一種殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的培養(yǎng)基和補(bǔ)料方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的培養(yǎng)基和補(bǔ)料方法，本發(fā)明通過(guò)已經(jīng)確認(rèn)的適合于殺真菌鏈霉菌為菌種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配伍，并且以補(bǔ)料方法為控制方法，結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外已公布的恩拉霉素發(fā)酵控制工藝最終使得恩拉霉素的發(fā)酵單位達(dá)到10000u/ml以上，生產(chǎn)周期不超過(guò)240h，同國(guó)內(nèi)技術(shù)相比，發(fā)酵單位提高了20%，生產(chǎn)周期減少了20h以上。
【專利說(shuō)明】一種殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的培養(yǎng)基和補(bǔ)料方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的培 養(yǎng)基和補(bǔ)料方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 恩拉霉素（enramycin)是由殺真菌鏈霉菌發(fā)酵而得，是不飽和脂肪酸與十幾種氨 基酸結(jié)合的多肽類抗生素，主要組分有恩拉霉素 A和恩拉霉素 B，主要是以鹽酸鹽形式應(yīng) 用。目前，國(guó)內(nèi)恩拉霉素的發(fā)酵生產(chǎn)采用二級(jí)發(fā)酵模式，該方式存在的主要問(wèn)題有以下幾 占 · 1恩拉霉素發(fā)酵水平較低，其發(fā)酵單位低于8000u/ml。
[0003] 2國(guó)內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的培養(yǎng)基中加入葡萄糖，經(jīng)高溫滅菌，易導(dǎo)致部分葡萄 糖碳化，降低總糖含量，影響發(fā)酵液質(zhì)量。
[0004] 3恩拉霉素發(fā)酵生產(chǎn)所需的原材料采購(gòu)成本較高，特別是恩拉霉素培養(yǎng)基中常用 的有機(jī)氮源市場(chǎng)價(jià)格較高，提高發(fā)酵成本，降低市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
[0005] 4國(guó)內(nèi)恩拉霉素的發(fā)酵培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，一般在260h以上，導(dǎo)致能耗較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種有效提高發(fā)酵單位，降 低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)恩拉霉素穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)的殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的培養(yǎng) 基； 本發(fā)明的另一目的是提供上述殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的補(bǔ)料方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為： 一種殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特 征在于所述種子培養(yǎng)基組成為：玉米油15?20ml/L、α -乳糖5?10g/L、乳糖酶0. 01? 〇· 03g/L、配方魚粉20?25g/L、啤酒酵母干渣15?20g/L、玉米漿干粉10?15g/L、蚯蚓粉 5?10g/L、硫酸銨0· 2?0· 5g/L、輕質(zhì)碳酸|丐1?5g/L ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米油20?30ml/L、α -乳糖20?25g/L、乳糖酶0. 02? 〇· 05g/L、配方魚粉30?40g/L、啤酒酵母干渣15?20g/L、玉米漿干粉15?20g/L、蚯蚓粉 10?15g/L、硫酸銨0· 3?0· 7g/L、輕質(zhì)碳酸鈣1?5g/L、硫酸鎂0· 03?0· 06g/L、硫酸鋅 0· 02 ?0· 04g/L、磷酸二氫鉀 0· 5 ?0· 9g/L、氯化鈉 0· 3 ?0· 7g/L、氯化鉀 0· 2 ?0· 5g/L、 表面活性劑1. 5?2. 5g/L、氧載體4?7g/L。
[0008] 所述配方魚粉是由魚粉、骨粉和羽毛粉按照重量比7:3:1混合而得。
[0009] 所述氧載體為吐溫80或全氟化碳。
[0010] 所述表面活性劑為聚氧乙烯烷基醇酰胺或甘油酯或聚甘油酯或聚乙二醇硬脂酸 酯或十八烷基二羥乙基氧化胺。
[0011] 利用上述培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的補(bǔ)料方法，其特征是：在發(fā)酵過(guò)程中采用流 加法進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料包括補(bǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)水、補(bǔ)硫酸銨、pH控制和補(bǔ)氨基酸，其中 a補(bǔ)培養(yǎng)基： 發(fā)酵前70h不用進(jìn)行補(bǔ)料， 發(fā)酵時(shí)間在71?90h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng)基總 體積的3?5%， 發(fā)酵時(shí)間在ll〇h?130h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng) 基總體積的2?4%， 發(fā)酵時(shí)間在150h?180h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng) 基總體積的1?2% ; b補(bǔ)水： 發(fā)酵前80h不用進(jìn)行補(bǔ)水， 發(fā)酵時(shí)間在81?160h，當(dāng)菌體濃度高于55%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在 50?55%，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度， 發(fā)酵時(shí)間在161h?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)菌體濃度高于50%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體 濃度在40?50%，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度； c發(fā)酵過(guò)程pH控制工藝： 發(fā)酵前80h，pH不進(jìn)行控制， 發(fā)酵時(shí)間在81?100h，若pH < 6. 5,加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至6. 6?6. 9 ; 若pH > 7,加入20%的硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至6. 6?6. 9， 發(fā)酵時(shí)間在101?180h，若pH < 6. 2,加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH控至6. 3? 6. 6 ;若pH > 6. 6,加入30%的硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至6. 3?6. 6 ; d補(bǔ)入氨基酸： 發(fā)酵前80h，不用補(bǔ)入氨基酸， 發(fā)酵在81h、130h和170h分別補(bǔ)入濃度為0. 2?0. 5mg/L的絲氨酸、半胱氨酸和精氨 酸，其補(bǔ)入量為發(fā)酵液體積的〇. 1?〇. 3%(這一過(guò)程是分別加入這三種，還是每次加入混合 液？） e補(bǔ)硫酸按： 在發(fā)酵的80h、150h和220h，分別補(bǔ)入30%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的 0· 05 ?0· 1%。
[0012] 本發(fā)明培養(yǎng)基中使用乳糖，避免出現(xiàn)葡萄糖碳化現(xiàn)象。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)已經(jīng)確認(rèn)的適合于殺真菌鏈霉菌為菌種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的種子培 養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配伍，并且以補(bǔ)料方法為控制方法，結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外已公布的恩拉 霉素發(fā)酵控制工藝最終使得恩拉霉素的發(fā)酵單位達(dá)到l〇〇〇〇u/ml以上，生產(chǎn)周期不超過(guò) 240h，同國(guó)內(nèi)技術(shù)相比，發(fā)酵單位提高了 20%，生產(chǎn)周期減少了 20h以上。
[0014] 本發(fā)明適用于規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素，能夠滿足年產(chǎn)100噸恩拉霉素的生產(chǎn)需 求。
[0015] 具體實(shí)施方法 下面用實(shí)例予以說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實(shí)例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明 的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
[0016] 下述實(shí)施例的菌種選用殺真菌鏈霉菌：生產(chǎn)使用的菌種來(lái)源為母瓶發(fā)酵液。母瓶 發(fā)酵液質(zhì)量要求為：PH6?8 ;菌體濃度10?30% ;鏡檢無(wú)雜菌；發(fā)酵單位2000?3000u/ml。
[0017] 以下實(shí)施例中的發(fā)酵方法采用目前國(guó)內(nèi)外已知的、公開(kāi)的以殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生 產(chǎn)工藝，如 種子培養(yǎng)工藝： 首先將種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好 的殺真菌鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的5? 10%。種子培養(yǎng)條件為：罐壓0. 04?0. 06MPa ;罐溫28?30°C ;空氣流量：0?12h，30? 50m3/h ;12h?移種：50?70m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80?100r/min ;pH6?8 ;培養(yǎng)時(shí)間30?35h。 種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度20?30% ;pH值6?8 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)工藝： 先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培 養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基滅菌后脂肪控制在2?3% ;培養(yǎng)溫度29?31°C ;攪拌轉(zhuǎn)速 100?120r/min ;罐壓0. 05?0. 06MPa ;培養(yǎng)時(shí)間230?240h ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在6. 0? 7. 5 ;發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行菌檢，要求無(wú)其它雜菌；0?120h :600?800m3/h ;121h?發(fā)酵結(jié)束： 1000?1500m3/h。發(fā)酵培養(yǎng)停止條件為：發(fā)酵效價(jià)每6?8h取樣檢測(cè)，前、后檢測(cè)的發(fā)酵 單位相差在500u/ml以內(nèi)；菌體濃度30?40% ;發(fā)酵單位在10000u/mL以上。
[0019] 實(shí)施例1 10m3種子罐：玉米油150L、α -乳糖50kg、乳糖酶0. lkg、配方魚粉200kg、啤酒酵母干 漁150kg、玉米楽干粉lOOkgJ丘蝴粉50kg、硫酸銨2kg、輕質(zhì)碳酸興10kg。
[0020] 種子培養(yǎng)工藝控制： 首先將種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好 的殺真菌鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的5 %。種 子培養(yǎng)條件為：罐壓〇. 04?0. 06MPa ;罐溫28?30°C ;空氣流量：0?12h，30m3/h ;12h? 移種：50m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ;pH6?8 ;培養(yǎng)時(shí)間30h。種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度21% ; pH值7.8 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0021] 60m3發(fā)酵罐：玉米油1200L、α -乳糖1200kg、乳糖酶L 2kg、配方魚粉1800kg、啤 酒酵母漁干900kg、玉米楽干粉900g/L、il丘蝴粉600kg、硫酸銨18kg、輕質(zhì)碳酸興60kg、硫酸 鎂1. 8kg、硫酸鋅1. 2kg、磷酸二氫鉀30kg、氯化鈉18kg、氯化鉀12kg、聚氧乙烯烷基醇酰胺 90kg、吐溫 80 240kg。
[0022] 發(fā)酵培養(yǎng)工藝： 先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培 養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基滅菌后脂肪控制在2. 1% ;培養(yǎng)溫度29?31°C;攪拌轉(zhuǎn)速100r/ min ;罐壓0. 05?0. 06MPa ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在6. 0?7. 5。發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行菌檢，要求 無(wú)其它雜菌；〇?120h :600m3/h ;121h?發(fā)酵結(jié)束：1000m3/h。發(fā)酵培養(yǎng)停止：菌體濃度為 31%，恩拉霉素發(fā)酵單位為10276u/ml，生產(chǎn)周期232h。
[0023] 在發(fā)酵過(guò)程中采用流加法進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料包括補(bǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)水、補(bǔ)硫酸銨、pH控制 和補(bǔ)氨基酸，其中 a補(bǔ)培養(yǎng)基工藝控制： 發(fā)酵前70h不用進(jìn)行補(bǔ)料。
[0024] 發(fā)酵時(shí)間在71?90h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng) 基總體積的3?5%。
[0025] 發(fā)酵時(shí)間在110h?130h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵 培養(yǎng)基總體積的2?4%。
[0026] 發(fā)酵時(shí)間在150h?180h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵 培養(yǎng)基總體積的1?2%。
[0027] b補(bǔ)水工藝控制： 發(fā)酵前80h不用進(jìn)行補(bǔ)水， 發(fā)酵時(shí)間在81?160h，當(dāng)菌體濃度高于55%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在 50?55%，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度， 發(fā)酵時(shí)間在161h?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)菌體濃度高于50%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體 濃度在40?50%，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度； c發(fā)酵過(guò)程pH控制工藝： 發(fā)酵前80h，pH不進(jìn)行控制， 發(fā)酵時(shí)間在80?100h，若pH < 6. 5,加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至6. 6?6. 9 ; 若pH > 7,加入20%的硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至6. 6?6. 9。
[0028] 發(fā)酵時(shí)間在101?180h，若pH < 6. 2,加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH控至 6. 3?6. 6 ;若pH > 6. 6,加入30%的硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至6. 3?6. 6 ; d補(bǔ)入氨基酸： 發(fā)酵前80h，不用補(bǔ)入氨基酸， 恩拉霉素發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，分別在81h、130h和170h補(bǔ)入濃度為0. 2?0. 5mg/L的絲 氨酸、半胱氨酸和精氨酸，其補(bǔ)入量為發(fā)酵液體積的〇. 1?〇. 3%。
[0029] e補(bǔ)硫酸銨 恩拉霉素發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，分別在80h、150h和220h補(bǔ)入30%的硫酸銨溶液，其用量控 制在發(fā)酵液體積的〇. 05?0. 1%。
[0030] 實(shí)施例2 10m3種子罐：玉米油160L、α -乳糖60kg、乳糖酶0. 12kg、配方魚粉210kg、啤酒酵母干 漁160kg、玉米楽干粉llOkgJ丘蝴粉60kg、硫酸銨2. 5kg、輕質(zhì)碳酸興20kg。
[0031] 種子培養(yǎng)工藝： 首先將種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好 的殺真菌鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的6 %。種 子培養(yǎng)條件為：罐壓〇. 04?0. 06MPa ;罐溫28?30°C ;空氣流量：0?12h，35m3/h ;12h? 移種：55m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速85r/min ;pH6?8 ;培養(yǎng)時(shí)間31h。種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度22% ; pH值7.4 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0032] 60m3發(fā)酵罐：玉米油1320L、α -乳糖1260kg、乳糖酶1. 8kg、配方魚粉1980kg、啤 酒酵母漁干960kg、玉米楽干粉960g/L、il丘蝴粉660kg、硫酸銨24kg、輕質(zhì)碳酸興120kg、硫酸 鎂2. 4kg、硫酸鋅1. 5kg、磷酸二氫鉀36kg、氯化鈉24kg、氯化鉀18kg、甘油酯102kg、全氟化 碳 300kg。
[0033] 發(fā)酵培養(yǎng)工藝： 先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培 養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基滅菌后脂肪控制在2. 3% ;培養(yǎng)溫度29?31°C;攪拌轉(zhuǎn)速105r/ min ;罐壓0. 05?0. 06MPa ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在6. 0?7. 5 ;發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行菌檢，要求無(wú) 其它雜菌；〇?120h :650m3/h ;121h?發(fā)酵結(jié)束：1100m3/h。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，菌體濃度30? 40% ;恩拉霉素發(fā)酵單位為10723u/ml，生產(chǎn)周期234h。
[0034] 在發(fā)酵過(guò)程中采用流加法進(jìn)行補(bǔ)料，具體補(bǔ)料方式參見(jiàn)實(shí)施例1。
[0035] 實(shí)施例3 10m3種子罐：玉米油175L、α -乳糖75kg、乳糖酶0. 2kg、配方魚粉225kg、啤酒酵母干 漁175kg、玉米楽干粉125kg、il丘蝴粉75kg、硫酸銨3. 5kg、輕質(zhì)碳酸興30kg。
[0036] 種子培養(yǎng)工藝： 首先將種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好 的殺真菌鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的7 %。種 子培養(yǎng)條件為：罐壓〇. 04?0. 06MPa ;罐溫28?30°C ;空氣流量：0?12h，40m3/h ;12h? 移種：60m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速90r/min ;pH6?8 ;培養(yǎng)時(shí)間33h。種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度25% ; pH值7. 1 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0037] 60m3發(fā)酵罐：玉米油1500L、α -乳糖1350kg、乳糖酶2. 1kg、配方魚粉2100kg、啤 酒酵母漁干1050kg、玉米楽干粉1050g/L、il丘蝴粉750kg、硫酸銨30kg、輕質(zhì)碳酸興180kg、硫 酸鎂2. 7kg、硫酸鋅1. 8kg、磷酸二氫鉀42kg、氯化鈉30kg、氯化鉀21g、聚甘油酯120kg、全 氟化碳330kg。
[0038] 發(fā)酵工藝控制： 先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行 培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基滅菌后脂肪控制在2. 5% ;培養(yǎng)溫度29?31°C ;攪拌轉(zhuǎn)速 110r/min ;罐壓0. 05?0. 06MPa ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在6. 0?7. 5 ;發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行菌檢， 要求無(wú)其它雜菌；〇?120h :700m3/h ;121h?發(fā)酵結(jié)束：1200m3/h。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，菌體濃 度35% ;恩拉霉素發(fā)酵單位為11386u/ml，生產(chǎn)周期236h。
[0039] 在發(fā)酵過(guò)程中采用流加法進(jìn)行補(bǔ)料，具體補(bǔ)料方式參見(jiàn)實(shí)施例1。
[0040] 實(shí)施例4 10m3種子罐：玉米油180L、α -乳糖90kg、乳糖酶0. 25kg、配方魚粉240kg、啤酒酵母干 漁190kg、玉米楽干粉140kg、il丘蝴粉90kg、硫酸銨4kg、輕質(zhì)碳酸|丐40kg。
[0041] 種子培養(yǎng)工藝 首先將種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好 的殺真菌鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的8 %。種 子培養(yǎng)條件為：罐壓〇. 04?0. 06MPa ;罐溫28?30°C ;空氣流量：0?12h，45m3/h ;12h? 移種：65m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速95r/min ;pH6?8 ;培養(yǎng)時(shí)間34h。種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度27% ; pH值6.7 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0042] 60m3發(fā)酵罐：玉米油1620L、α -乳糖1350kg、乳糖酶2. 4kg、配方魚粉2220kg、啤 酒酵母漁干1080kg、玉米楽干粉1140g/L、il丘蝴粉840kg、硫酸銨36kg、輕質(zhì)碳酸興240kg、硫 酸鎂3kg、硫酸鋅2. lkg、磷酸二氫鉀48kg、氯化鈉36kg、氯化鉀24g、聚乙二醇（100)硬脂酸 酯 132kg、吐溫 80 360kg。
[0043] 發(fā)酵培養(yǎng)工藝： 先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培 養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基滅菌后脂肪控制在2. 7% ;培養(yǎng)溫度29?31°C;攪拌轉(zhuǎn)速115r/ min ;罐壓0. 05?0. 06MPa ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在6. 0?7. 5 ;發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行菌檢，要求無(wú) 其它雜菌；〇?120h :750m3/h ; 121h?發(fā)酵結(jié)束：1350m3/h。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，菌體濃度37% ; 恩拉霉素發(fā)酵單位為11167u/ml，生產(chǎn)周期238h。
[0044] 在發(fā)酵過(guò)程中采用流加法進(jìn)行補(bǔ)料，具體補(bǔ)料方式參見(jiàn)實(shí)施例1。
[0045] 實(shí)施例5 10m3種子罐：玉米油200L、α -乳糖l〇〇kg、乳糖酶0. 3kg、配方魚粉250kg、啤酒酵母干 漁200kg、玉米楽干粉150kg、il丘蝴粉90kg、硫酸銨5kg、輕質(zhì)碳酸興50kg。
[0046] 種子培養(yǎng)工藝 首先將種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好 的殺真菌鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的10%。 種子培養(yǎng)條件為：罐壓〇. 04?0. 06MPa ;罐溫28?30°C;空氣流量：0?12h，50m3/h ; 12h? 移種：70m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速100r/min ;pH6?8 ;培養(yǎng)時(shí)間35h。種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度30% ; pH值6.2 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0047] 60m3發(fā)酵罐：玉米油1800L、α -乳糖1500kg、乳糖酶3kg、配方魚粉2400kg、啤酒 酵母漁干1200kg、玉米楽干粉1200g/L、il丘蝴粉900kg、硫酸銨42kg、輕質(zhì)碳酸興300kg、硫酸 鎂3. 6kg、硫酸鋅2. 4kg、磷酸二氫鉀54kg、氯化鈉42kg、氯化鉀30g、十八烷基二羥乙基氧化 胺 150kg、吐溫 80 420kg。
[0048] 發(fā)酵培養(yǎng)工藝： 先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培 養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基滅菌后脂肪控制在2. 9% ;培養(yǎng)溫度29?31°C;攪拌轉(zhuǎn)速120r/ min ;罐壓0. 05?0. 06MPa ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在6. 0?7. 5 ;發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行菌檢，要求無(wú) 其它雜菌；〇?120h :800m3/h ; 121h?發(fā)酵結(jié)束：1500m3/h。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，菌體濃度39% ; 恩拉霉素發(fā)酵單位為l〇823u/ml，生產(chǎn)周期240h。
[0049] 在發(fā)酵過(guò)程中采用流加法進(jìn)行補(bǔ)料，具體補(bǔ)料方式參見(jiàn)實(shí)施例1。
[0050] 對(duì)比實(shí)施例 10m3種子罐：豆油175L、葡萄糖75kg、玉米蛋白粉225kg、花生餅粉175kg、玉米漿 125kg、酵母膏75kg、硫酸銨3. 5kg、輕質(zhì)碳酸興30kg。
[0051] 種子培養(yǎng)工藝 首先將種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好 的殺真菌鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的7 %。種 子培養(yǎng)條件為：罐壓〇. 04?0. 06MPa ;罐溫28?30°C ;空氣流量：0?12h，40m3/h ;12h? 移種：60m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速90r/min ;pH6?8 ;培養(yǎng)時(shí)間32h。種子培養(yǎng)結(jié)束，其菌體濃度18% ; pH值6.8 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0052] 60m3發(fā)酵罐：豆油1500L、葡萄糖1350kg、玉米蛋白粉2100kg、花生餅粉1050kg、 玉米漿1050g/L、酵母膏750kg、硫酸銨30kg、輕質(zhì)碳酸鈣180kg、硫酸鎂2. 7kg、硫酸鋅 1. 8kg、磷酸二氫鉀42kg、氯化鈉30kg、氯化鉀21g、消泡劑有機(jī)硅油120L。
[0053] 發(fā)酵培養(yǎng)工藝 先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培 養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基滅菌后脂肪控制在1. 7% ;培養(yǎng)溫度29?31°C;攪拌轉(zhuǎn)速110r/ min ;罐壓0. 05?0. 06MPa ;發(fā)酵過(guò)程中pH控制在6. 0?7. 5 ;發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行菌檢，要求無(wú) 其它雜菌；〇?120h :700m3/h ;121h?發(fā)酵結(jié)束：1100m3/h。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，菌體濃度32% ; 恩拉霉素發(fā)酵單位為8143u/ml，生產(chǎn)周期271h。
【權(quán)利要求】
1. 一種殺真菌鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其 特征在于所述種子培養(yǎng)基組成為：玉米油15?20ml/L、α -乳糖5?10g/L、乳糖酶0. 01? 〇· 03g/L、配方魚粉20?25g/L、啤酒酵母干渣15?20g/L、玉米漿干粉10?15g/L、蚯蚓粉 5?10g/L、硫酸銨0· 2?0· 5g/L、輕質(zhì)碳酸|丐1?5g/L ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米油20?30ml/L、α -乳糖20?25g/L、乳糖酶0. 02? 〇· 05g/L、配方魚粉30?40g/L、啤酒酵母干渣15?20g/L、玉米漿干粉15?20g/L、蚯蚓粉 10?15g/L、硫酸銨0· 3?0· 7g/L、輕質(zhì)碳酸鈣1?5g/L、硫酸鎂0· 03?0· 06g/L、硫酸鋅 0· 02 ?0· 04g/L、磷酸二氫鉀 0· 5 ?0· 9g/L、氯化鈉 0· 3 ?0· 7g/L、氯化鉀 0· 2 ?0· 5g/L、 表面活性劑1. 5?2. 5g/L、氧載體4?7g/L。
2. 按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述配方魚粉是由魚粉、骨粉和羽毛粉 按照重量比7:3:1混合而得。
3. 按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述氧載體為吐溫80或全氟化碳。
4. 按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述表面活性劑為聚氧乙烯烷基醇酰 胺或甘油酯或聚甘油酯或聚乙二醇硬脂酸酯或十八烷基二羥乙基氧化胺。
5. -種利用權(quán)利要求1-6所述的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的補(bǔ)料方法，其特征是：在 發(fā)酵過(guò)程中采用流加法進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料包括補(bǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)水、補(bǔ)硫酸銨、pH控制和補(bǔ)氨基酸， 其中 a補(bǔ)培養(yǎng)基： 發(fā)酵前70h不用進(jìn)行補(bǔ)料， 發(fā)酵時(shí)間在71?90h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng)基總 體積的3?5%， 發(fā)酵時(shí)間在ll〇h?130h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng) 基總體積的2?4%， 發(fā)酵時(shí)間在150h?180h，按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方補(bǔ)碳源和氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng) 基總體積的1?2% ; b補(bǔ)水： 發(fā)酵前80h不用進(jìn)行補(bǔ)水， 發(fā)酵時(shí)間在81?160h，當(dāng)菌體濃度高于55%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在 50?55%，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度， 發(fā)酵時(shí)間在161h?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)菌體濃度高于50%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體 濃度在40?50%，每隔6?8h檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度； c發(fā)酵過(guò)程pH控制工藝： 發(fā)酵前80h，pH不進(jìn)行控制， 發(fā)酵時(shí)間在81?100h，若pH < 6. 5,加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至6. 6?6. 9 ; 若pH > 7,加入20%的硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至6. 6?6. 9， 發(fā)酵時(shí)間在101?180h，若pH < 6. 2,加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH控至6. 3? 6. 6 ;若pH > 6. 6,加入30%的硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至6. 3?6. 6 ; d補(bǔ)入氨基酸： 發(fā)酵前80h，不用補(bǔ)入氨基酸， 發(fā)酵在81h、130h和170h分別補(bǔ)入濃度為0. 2?0. 5mg/L的絲氨酸、半胱氨酸和精氨 酸，其補(bǔ)入量為發(fā)酵液體積的〇. 1?〇. 3%(這一過(guò)程是分別加入這三種，還是每次加入混合 液？） e補(bǔ)硫酸按： 在發(fā)酵的80h、150h和220h，分別補(bǔ)入30%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的 0· 05 ?0· 1%〇
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK104195203SQ201410432903
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】任勇, 奇乃, 李小萍, 董媛 申請(qǐng)人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司