羰基還原酶基因、編碼酶、載體、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126的重組羰基還原酶及其編碼基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，以及其在制備重組羰基還原酶中的應(yīng)用；分別以2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N,N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)和(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，進(jìn)行生物催化反應(yīng)制備高光學(xué)純度的(2S,3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羥基丁酸酯、(S)-N,N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯以及6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯。
【專利說明】羰基還原酶基因、編碼酶、載體、工程菌及其應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種來源于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli) ZJB-12126的羰基還原酶基因、編碼酶、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重 組基因工程菌以及在制備手性藥物中間體中的應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 羰基還原酶（E.C. I. I. 1. 184)屬于氧化環(huán)氧酶家族，反應(yīng)需要輔酶NAD(P)H參 與，能立體選擇性催化潛手性的酮類物質(zhì)不對稱還原成光學(xué)手性醇中間體。該類酶廣 泛分布于自然界中，在各類動物、微生物和植物中均有發(fā)現(xiàn)。其中，由于微生物種類繁 多、分布廣，是羰基還原酶的主要來源。目前已從多種微生物中發(fā)現(xiàn)了羰基還原酶，如： Pichia finlandica, Clostridium ljungdahlii, Vibrio vulnificus, Candida glabrata, Serratia quinivorans, Polygonum minus, Arabidopsis thaliana, Oenococcus oeni, Serratia marcescens, Chryseobacterium sp. , Rhodococcus erythropolis, Candida magnoliae, Lactobacillus jensenii 和 Lactobacillus coryniformis 等。 此 夕卜， 還從極端微生物中發(fā)現(xiàn)了嗜極端環(huán)境的羰基還原酶，如：Thermococcus sibiricus， Thermococcus guaymasensis, Haloferax volcanii, Thermus thermophilus, Sulfolobus acidocaldarius, Carboxydothermus hydrogenoformans, Thermococcus kodakarensis, Thermotoga maritime, Koliella Antarctica, Pyrobaculum calidifontis 和 Halobacterium sp.等。
[0003] 近年來，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，利用基因挖掘技術(shù) 克隆新型羰基還原酶已成為一種重要手段。目前已利用此技術(shù)克隆了大量的羰基還原酶。 其中部分羰基還原酶的基因已在不同的宿主（大腸桿菌、畢赤酵母等）中表達(dá)，獲得產(chǎn)酶活 力和選擇性較高的基因工程菌，并應(yīng)用于不對稱還原羰基類化合物。盡管如此，許多羰基還 原酶催化的底物譜較窄，往往是為特定反應(yīng)篩選的最適生物催化劑，因此大大限制了其應(yīng) 用范圍。此外，許多酶的催化效率較低，也限制了其工業(yè)化應(yīng)用。篩選具有較寬底物譜的新 型羰基還原酶，研究其可以高效高選擇性催化的手性藥物中間體，不僅可以拓寬其應(yīng)用范 圍，提升其應(yīng)用潛力，也為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0004] (2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯是合成培南類藥物中間體4-乙酰氧基 氮雜環(huán)丁酮（4AA)的關(guān)鍵手性中間體。目前獲得（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸 酯中間體的主要途徑是以手性催化劑（R) -BINAP-Ru不對稱催化2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁 酸酯生成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯。但由于其反應(yīng)條件苛刻，不利于其工 業(yè)化生產(chǎn)。生物催化法合成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯報道較少，并且多數(shù) 形成混合構(gòu)型的產(chǎn)物。Saccharomycopsis malanga NBRC 171096催化生成（2S, 3R)單一 構(gòu)型，并具有較高的對映選擇性（對映體過量值ee>96. 2% )與非對映選擇性（非對映體 過量值de>92.2%)，但是催化效率低（產(chǎn)率僅4%)。美國專利US20130034895研究了來 源于Lactobacillus kefir的羰基還原酶催化合成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸 酯，具有較高的對映選擇性（ee為60-99% )，但未見其非對映選擇性的報道。
[0005] 度洛西汀（欣百達(dá)，Cymbalta)是一種5-羥色胺及去甲腎上腺素再攝取抑制劑 (SNRIs)，由美國Eli LiIly公司開發(fā)。它含有一個手性中心，僅（S)構(gòu)型的對映體具有藥物 活性。（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺是度洛西汀合成過程中的關(guān)鍵手性 中間體。目前獲得（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺主要也是通過過渡金 屬手性配體催化氫化途徑。微生物法不對稱還原合成（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻 吩基）丙酰胺報道較少。Pankaj等報道了熱帶假絲酵母（Candida tropicalis MTCC-5158) 和維斯假絲酵母菌（Candida viswanathii)催化底物N，N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基） 丙酰胺合成（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，轉(zhuǎn)化率>80%，ee>99%。 國內(nèi)專利 CN102925368, CN 103013898 和 CN103421854 公開 了球飽白僵菌（Beauver iabassiana)及馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyce marxianus)中的羰基還原酶不對稱還 原制備（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，底物濃度可達(dá)30g/L，轉(zhuǎn)化率 >80%，66>99%。美國專利舊20130177962公開了利用酮還原酶〇0?0)生產(chǎn)（5)，，^雙 甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺的方法，底物濃度可達(dá)100g/L，但該工藝需要嚴(yán)格的 控溫和反應(yīng)控制，并添加異丙醇，副產(chǎn)物丙酮難以去除。
[0006] (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯和6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯是HMG-CoA 酶抑制劑阿托伐他汀類藥物的側(cè)鏈?zhǔn)中灾虚g體。生物法不對稱還原合成（S)-4-氯-3-羥 基丁酸乙酯的研究較為成熟，涉及到的酶也較多，具有較高的選擇性和活性的菌株有： Geotrichum candidum,Pichia stipitis,Candida albicans,Streptomyces coelicolor和 Candida parapsilosis ATCC 7330。其中從 Candida parapsilosis ATCC 7330 中克隆到 的一種羰基還原酶催化生產(chǎn)（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯時的底物濃度最高可達(dá)3000禮，產(chǎn) 率>99. 0%，ee>99. 9%。此外，Codexis公司專利US7807423B2公開了一系列酮還原酶，催 化生產(chǎn)（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯， ee>99%。6-氰基_(3R，5R)_二羥基己酸叔丁酯是阿 托伐他汀的另一種手性中間體，目前高立體選擇性催化（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸 叔丁酯生成6-氰基-(3R，5R)_二輕基己酸叔丁酯的菌株有：Saccharomyces cerevisiae， Pichia angusta, Pichia haplophila, Beauveria bassiana, Pichia pastoris, Pichia membranefaciens, Candida humicola, Kluyveromyces drosophilarum, Rhodotorula glutinis 和 Pichia caribbic 等。Codexis 公司專利 US7879585B2 從 Saccharomyces cerevisiae中克隆了一種酮還原酶并進(jìn)行了改造，催化生產(chǎn)6_氰基-(3R, 5R)-二輕基己酸 叔丁酯轉(zhuǎn)化率為85%，de>99%。
[0007] 由此可見，研究這些藥物手性中間體的生物催化工藝具有重要意義，不僅能為這 些化合物的合成提供新的路線，又能為其提供新的酶源。迄今為止，仍未見Burkho I der i a gladioli菌株中的羰基還原酶在這些藥物手性中間體不對稱還原中的應(yīng)用。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的是提供一種來源于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli) ZJB-12126羰基還原酶基因、編碼酶、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重 組基因工程菌，以及在制備（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯、（S)-N，N-雙甲 基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺、（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯和6-氰基-(3R，5R)-二 羥基己酸叔丁酯等手性藥物中間體中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0010] 本發(fā)明提供一種來源于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli) ZJB-12126的羰基還原酶基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1所示，所述羰基還原 酶基因由如下方法得到：
[0011] 利用 PCR 技術(shù)，在引物 I (ATGAGCAAGCGGCTGGAAGGCAAGG)、引物 2 (TCAGACCTGGGCCTGGCCGCC)的作用下以來源于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli) ZJB-12126菌株中的總基因組DNA為模板克隆長約0. 8kb的羰基還原酶基因序 列，命名為adh2。將該片段連接到pMD18-T載體上，獲得克隆載體pMD18-T-adh2,將載體轉(zhuǎn) 化大腸桿菌獲得含載體pMD18-T-adh2的重組大腸桿菌。對重組質(zhì)粒測序，并利用軟件對測 序結(jié)果進(jìn)行分析，該序列含有一個長756bp的開放閱讀框。
[0012] 本發(fā)明表達(dá)引物 3 (CATATGAGCAAGCGGCTGGAAGG CAAGG)和引物 4 (CTCGAGTCAGACCTGGGCCTGGCCGCCG)，酶切位點(diǎn)分別為Nde I和Xho I (下劃線），以克隆載 體pMD18-T-adh2為模板，通過PCR擴(kuò)增得到了用于表達(dá)的羰基還原酶基因。
[0013] 任何對SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個核苷酸的取代、插入或缺失 處理獲得的核苷酸序列，只要其與該核苷酸具有90%以上的同源性，均屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
[0014] 本發(fā)明提供一種由所述羰基還原酶基因 adh2編碼的重組羰基還原酶，命名為 BgADH2,所述重組羰基還原酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示。
[0015] 任何對SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中氨基酸進(jìn)行插入、缺失或替換的處理獲得 的多肽片段或其突變體，只要其與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 本發(fā)明涉及含所述羰基還原酶基因的重組載體。
[0017] 本發(fā)明涉及利用所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，具體為：將羰基 還原酶基因同表達(dá)載體pET28a連接，構(gòu)建了含有羰基還原酶基因的異源表達(dá)重組質(zhì)粒 pET28a-adh2。將表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-adh2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，獲得 含有重組質(zhì)粒pET28a-adh2的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-adh2。
[0018] 本發(fā)明還涉及羰基還原酶基因在制備重組羰基還原酶中的應(yīng)用，具體為：構(gòu)建 含有所述羰基還原酶基因的重組載體，將所示重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（優(yōu)選E.coli BL21 (DE3))中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組羰基還原 酶的菌體細(xì)胞，破碎后獲得的羰基還原酶粗酶液進(jìn)行純化，獲得羰基還原酶純酶。
[0019] 本發(fā)明還涉及所述重組羰基還原酶在制備藥物手性中間體中的應(yīng)用，所述應(yīng)用 為：以含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，于PH值為6? 10的緩沖液中，加入底物，輔助底物和NAD (P) +，在20?40°C、50?250rpm條件下反應(yīng)（優(yōu) 選30°C、150r/min下反應(yīng)2h)，反應(yīng)完全后，獲得含藥物手性中間體的混合液；反應(yīng)結(jié)束后， 將混合液用乙酸乙酯萃取兩次，合并有機(jī)層并用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙 酸乙酯，烘干后獲得藥物手性中間體；所述底物為2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N，N-雙 甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基 己酸叔丁酯中的一種；所述輔助底物為葡萄糖、甲酸銨、異丙醇或無水乙醇，優(yōu)選葡萄糖，所 述輔助底物為葡萄糖時，添加葡萄糖脫氫酶構(gòu)成輔助底物體系，所述輔助底物為甲酸銨時， 添加甲酸脫氫酶構(gòu)成輔助底物體系；所述催化劑的用量以濕菌體重量計為20-200g/L緩沖 液（優(yōu)選50g/L)，所述底物的初始濃度為10-100mm 〇l/L緩沖液（優(yōu)選20mmol/L)，所述輔 助底物的用量為10_200g/L緩沖液（優(yōu)選50g/L)，所述NAD (P)+的用量為0. 01-5mmol/L緩 沖液（優(yōu)選2mmol/L)，所述葡萄糖脫脫氫酶或甲酸脫氫酶用量以含葡萄糖脫脫氫酶或甲酸 脫氫酶菌體經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體重量計，為20-200g/L緩沖液（優(yōu)選50g/L)。所述底 物2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯以400mmol/L DMSO溶液的形式加入（即2-苯甲酰氨甲 基-3-酮丁酸酯用二甲基亞砜配制成400mmol/L的溶液）。
[0020] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體按 如下方法制備：將含有重組羰基還原酶基因的工程菌接種至含有終濃度50 μ g/mL卡那霉 素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm下培養(yǎng)12h，再以體積濃度1%接種量接種至新鮮 的含有終濃度50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，150rpm下培養(yǎng)至菌體 OD6tltl達(dá)0. 6-0. 8,加入終濃度為0. ImM的IPTG，28°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，4°C、5000rpm離心 5min,棄去上清液,收集濕菌體。
[0021] 本發(fā)明所述脫氫酶濕菌體按如下方法制備：將含葡萄糖脫氫酶（GDH)的（優(yōu) 選來源于 Exiguobacterium sibiricum 255-15 的 GDH，GenBank:ACB59697. 1)重組菌 BL21(DE3)/pET28b-gdh 或含甲酸脫氫酶（FDH)(優(yōu)選來源于 Candida boidinii 的 FDH， GenBank:AF004096)的重組菌BL21 (DE3) /pET28b-fdh接種至含有終濃度50 μ g/mL卡那霉 素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm下培養(yǎng)12h，再以1%接種量（v/v)接種至新鮮的含 有終濃度50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，150rpm下培養(yǎng)至菌體0D_ 達(dá)0. 6-0. 8,加入終濃度為0. ImM的IPTG，28°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，4°C、5000rpm離心5min， 棄去上清液，收集沉淀，即獲得脫氫酶濕菌體。
[0022] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述的反應(yīng)以含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕 菌體為催化劑，于pH值為6?10的緩沖液中，加入底物，葡萄糖、葡萄糖脫氫酶和NAD (P)+， 在30°C、150rpm條件下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得含藥物手性中間體的混合液；所述底物為 2_苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N，N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺、4-氯乙酰乙 酸乙酯和（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的一種；所述催化劑的用量以濕菌體 的重量計為50g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為20mmol/L緩沖液，所述輔助底物的用量 為50g/L緩沖液，所述葡萄糖脫氫酶的用量以含葡萄糖脫氫酶的菌體經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕 菌體重量計，為50g/L緩沖液，所述NAD(P) +的用量為2mmol/L緩沖液。
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述含所述羰基還原酶基因的羰基還原酶BgADH2作為生物催化 劑在轉(zhuǎn)化底物2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯（式I)生成（2S，3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羥 基丁酸酯（式II)中的應(yīng)用，式I中，R為C1-C6的烷基，涉及的反應(yīng)式見圖6所示。
[0024] 具體地，上述應(yīng)用的反應(yīng)體系為：以磷酸鹽緩沖液（lOOmM，pH 7. 0)為反應(yīng)介質(zhì)， 以含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，加入葡萄糖脫氫 酶，2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯，NADP +和葡萄糖，30°C，轉(zhuǎn)速150r/min條件下水浴搖床反 應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機(jī)層并用無水硫酸鎂干燥， 過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，獲得濃縮物，干燥，即為（2S，3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羥 基丁酸酯；所述底物以400mmol/L DMSO溶液的形式加入，底物的終濃度20mmol/L緩沖液， NADP+用量為2mmol/L緩沖液，葡萄糖用量為50g/L緩沖液，濕菌體用量為50g/L緩沖液。
[0025] 進(jìn)一步，所述底物為N，N_雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺時，其反應(yīng)式見圖 7所示。
[0026] 具體地，上述應(yīng)用的反應(yīng)體系為：以含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng) 獲得的濕菌體為催化劑，以磷酸鉀緩沖液（pH 8.0)為反應(yīng)介質(zhì)，加入葡萄糖脫氫酶、葡萄 糖、NADP+，底物N，N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺（式III)，3(TC，轉(zhuǎn)速150r/min 條件下反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液加6M NaOH水溶液調(diào)pH至11. 0,再加入等體積乙酸乙酯 萃取兩次，合并有機(jī)層并用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，獲得濃縮物， 干燥，即為（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺（式IV);所述重組羰基還原 酶濕菌體用量50g/L緩沖液、葡萄糖脫氫酶用量以葡萄糖脫氫酶濕菌體重量計為50g/L緩 沖液、葡萄糖用量為50g/L緩沖液、NADP +用量為2mmol/L緩沖液、底物濃度20mmol/L緩沖 液。
[0027] 進(jìn)一步，所述底物為4-氯乙酰乙酸乙酯時，其反應(yīng)式見圖8所示。
[0028] 具體地，上述應(yīng)用的反應(yīng)體系為：以含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培 養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以磷酸鉀緩沖液（pH 7.0)為反應(yīng)介質(zhì)，加入葡萄糖脫氫酶， 葡萄糖，NADP+，底物 4-氯乙酰乙酸乙酯（4-chloroacetoacetate ethyl，C0BE)(SV)， 30°C，轉(zhuǎn)速150r/min條件下反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液加入等體積乙酸乙酯萃取兩 次，合并有機(jī)層并用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，濃縮物干燥，即為 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（CHBE)(式VI);所述重組羰基還原酶濕菌體用量50g/L緩沖 液、葡萄糖脫氫酶用量以葡萄糖脫氫酶濕菌體重量計為50g/L緩沖液，葡萄糖用量為50g/L 緩沖液、NADP+用量為2mmol/L緩沖液，底物濃度20mmol/L緩沖液。
[0029] 進(jìn)一步，所述底物為（R) -6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯時，其反應(yīng)式見圖 9所示。
[0030] 具體地，上述應(yīng)用的反應(yīng)體系為：以含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng) 獲得的濕菌體為催化劑，以磷酸鉀緩沖液（pH 7.0)為反應(yīng)介質(zhì)，加入葡萄糖脫氫酶，葡萄 糖，隱0?+，底物〇〇-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯（式￥11)，3〇1：，轉(zhuǎn)速15〇1·/!^!! 條件下反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機(jī)層并用無水硫酸鎂干 燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，濃縮物干燥即為6-氰基-(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯 (式VIII);所述重組羰基還原酶濕菌體用量為50g/L緩沖液、葡萄糖脫氫酶用量以葡萄糖 脫氫酶濕菌體用量計為50g/L緩沖液，葡萄糖用量為50g/L緩沖液、NADP +用量為2mmol/L 緩沖液，底物濃度20mmol/L緩沖液。
[0031] 本發(fā)明所述催化劑還包括羰基還原酶BgADH2純酶、粗酶液或者粗酶粉等其他形 態(tài)。采用羰基還原酶重組基因工程菌作催化劑時，需結(jié)合一種輔酶循環(huán)系統(tǒng)，包括葡萄糖/ 葡萄糖脫氫酶（GDH)、甲酸/甲酸脫氫酶（FDH)等雙酶雙底物輔酶循環(huán)系統(tǒng)以及乙醇、異丙 醇等單酶雙底物輔酶循環(huán)系統(tǒng)。通常用輔助底物代替NAD (P) H進(jìn)行反應(yīng)，常用的輔助底物 為：葡萄糖10_200g/L、乙醇或異丙醇2-30% (v/v，占總轉(zhuǎn)化體系的質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)）；較 佳的菌體濃度為20-200g/L。
[0032] 能夠提供本發(fā)明所述羰基還原酶基因的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli)ZJB-12126,保藏編號為CCTCC M 2012379,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2012年9月25日，已在先前的專利申請 (CNl〇3〇455〇4A)中披露。
[0033] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了來源于一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia gladioli)ZJB-12126的羰基還原酶基因，該羰基還原酶基因可與表達(dá)載體 連接構(gòu)建得到含該基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-adh2,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，獲 得重組大腸桿菌，該大腸桿菌含有重組羰基還原酶，可以利用重組大腸桿菌作為生物催化 劑進(jìn)行生物催化反應(yīng)，為藥物手性中間體的生物催化合成提供了可供選擇的新型酶源。
[0034] 重組羰基還原酶BgADH2作為生物催化劑，以2-苯甲酰胺甲基-3-酮丁酸酯為底 物制備（2S，3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羥基丁酸酯，產(chǎn)物ee>95%，de>95%，2h底物轉(zhuǎn)化率 為 68%，與 CN103045504A 中 B.gladioli ZJB-12126 野生菌相比（ee 81%，de 91%，24h 底物轉(zhuǎn)化率64% )，對映選擇性與轉(zhuǎn)化率均得到了提高。以N，N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻 吩基）丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物 時，也可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備相應(yīng)的（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺、 (S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯以及6-氰基-(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯，產(chǎn)物ee分別為 99 %，99 %和95% ;底物轉(zhuǎn)化率分別為82%，87 %和93%。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為克隆載體pMD18-T_adh2物理圖譜；
[0036] 圖2為pET28a_adh2重組質(zhì)粒物理圖譜；
[0037] 圖3為羰基還原酶基因 PCR擴(kuò)增低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠（argrose)電泳圖；其中，泳道 1為DL2000DNA Marker ;泳道2為利用引物1和引物2擴(kuò)增得到的羰基還原酶基因片段；泳 道3為利用引物3和引物4擴(kuò)增得到的羰基還原酶基因片段。
[0038] 圖4陽性重組質(zhì)粒pET28a-adh2的酶切結(jié)構(gòu)圖；其中，泳道1為DL 10000DNA Marker片段；泳道2為羰基還原酶基因；泳道3為pET28a-adh2/Nde I樣品；泳道4為 pET28a-adh2/Xho I 樣品；泳道 5 為 pET28a-adh2/Nde I and Xho I 樣品；
[0039] 圖5為羰基還原酶純化后的SDS-PAGE圖：泳道1為蛋白質(zhì)分子量Marker，泳道2 為純化后的羰基還原酶BgADH2。
[0040] 圖6為（2S，3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羥基丁酸酯合成方程式。
[0041] 圖7為（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺合成方程式。
[0042] 圖8為（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯合成方程式。
[0043] 圖9為6-氰基_(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯合成方程式。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0045] 實(shí)施例1 :羰基還原酶基因 adh2的擴(kuò)增
[0046] 根據(jù)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli)ZJB-12126全基因組測序 信息，挖掘其中大量的羰基還原酶，其中一個具有催化2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯和 N，N-雙甲基-3-氧-3-(2-噻吩基）丙酰胺生成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯 和（S)-N，N-雙甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基）丙酰胺功能的酶為本發(fā)明涉及的羰基還原酶 BgADH2。
[0047] 利用MPBio公司的FastDNAK Spin試劑盒提取唐菖蒲伯克霍爾德氏菌 (Bur kho I der i a g I ad i 〇 I i) Z JB12126菌體的總基因組DNA，以該基因組DNA為模板，在引 物 I (ATGAGCAAGCGGCTGGAAGGCAAGG)、引物 2 (TCAGACCTGGGCCTGGC CGCC)的作用下進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（總體積 50 μ L) : 10 X Pfu DNA Polymerase Buffer 5 μ L，IOmM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5πιΜ)1μ L，濃度為 50μΜ 的克隆引物 1、引物 2 各 1 μ L，基因組 DNA 1 μ L，Pfu DNA Polymerase 1 μ L，無核酸水 40 μ L。
[0048] 采用Biorad的PCR儀，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95°C 5min，95°C變性30s，65°C退火 45s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0049] PCR反應(yīng)液用0. 9%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收純化該片段，利用Taq DNA聚 合酶向片段5 '端引入堿基A。在T4DNA連接酶作用下將該片段同pMD 18-T載體進(jìn)行連接，得 到克隆重組質(zhì)粒pMD18-T-adh2,見圖1。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，涂布于含 有終濃度為50 μ g/ml氨芐青霉素鈉抗性的LB平板，隨機(jī)挑取陽性克隆測序，利用軟件分析 測序結(jié)果，結(jié)果表明：經(jīng)引物1和引物2擴(kuò)增到的核苷酸序列長度為756bp (其核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示），該序列編碼一個完整的開放閱讀框（氨基酸序列為SED ID NO. 2)。
[0050] 實(shí)施例2 :重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-adh2的構(gòu)建
[0051] 根據(jù)實(shí)施例1分析結(jié)果設(shè)計引物3 (CATATGAGCAAGCGGCTGGAAGGCAA GG)、引物 4 (CTCGAGTCAGACCTGGGCCTGGCCGCCG)，并分別在引物 3 和引物 4 中引入了 Nde I 和 Xho I 限 制性酶切位點(diǎn)（下劃線標(biāo)記）。在引物3和引物4的引發(fā)下，利用高保真Pfu DNA聚合酶 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長為756bp的羰基還原酶基因序列（其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示）， 測序后利用Nde I和Xho I限制性內(nèi)切酶（TaKaRa)對擴(kuò)增片段進(jìn)行處理，并利用T4DNA連 接酶（TaKaRa)將該片段同用相同的限制性內(nèi)切酶處理的商業(yè)化載體pET28a(Invitrogen) 進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET28a_adh2。將構(gòu)建的表達(dá)載體pET28a_adh2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21 (DE3) (Invitrogen)中，涂布于含有終濃度50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB平板，37°C下 培養(yǎng)8-16h，隨機(jī)挑取克隆，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果見圖4所示，從圖4可以看出 陽性重組質(zhì)粒pET28a-adh2單酶切在3泳道和4泳道出現(xiàn)單一的與預(yù)期相符的條帶，雙酶 切后5泳道出現(xiàn)兩條帶，一條帶與目的基因片段大小一致。該結(jié)果說明目的基因已經(jīng)克隆 至pET28a的Nde I和Xho I位點(diǎn)，S卩獲得了重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-adh2。
[0052] 實(shí)施例3 :重組羰基還原酶（BgADH2)濕菌體
[0053] 將實(shí)施例2獲得的含有表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a_adh2的重組大腸桿菌E. coli BL21 (DE3) /pET28a-adh2菌體接種至含有終濃度50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基， 37°C，200rpm下培養(yǎng)12h，再以1 %接種量（v/v)接種至新鮮的含有終濃度50 μ g/ml卡那霉 素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，150rpm下培養(yǎng)至菌體0D_達(dá)0. 6-0. 8,加入終濃度為 0. ImM的IPTG，28°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，4°C、5000rpm離心5min，棄去上清液，收集沉淀，即 獲得含有表達(dá)重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-adh2濕菌體。該菌體可直接作 為生物催化劑或者用于蛋白純化。
[0054] 實(shí)施例4 :羰基還原酶（BgADH2)的分離純化
[0055] 將實(shí)施例3中獲得的菌體（即重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-adh2濕菌體）以 結(jié)合緩沖液（50福，？118.0磷酸鈉緩沖液，含300福他(：1，10福咪唑）重懸后，經(jīng)超聲破碎， 12000rpm離心40min，上清與經(jīng)上述結(jié)合液平衡過的Ni親和層析樹脂孵育后，再用沖洗緩沖 液（50福，？!18.0磷酸鈉緩沖液，含300福他(：1，20福咪唑）沖洗至基本無雜蛋白，隨后以洗 脫緩沖液（50福4118.0磷酸鈉緩沖液，含300福他(：1，250福咪唑）洗脫并收集目的蛋白， 電泳鑒定純度后合并目的蛋白并以透析緩沖液（50mM，pH 8. O磷酸鈉緩沖液）透析48h，取截 留液采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量為2mg/mL，將酶液稀釋至終濃度為0. 5mg/mL分裝，凍存 于-80°C (羰基還原酶BgADH2蛋白電泳圖見附圖5)，獲得羰基還原酶BgADH2純酶。
[0056] 實(shí)施例5 :重組羰基還原酶BgADH2的活性測定
[0057] 以實(shí)施例4方法分離純化得到的羰基環(huán)化酶BgADH2純酶用于催化底物2-苯甲酰 氨甲基-3-酮丁酸酯。
[0058] 催化體系組成及催化條件如下：IOmL磷酸鹽緩沖液（lOOmM，pH 7. 0)中加入羰基 還原酶BgADH2純酶（終濃度為0. lg/L)，2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯（終濃度20mmol/ L，初始濃度為400mmol/L DMSO)，NAD⑵H(終濃度5mmol/L緩沖液）構(gòu)成反應(yīng)體系。30°C， 轉(zhuǎn)速150r/min條件下反應(yīng)5min取樣檢測酶活。同樣條件下，以大腸桿菌BL21(DE3)以及 大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a菌體破碎上清經(jīng)透析得到的截留液作為對照。
[0059] 酶活單位⑶定義為：在30°C、pH 7. 0條件下，Imin內(nèi)消耗1 μ mol NAD (P) H所需 的酶量定義為1U。NAD(P)H的消耗量采用酶標(biāo)儀在340nm下測定。根據(jù)體系中NAD(P)H的 消耗量計算重組羰基還原酶BgADH2的酶活。測定結(jié)果見表1。
[0060] 表1重組羰基還原酶BgADH2的酶活測定

【權(quán)利要求】
1. 一種來源于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli)ZJB-12126的羰基還 原酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1所示。
2. -種權(quán)利要求1所述羰基還原酶基因編碼的重組羰基還原酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的重組羰基還原酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :2所示。
4. 一種權(quán)利要求1所述羰基還原酶基因構(gòu)建的重組載體。
5. -種權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
6. -種權(quán)利要求1所述的羰基還原酶基因在制備重組羰基還原酶中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有所述羰基還原酶基 因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 培養(yǎng)液分離得到含有重組羰基還原酶的菌體細(xì)胞。
8. -種權(quán)利要求2所述重組羰基還原酶在制備藥物手性中間體中的應(yīng)用，其特征在于 所述應(yīng)用為：以含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，于pH 值為6?10的緩沖液中，加入底物，輔助底物和NAD (P)+，在20?40°C、50?250rpm條件 下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得含藥物手性中間體的混合液；所述底物為2-苯甲酰氨甲基-3-酮 丁酸酯、N，N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和（R) -6-氰 基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的一種；所述輔助底物為葡萄糖、甲酸銨、異丙醇或無 水乙醇，所述輔助底物為葡萄糖時，添加葡萄糖脫氫酶構(gòu)成輔助底物體系，所述輔助底物 為甲酸銨時，添加甲酸脫氫酶構(gòu)成輔助底物體系；所述催化劑的用量以濕菌體的重量計為 20-200g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為10-100mm 〇l/L緩沖液，所述輔助底物的用量為 10-200g/L緩沖液，所述葡萄糖脫脫氫酶或甲酸銨脫氫酶的用量以含葡萄糖脫氫酶或甲酸 脫氫酶的菌體經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體重量計，為20-200g/L緩沖液，所述NAD (P) +的用量 為 0. 01-5mmol/L 緩沖液。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述濕菌體按如下方法制備：將含有重組羰 基還原酶基因的工程菌接種至含有終濃度50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C， 200rpm下培養(yǎng)12h，再以體積濃度1%接種量接種至新鮮的含有終濃度50μ g/ml卡那霉 素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，150rpm下培養(yǎng)至菌體0D_達(dá)0. 6-0. 8,加入終濃度為 0. ImM的IPTG，28°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，4°C、5000rpm離心5min，棄去上清液，收集濕菌體。
10. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)以含重組羰基還原酶基因的工 程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，于pH值為6?10的緩沖液中，加入底物，葡萄糖、 葡萄糖脫氫酶和NAD (P) +，在30°C、150rpm條件下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得含藥物手性中間體 的混合液；所述底物為2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N，N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基） 丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的一種；所述催 化劑的用量以濕菌體的重量計為50g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為20mmol/L緩沖液， 所述輔助底物的用量為50g/L緩沖液，所述葡萄糖脫脫氫酶的用量以含葡萄糖脫氫酶的菌 體經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體重量計，為50g/L緩沖液，所述NAD (P) +的用量為2mmol/L緩沖 液。
【文檔編號】C12N1/21GK104263742SQ201410436860
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】鄭裕國, 柳志強(qiáng), 陳翔, 王亞軍, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)