C,3 min ；95〇C,5min ； 95°C，5 s，58°C，31 s，循環(huán) 45 次。
[0034] 在58°C時測定熒光值。
[0035] 根據(jù)熒光值變化曲線，確定檢測結(jié)果。
[0036] 質(zhì)量控制

【權(quán)利要求】
1. 多色高危HPV熒光檢測試劑盒，包括熱啟動Taq酶系統(tǒng)、通用引物、熒光探針、陰性對 照和陽性對照，其特征在于：所述熒光探針為HPV特異性MGB探針，HPV特異性MGB探針的 序列如下： 探針 1 TTGGCATAATCAATTAITT 探針 2 TGGGGCAATCAGTTRTTTGT 探針 3 CTGATTGTTCCARCARATG 探針 4 AATCAGTTGTTTGTTACTGT 探針 5 TTTRTTACCTGTGTTGATAC 探針 6 TAACTGTTGTGGATACCAC 探針 7 TATATGTTGGCACAATCAA 探針 8 TGGTTACCCCAACAAATG 探針 9 TAATTGATTATGCCAGCAAACA 探針 10 TTACCTGTGTTGATACYAC 探針 11 CTGATTGCCCCAACAAAT 探針 12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA 探針 13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA 探針 14 ACTACAGTAACAAAYAATTG 探針 15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC 探針 16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC 探針 17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG 探針 18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC ; 上述探針的3'端連接有MGB，5'端連接有熒光基團(tuán)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多色高危HPV熒光檢測試劑盒，其特征在于：所述通用引物 為： 引物 1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG 引物 2 GCTCAGGGITTAAACAATGG 引物 3 GCCCAGGGCCACAATAATGG 引物 4 GCNCAGGGNCACAATAATGG 引物 5 GCNCAGGGNCATAACAATGG 引物 6 GCNCAGGGNCATAATAATGG 引物 7 CGTCCMARRGGAWACTGATC 引物 8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 引物 9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA 引物 10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC ; 引物中的N指肌苷。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多色高危HPV熒光檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑 盒設(shè)有內(nèi)標(biāo)引物及內(nèi)標(biāo)探針，內(nèi)標(biāo)引物如下： 引物 11 CAACTTCATCCACGTTCACC 引物 12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 內(nèi)標(biāo)探針的序列如下： 探針 19 TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多色高危HPV熒光檢測試劑盒，其特征在于：所述熱啟 動Taq酶系統(tǒng)中添加有UDG酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多色高危HPV熒光檢測試劑盒，其特征在于：所述試 劑盒還設(shè)有DNA提取液，DNA提取液的組成為EDTA的濃度為0. 25mol/L、乙酸鈉的濃度為 25mmol/L 和 DTT 的濃度為 lmmol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多色高危HPV熒光檢測試劑盒，其特征在于：所述熱啟動Taq 酶系統(tǒng)含有經(jīng)過化學(xué)修飾的熱啟動Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份體系中熱啟動Taq 酶為 5U，dNTPs 為 0· 2mmol/L，UDG 酶為 0· 3U。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或6所述的多色高危HPV熒光檢測試劑盒，其特征在于：所述多 色高危HPV熒光檢測試劑盒為三色高危HPV熒光檢測試劑盒，其探針16?18連接的熒光 基團(tuán)不同于探針1?15連接的熒光基團(tuán)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或6所述的多色高危HPV熒光檢測試劑盒，其特征在于：所述多 色高危HPV熒光檢測試劑盒為四色高危HPV熒光檢測試劑盒，其探針1?2連接的熒光基 團(tuán)不同于探針3?18連接的熒光基團(tuán)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多色高危HPV熒光檢測試劑盒，其特征在于：內(nèi)標(biāo)探針連接 的熒光基團(tuán)不同于探針1?18連接的熒光基團(tuán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195247SQ201410431759
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】陳華云, 肖湘文, 丁渭, 劉淑園, 陳嘉昌, 方鳳銀, 趙麗 申請人:廣州和實生物技術(shù)有限公司