一種產(chǎn)β-1,4葡聚糖酶的Providencia vermicola菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種普羅維登斯菌屬(Providencia vermicola)6G菌株，于2013年8月8日將其保藏于湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心〔CCTCC〕，編號為：CCTCC NO:M2013364。本發(fā)明還公開了該菌株在發(fā)酵生產(chǎn)羧甲基纖維素酶以及制備降解纖維素的生物酶制劑上的應用前景。該菌株在最佳產(chǎn)酶條件下酶活可達0.15U/ml菌液。該酶在較廣泛pH范圍內呈現(xiàn)β-1,4葡聚糖酶酶活，且主要呈現(xiàn)堿性纖維素酶活力。酸性CMC酶的最適作用pH為6.0，堿性CMC酶的最適作用pH為8.5。酸性CMC酶活力約為堿性CMC酶活力的75％。
CCTCC NO: M2013364
2013.08.08
【專利說明】-種產(chǎn)β _1,4葡聚糖酶的Prov i dene i a verm i co I a菌株

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，特別涉及從牛糞堆肥樣品中篩選、分離、純化、得 到的能產(chǎn) β _1，4 葡聚糖酶的 Providencia vermicola6G。 技術背景
[0002] 木質纖維素是自然界儲量豐富的可再生的有機化合物資源，主要由纖維素、半纖 維素和木質素三大類組分構成，同時還可能含有少量的果膠、幾丁質、硅酸鹽等成分。纖 維素是木質纖維中含量最高的組分，通常占總重量的35-45%，為一類由葡萄糖分子通過 β_1，4糖苷鍵連接形成的線狀多聚葡萄糖。這一結構與通過α-1，4糖苷鍵連接形成葡聚 糖分子的淀粉類物質不同，因此不受淀粉水解酶類的水解。
[0003] 當前，全球社會面臨著化石燃料日趨枯竭、環(huán)境污染嚴重的危機，使新的清潔能源 的開發(fā)利用成為一種迫切需求。木質纖維素可以通過一系列理化和生物的處理流程，轉化 為清潔的乙醇、丁醇等清潔生物燃料，且可以再生的優(yōu)質資源。有望有效地緩解化石燃料枯 竭帶來的能源短缺。
[0004] 不過，由于纖維素的構成單元為葡萄糖，挖掘在溫和條件下將其水解的生物酶制 齊IJ，無論是對該資源的開發(fā)，還是對纖維素加工產(chǎn)業(yè)（紡織、造紙等）的技術改進，都具有重 要的意義。經(jīng)多年的研究發(fā)現(xiàn)，按作用的最適pH條件劃分，纖維素水解酶通?？煞譃樗嵝?纖維素酶和堿性纖維素酶。
[0005] 酸性纖維素酶指作用的最佳pH條件在酸性范圍的一類纖維素水解酶，目前發(fā) 現(xiàn)的主要由一些絲狀真菌，如木霉、根霉等微生物產(chǎn)生，通常含有三種酶活力組分：1、 內切葡聚糖酶（endoglucanase)，即內切-β -1，4 葡聚糖酶（endo- β -1，4-glucanase， EC3. 2. 1.4)，簡稱內切酶（EG或BGL) ;2、外切葡聚糖酶，包括兩類酶，一是β-Μ-D-葡萄 糖-葡萄糖水解酶（EC3. 2. 1. 74)，也稱纖維糊精酶。二是β -1，4-D-葡聚糖-纖維二糖水解 酶，又稱外切-1，4-葡聚糖酶（exo-β -1，4一glucanase，EC3. 2. 1. 91)或纖維二糖水解 酶（cellobiohydrolase，CBH)，簡稱外切酶；3、β _1，4_ 葡萄糖昔酶（β _1，4-glucosidase, EC3. 2. 1. 21)或β -葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，簡稱β -葡萄糖苷酶（β -glucosidase， β-G)或纖維二糖酶（Cell〇biaSe，CB)等。這類纖維素酶通常能夠將纖維素完全水解成游 離的葡萄糖分子，因此也稱為纖維素水解完全酶，現(xiàn)主要用于纖維素資源開發(fā)研究、飼料工 業(yè)，以及紡織工業(yè)對棉料的表面處理。
[0006] 堿性纖維素酶則指在堿性條件下能夠催化裂解纖維素分子的一類水解酶，最早在 上世紀70年代由日本科學家在嗜堿性的芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)。目前的研究表明，該類纖維素酶 一般只有纖維素內切酶，BP內切-β -1，4葡聚糖酶（endo-β -1，4-glucanase，EC3. 2. 1. 4， 簡稱內切酶，EG或BGL)的活性，活力用羧甲基纖維素（CMC)為底物測定，因此，也稱為羧 甲基纖維素酶（CMCase)。其活性通常以CMC活性單位表示。由于堿性纖維素酶的作用pH 在堿性范圍內，與紡織物洗滌條件比較一致，能夠在溫和條件下作用于污漬附著的位點，卻 不會對衣物造成損害，所以，該酶類產(chǎn)品目前主要用于洗滌工業(yè)，為加酶洗滌產(chǎn)品的必需原 料。至今為止，能夠產(chǎn)生堿性纖維素酶的微生物多為細菌菌株，包括芽孢梭菌屬、纖維單胞 菌屬、纖維弧菌屬、混合纖維弧菌、芽孢桿菌屬等的一些菌種，以及牛黃瘤胃梭菌、白色瘤胃 球菌、溶纖維菌，熱纖梭菌、解纖維梭菌、糞堿纖維單胞菌等菌種，國外該類酶的工業(yè)化生產(chǎn) 主要以芽孢桿菌屬的菌株（如Bacillus sp.KSM-635)為發(fā)酵菌種。國內的研究受制于缺 乏堿性纖維素酶的高產(chǎn)菌株鮮有大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，挖掘新的微生物產(chǎn)纖維素酶菌株仍極 為必要。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是從自然環(huán)境中分離篩選出一株新的產(chǎn)纖維素酶菌株，為木質纖維 素資源的開發(fā)利用提供一種有用的纖維素酶生產(chǎn)來源。
[0008] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：
[0009] 申請人:從廣西壯族自治區(qū)南寧市武鳴縣郊的牛糞堆肥lcm深處采得樣品，并從 中分離得到一株具有纖維素酶生產(chǎn)能力的細菌6G。經(jīng)形態(tài)觀察、BI0L0G生化鑒定以及基 于16s rDNA序列的分子鑒定，該菌株在分類學上屬于Providencia vermicola 6G，申請 人于2013年8月8日將其保藏于湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心〔 CCTCC〕，編號為：CCTCC NO:M2013364。
[0010] 本發(fā)明除了要求保護上述的普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G菌株 夕卜，還要求保護其在發(fā)酵生產(chǎn)羧甲基纖維素酶以及制備降解纖維素的生物酶制劑上的應 用。
[0011] 所述的發(fā)酵生產(chǎn)羧甲基纖維素酶包括酸性羧甲基纖維素酶和堿性羧甲基纖維素 酶。
[0012] 所述的發(fā)酵生產(chǎn)酸性羧甲基纖維素酶的最適作用pH為6. 0 ;所述的發(fā)酵生產(chǎn)堿性 羧甲基纖維素酶的最適作用pH為8. 5。
[0013] 所述的堿性羧甲基纖維素酶的最適反應溫度為60°C。
[0014] 本發(fā)明具有的突出的實質性特點和顯著的進步是：
[0015] 本 申請人:從自然界中成功分離篩選出了一種能產(chǎn)β-1，4葡聚糖酶的新菌株，拓 寬了纖維素酶生產(chǎn)菌株的選擇范圍，有利于推進木質纖維素降解利用中纖維素酶的進一步 優(yōu)化。本發(fā)明所提供的菌株為好氧的短桿狀革蘭氏陽性菌，直桿狀，0. 6?0. 8 μ mX 1. 5? 2. 5 μ m。菌落大小2mm，透明有光澤，產(chǎn)淺棕色色素。菌株序列具有序列表1所示的核酸序 列，與一株 Providencia vermicola strain FFA6 的菌株（Genbank 登錄號為 JN092794)的 序列相似度在99%以上。
[0016] 經(jīng)試驗證明，該菌株在有氧條件下，pH = 8,培養(yǎng)溫度為30°C時生長最快。在LB培 養(yǎng)基中生長迅速進入對數(shù)期，在約24h進入穩(wěn)定期，0D_達到1. 3,培養(yǎng)至72h開始衰退。最 佳產(chǎn)酶條件下酶活可達0. 15U/ml菌液。該酶在較廣泛pH范圍內（4. 0-10. 0)呈現(xiàn)β -1，4 葡聚糖酶（羧甲基纖維素酶）酶活，且主要呈現(xiàn)堿性纖維素酶活力。酸性CMC酶的最適作 用pH為6. 0,堿性CMC酶的最適作用pH為8. 5。酸性CMC酶活力約為堿性CMC酶活力的 75%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖 1 為普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364最適生 長pH的測定結果。培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件：有氧條件下，30°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)。
[0018] 圖 2 為普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 最適生 長溫度的測定結果。培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件：pH為7. 2, 200rpm搖瓶培養(yǎng)。
[0019] 圖 3 為普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株生 長曲線測定結果。培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件：pH8. 0,30°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)。
[0020] 圖 4 為普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 產(chǎn)纖 維素酶的時間曲線測定結果。菌株用培養(yǎng)基（含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaC15g/ L，KH2P04lg/L，MgS04 · 7H202g/L，121°C滅菌 20min，用預先滅菌的 10% (W/V)Na2C03 溶液調 pH至8. 0?9. 0)在30°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)，接種量5%，定時測定發(fā)酵菌纖維素酶活力。 CMC酶活力按QB2583-2003的方法測定，pH為8. 5,以lmin水解CMC-Na底物產(chǎn)生lumol的 葡萄糖殘基為1個酶活單位。
[0021] 圖 5 為普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株所 產(chǎn)纖維素酶的最適作用pH測定結果。pH3-6用檸檬酸鹽緩沖液，pH7-8用Tris-HCl緩沖液， PH9-12使用Gly-NaOH緩沖液。緩沖液的濃度均為0. lmol/L。測定溫度為42°C。以lmin 水解CMC-Na底物產(chǎn)生lumol的葡萄糖殘基為1個酶活單位；
[0022] 圖 6 為普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株所 產(chǎn)纖維素酶的最適作用溫度測定結果。菌株用培養(yǎng)基（含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L， 恥(：158/1，腿 2?0418/1，]\%504.7!12028/1，1211：滅菌201^11，用預先滅菌的10%(^)似 2〇)3 溶液調pH至8. 0?9. 0)在30°C，200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)64小時，接種量5%，然后取發(fā)酵菌液 按QB2583-2003的方法測定纖維素酶的CMC活力。以lmin水解CMC-Na底物產(chǎn)生lumol的 葡萄糖殘基所需酶量為1個酶活單位；
[0023] 圖 7 為普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株所 產(chǎn)纖維素酶的耐熱性測定結果。反應pH為8. 5,保溫時間為4h。
[0024] 圖 8 為普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株所 產(chǎn)纖維素酶受常見金屬離子影響測定結果。CK :對照，不加金屬離子；金屬離子濃度：0. 5%; 酶反應溫度：50°C ;反應pH :8· 5。

【具體實施方式】
[0025] 實施例1菌株篩選、分離與鑒定
[0026] 第一步：采樣
[0027] 廣西壯族自治區(qū)南寧市堆肥1cm深處采得樣品。
[0028] 第二步：初篩、復篩及純化
[0029] 取樣品lg，加10ml無菌蒸餾水，充分振搖，靜止30分鐘，取上清液稀釋105倍，涂 布接種CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)72h至菌落長出，挑取透明水解圈較大的菌 落，接種CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)液的堿性CMC酶活力。 選取活力最高的培養(yǎng)瓶，取菌液劃線接種CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，純化菌株3次， 最后得到1株產(chǎn)堿性纖維素酶的高產(chǎn)菌株，命名為6G，斜面和冷凍干燥保藏。
[0030] 第三步：菌種鑒定
[0031] 形態(tài)觀察。LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體用革蘭氏染色，顯微鏡觀察可見直桿狀革蘭氏陽 性菌，0.6?0.8 μ mX 1.5?2.5 μ m。菌落大小2mm，透明有光澤，產(chǎn)淺棕色色素。如圖1和 圖2所示，菌株在有氧條件下，pH = 8,培養(yǎng)溫度為30°C時生長最快。如圖3所示，在LB培 養(yǎng)基中生長迅速進入對數(shù)期，在約48h進入穩(wěn)定期，0D6(?達到1. 3。培養(yǎng)至72h開始衰退。
[0032] BI0L0G微生物鑒定系統(tǒng)的鑒定。用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)進行?；罨木杲?種BUG培養(yǎng)基，接種量5 %，33°C，200rpm培養(yǎng)24-48h，調整菌液濁度至5%，將菌液加入儀 器的GENIII96孔生化鑒定板，利用儀器的MicroStation讀取鑒定板中各孔的顏色反應特 征值，通過ML3DC分析程序與數(shù)據(jù)庫中細菌的生理生化數(shù)據(jù)進行匹配，根據(jù)6G菌株與數(shù)據(jù) 庫菌株之間匹配的概率、相似性和位距對6G菌株進行鑒定。初步將6G鑒定為Providencia stuartii，其中，概率（Prob)為 0. 841，相似性（Sim)為 0. 740,距離（Dist)為 5. 448,結果 有一定的參考價值，即該菌株屬于Providencia菌屬。仍需結合分子鑒定結果進行分析。
[0033] 基于16s rDNA序列的分子鑒定。活化菌株接種LB培養(yǎng)基，接種量5%，37°C， 200rpm培養(yǎng)8h至對數(shù)期，菌數(shù)2X 108/mL以上。取培養(yǎng)液2mL，15000rpmX 10min離心， 棄上清液，菌體用無菌蒸餾水洗滌2次，收集菌體細胞，使用天根細菌基因組DNA抽屜試劑 盒提取DNA。以該基因組DNA為模板，采用通用引物27F/1492R，PCR擴增菌株的16S rDNA 序列。50yL的反應體系含PCR緩沖液5yL，正、反向引物各lumol/L，Mg2+2. 5mmol/L， dNTPO. 02mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1. 25U。反應條件為：95°C變性 5min ;94°C變性 30s ;55°C 退火30s ;72°C延伸lmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢 測、分離，然后用Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒切膠回收，用T41igase連接到 PMD-18T載體上。將帶有目的片段的載體通過轉化E. coli DH5a菌株擴增培養(yǎng)后，選擇陽 性克隆提取質粒交上海生工測序。將測序得到的16s rDNA序列用NCBI的BLAST2. 0進行 同源分析（Nucleotide-Nucleotide Blast)，搜索Genbank核酸數(shù)據(jù)庫，根據(jù)比對結果對菌 株進行分子鑒定。結果與其中1株登錄號為JN092794的Providencia vermicola strain FFA6菌株的相似度最高為99%，表明菌株6G為Providencia vermicola菌株。
[0034] 綜合鑒定結果，分子鑒定的可信度優(yōu)于BI0L0G鑒定結果。因此，最終將該菌株鑒 定為 Providencia vermicola。
[0035] 實施例2菌株產(chǎn)纖維素酶水平檢測
[0036] 根據(jù)生長的最適溫度和pH，將菌株6G接種CMC發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，繪制產(chǎn)酶曲線。 粗酶液制備方式為：活化菌株接種CMC發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液，4°C下 4000rpm離心10min，取上清液，加55%的（順 4)2504沉淀，4°C，lOOOOrpm離心10min，收集沉 淀，加入培養(yǎng)液同體積的PH8. 0,0. lmol/L的Tris-HCl緩沖液溶解。以CMC鈉鹽為底物，測 定纖維素內切酶的活力，即CMC酶活力。酶反應體系含粗酶液0. 5ml，CMC鈉鹽1 %，0. lmol/ L的Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液2. 0ml。50°C水浴反應60min，立刻用DNS法測定CMC水解所 釋放的葡萄糖量。以作用CMC鈉鹽底物lmin釋放lmg葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活 力單位。
[0037] 結果如圖4所示，結合圖3的結果可知，該菌株在生長初期（對數(shù)期）中，產(chǎn)酶與 生長同步。16h時產(chǎn)酶達到最高值為0. 15U/mL，并在此后穩(wěn)定的逐步降低。
[0038]將反應液的 pH用緩沖液調為 3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0、9· 0、10· 0、11· 0 和 12. 0， 測定不同pH下的CMC酶活力，用百分比表示測定結果。所用緩沖液分別為：pH3-6用檸檬 酸鹽緩沖液，PH7-8用Tris-HCl緩沖液，pH9-12使用Gly-NaOH緩沖液。緩沖液的濃度均為 0. lmol/L。結果如圖5所示，可見該菌株所產(chǎn)的纖維素酶既有酸性CMC酶的活力，又有堿性 CMC酶的活力。酸性CMC酶的最適作用pH為6. 0,堿性CMC酶的最適作用pH為8. 5。酸性 CMC酶活力為堿性CMC酶活力的75 %。
[0039] 依據(jù)以上方法分別測定酶液的最適作用溫度、耐熱能力和金屬離子對酶液的作 用，結果分別如圖6-圖8所示。從圖6可知，菌株所產(chǎn)堿性CMC酶活力的最適作用溫度 為60°C，溫度低于55°C或高于65°C時酶活力均迅速下降，可見該酶液的作用溫度范圍非常 窄。通過將酶液在50°C下保溫測定酶液的耐熱能力，結果如圖7所示，可見酶活呈線性下 降，保溫lh酶活力下降超過35%，保溫3h殘留酶活只有15 %，而保溫4h酶活殘留幾乎為 〇,表明該菌株所產(chǎn)的堿性纖維素內切酶的熱穩(wěn)定性較差。在測定酶活力時加入〇. 5%的各 種金屬離子，觀察金屬離子對菌株1A所產(chǎn)堿性CMC酶活力的影響，結果如圖8所示，Mg2+對 酶活具有顯著的促進作用（+17%)。Ca 2+、C〇2+和Mn2+等3種離子對酶活有促進，分別使酶 活力提高4. 5%、6· 7%和6.3%。Na+對酶的活力幾乎沒有影響。K+、Ni+兩種離子對酶活力 稍有抑制，加入酶反應體系后分別使酶活力降低了 6.7% (K+)，4.6% (Ni+)。而Fe2+、Cu2+對 菌株所產(chǎn)堿性CMC酶具有明顯的抑制作用，分別使酶活力降低了 20%和89%。
【權利要求】
1. 一種普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G菌株，其保藏編號為：CCTCC N0:M2013364〇
2. 權利要求1所述的普羅維登斯菌屬（Providencia vermicola)6G在發(fā)酵生產(chǎn)羧甲基 纖維素酶以及制備降解纖維素的生物酶制劑上的應用。
3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的發(fā)酵生產(chǎn)羧甲基纖維素酶包括酸 性羧甲基纖維素酶和堿性羧甲基纖維素酶。
4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的酸性羧甲基纖維素酶的作用pH為 6. 0 ;所述的堿性羧甲基纖維素酶的作用pH為8. 5。
5. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的堿性羧甲基纖維素酶的反應溫度 為 60。。。
【文檔編號】C12N9/42GK104232523SQ201410432165
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權日:2014年8月28日
【發(fā)明者】蘆志龍, 陳東, 張穗生, 吳仁智, 陸琦, 黃日波 申請人:廣西科學院