一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝.多粘芽孢桿菌經(jīng)一、二級種子擴大培養(yǎng)后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中通過補料流加碳源增加芽孢桿菌的數(shù)量和轉(zhuǎn)化率，顯著提高單位產(chǎn)量，降低了單位成本；結(jié)束發(fā)酵，使用真空薄膜濃縮器濃縮發(fā)酵液，發(fā)酵液中的可溶性增效物質(zhì)、促生物質(zhì)、抑菌活性物質(zhì)能有效回收；濃縮發(fā)酵液用多級低溫噴霧流化干燥設(shè)備干燥造粒，分選顆粒，旋風(fēng)分離器捕集細粉返回再造粒，得每克菌粉CFU不少于1.5×1010個的多粘芽孢桿菌產(chǎn)品。尾氣處理，達標排放。本發(fā)明能最大程度保留發(fā)酵液中有效物質(zhì)，產(chǎn)品質(zhì)量高、設(shè)備利用率高，生物活性保持的比較好，廢氣，廢水達標排放，能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝。

【背景技術(shù)】
[0002]多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus poIymyxa)是芽抱桿菌科(Bacillaceae)類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的革蘭氏陽性細菌,在劃入類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)之前又稱Bacillus polymyxa。多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus poIymyxa)的細胞呈桿狀，(0.5-2.5) μπι X (1.2?10.0) μ m, G+C含量為40%?50% ;利用周生鞭毛運動，在膨大孢子囊中產(chǎn)生橢圓型芽孢；最適生長PH為7，最適溫度為28?30°C;兼性厭氧，分解葡萄糖和其他糖類產(chǎn)酸，有時產(chǎn)氣，在營養(yǎng)瓊脂上無可溶性色素，應(yīng)用前景廣闊。
[0003]傳統(tǒng)農(nóng)藥和化肥的過量使用導(dǎo)致很多植物病蟲產(chǎn)生抗藥性，造成生態(tài)環(huán)境的惡性循環(huán)，因此高效、安全的微生物農(nóng)藥和生物化肥越來越受到人們的關(guān)注。而多粘類芽孢桿菌能分泌大量的活性物質(zhì)，對許多細菌和真菌有抑制活性，能提高植物的抗病能力，促進植物生長，提高產(chǎn)量，并能產(chǎn)生多肽類抗菌物質(zhì)對植物病原真菌有較好的拮抗活性。它是一種較好的生防細菌。另外，多粘芽孢桿菌還具有多種酶活、抗氧化和抗腫瘤等生物活性。因此，隨著多粘類芽孢桿菌研究的深入，它在工農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域、生物學(xué)理論研究方面將有更廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]鑒于多粘芽孢桿菌如此多的用途，國內(nèi)已有廠家生產(chǎn)多粘芽孢桿菌類產(chǎn)品，但是相關(guān)產(chǎn)品普遍質(zhì)量不高。目前多粘芽孢桿菌制劑常見的生產(chǎn)方法是采用相關(guān)的多粘芽孢桿菌生產(chǎn)菌種，分批發(fā)酵培養(yǎng)，至其大部分或者全部形成芽孢時，采用板框過濾或者離心的方式進行濃縮，添加助劑后烘干或者噴霧干燥得到多粘芽孢桿菌的活菌制劑。這些方法存在著以下不足:
[0005]1、發(fā)酵罐裝料系數(shù)為60% -70%，設(shè)備利用率不高；
[0006]2、由于采用的分批發(fā)酵，導(dǎo)致發(fā)酵初始培養(yǎng)基濃度過高，接種后延滯期較長，發(fā)酵過程中副產(chǎn)物形成較多，發(fā)酵產(chǎn)品濃度上不去，最終導(dǎo)致發(fā)酵成本較大；
[0007]3、發(fā)酵液的濃縮一般采用的絮凝/板框過濾或者離心技術(shù)，這兩種技術(shù)一般都會產(chǎn)生大量的廢水，后續(xù)處理成本較高；
[0008]4、采用絮凝/板框過濾或者離心技術(shù)還會造成發(fā)酵上清里面的有效成分丟失，造成產(chǎn)品效果的下降；
[0009]5、噴霧干燥一般設(shè)定的入口溫度為180°C至200°C，出口溫度為80°C到100°C，在這樣較高的工作溫度下，某些品種的菌數(shù)會有一定程度的下降，直接影響了產(chǎn)品的品質(zhì)。
[0010]真空薄膜蒸發(fā)器是一類蒸發(fā)器的總稱，特點是物料液體沿加熱管壁呈膜狀流動而進行傳熱和蒸發(fā)，優(yōu)點是傳熱效率高，蒸發(fā)速度快，物料停留時間短，因此特別適合熱敏性物質(zhì)的蒸發(fā)。該類蒸發(fā)器包括MVR(機械式蒸汽再壓縮)蒸發(fā)器，降膜式濃縮蒸發(fā)器和板式濃縮蒸發(fā)器等等。常常應(yīng)用于中藥活性物質(zhì)濃縮，食品添加劑濃縮，抗生素濃縮，酶制劑濃縮等領(lǐng)域，但目前還沒有用于活菌制劑濃縮方面。
[0011]多級低溫噴霧流化干燥造粒相較于常規(guī)噴霧干燥塔，采用了多種先進的技術(shù)，t匕如塔內(nèi)用了多個噴槍結(jié)構(gòu)，噴槍采用的是高壓噴嘴，噴出的霧滴分散效果好，且多個噴嘴噴出的霧滴相互碰撞，極易形成大顆粒；而沒有形成顆粒的則被旋風(fēng)分離器捕集，然后返回塔頂霧化區(qū)進行粉體的重新附聚和造粒；并且塔底有流化床可對形成的顆粒進行二次干燥，進一步降低顆粒的含水量；該系統(tǒng)要求進料有很高的固含量(10% -25% )，這樣不需要粘合劑就能直接形成顆粒；由于是多級干燥系統(tǒng)，而且物料含水量不高，所以該設(shè)備的操作溫度相比常規(guī)噴霧干燥塔要低，一般風(fēng)溫度控制在130°C _180°C，出口溫度控制在60°C -80°C之間，這樣該系統(tǒng)具備很好的干燥熱敏性物料的能力，將該技術(shù)應(yīng)用于活菌制劑的干燥上，可很好的保留產(chǎn)品中的生物活性，獲得高質(zhì)量的產(chǎn)品，以及環(huán)保，工序少等優(yōu)點。
[0012]發(fā)酵和干燥造粒會產(chǎn)生大量的廢氣，里面常含有揮發(fā)性有機物(VOC)，硫化氫，氨氣，硫醇類等各種污染物，同時伴有難聞的惡臭味，過去發(fā)酵企業(yè)一般將其直接排放或者簡單的用水噴淋后排放，兩種處理方式會造成對環(huán)境的嚴重污染。采用合適的化學(xué)試劑直接氧化廢氣中的相關(guān)污染物或者用物理方法分解其中的污染物是比較好的處理方法，能夠解除廢氣中的惡臭味，減少環(huán)境污染。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)狀，旨在提供一種設(shè)備利用率高，產(chǎn)品質(zhì)量提高，生物活性保持的比較好，廢氣，廢水達標排放，能夠大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定，產(chǎn)量更高，生產(chǎn)成本明顯降低的多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝。
[0014]本發(fā)明目的的實現(xiàn)方式為，一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝，具體步驟如下:
[0015]I) 一級種子培養(yǎng):5000ml三角瓶中裝有2000ml —級種子培養(yǎng)基，115°C -121 °C濕熱滅菌15-30min，取1ml多粘芽孢桿菌活菌凍干管菌種接種于一級種子培養(yǎng)基中，在28°C -30°C培養(yǎng)12?16h ;—級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖0.5 % -2.5 %，牛肉膏0.5 % -3 %，蛋白胨0.5 % -3 %，氯化鈉0.5 % -1 %，培養(yǎng)基pH為6.5-7.5 ；
[0016]2) 二級種子培養(yǎng):在400L發(fā)酵罐中裝有150L或300L 二級種子培養(yǎng)基，115 0C -121 °C濕熱滅菌15-30min，將3000ml長好的一級種子接種于二級種子培養(yǎng)基中；在28°C -30°C培養(yǎng)12?16h ; 二級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖
0.5% -2.5%，酵母抽提物 0.5% -3%，蛋白胨 0.5% -2.5%，磷酸氫二鉀 0.02% -0.05%,氯化鈉0.5% -1%，硫酸鎂0.02% -0.1%，培養(yǎng)基pH調(diào)為6.5-7.5 ；
[0017]3)發(fā)酵:在5m3或40m3發(fā)酵罐中裝有4000L或30m3多粘芽孢桿菌活菌發(fā)酵培養(yǎng)基，115°C_121°C濕熱滅菌15-30min，將150L或300L長好的二級種子接種于多粘芽孢桿菌活菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制罐壓0.02Mpa-0.05Mpa，在28°C _32°C培養(yǎng)40_46h ;發(fā)酵所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖1% _2%，豆柏1% -3%，玉米漿1% _3%，酵母粉1% -3%，蛋白胨I % -3 %，麥芽浸粉I % -2 %，磷酸氫二鉀0.0I % -0.05 %，硫酸鎂0.1 % -0.2 %，硫酸錳 0.002 %，培養(yǎng)基 pH 為 6.5-7.5 ；
[0018]4)補料:當(dāng)發(fā)酵至12_17h開始流加由葡萄糖20% -60^^^40% -80%配制成的碳源葡萄糖補料培養(yǎng)基，發(fā)酵至38-42小時結(jié)束；
[0019]5)pH控制:根據(jù)需要用質(zhì)量百分濃度18% -24%的氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液液pH控制在6.0-6.5之間；
[0020]6)至芽孢形成率大于等于90%時，結(jié)束發(fā)酵；
[0021]7)將發(fā)酵液加熱到35°C _60°C時進入濃縮器，在真空度為_70kpa?_95kpa下進行濃縮，濃縮至含固量達到10% -25%時,開始出料；
[0022]8)濃縮發(fā)酵液用多級低溫噴霧流化干燥設(shè)備進行干燥造粒，顆粒經(jīng)過分選，符合顆粒要求直接出塔，得CFU不少于1.5X101(I個的多粘芽孢桿菌產(chǎn)品；所述進風(fēng)溫度130-180°C，出口溫度 60-80°C ；
[0023]9)尾氣處理:采用化學(xué)氧化、等離子照射或紫外照射去味、脫氨氮或脫硫化氫處理后排放。
[0024]本發(fā)明有以下優(yōu)點:
[0025]1、通過補料的方法，顯著提高了單位產(chǎn)量，降低了單位成本，發(fā)酵罐裝料系數(shù)由原先的60% -70%提高到80%-90%,設(shè)備利用率提高，單罐產(chǎn)量大大提升；通過補料發(fā)酵，達到高密度發(fā)酵，提高生物量，發(fā)酵液有效成分含量提高10-20%，高于分批發(fā)酵；
[0026]2、采用多級發(fā)酵技術(shù)，可使用于各種規(guī)模發(fā)酵罐上，縮短了芽孢桿菌的發(fā)酵周期，降低了發(fā)酵染菌風(fēng)險；
[0027]3、采用低溫真空薄膜濃縮器直接濃縮發(fā)酵液，相比采用傳統(tǒng)的絮凝/板框過濾或者離心的濃縮方式，發(fā)酵液中可溶性的增效物質(zhì)、促生物質(zhì)、抑菌活性物質(zhì)等得到有效回收；
[0028]4、采用低溫多級干燥制粒新工藝，相比傳統(tǒng)離心噴霧干燥生產(chǎn)工藝，進口風(fēng)溫和出口風(fēng)溫低，更好地保留了生物活性，而且一次性獲得水分散顆粒劑產(chǎn)品而不是粉劑產(chǎn)品;
[0029]5、發(fā)酵后不用添加助劑即可烘干或者噴霧干燥:
[0030]6、低溫濃縮過程中產(chǎn)生的冷凝水，生化需氧量(B0D值)極低，一般在80以下，達到達標排放標準；而傳統(tǒng)的絮凝/板框過濾或者離心的濃縮方法，會產(chǎn)生大量生化需氧量(B0D值)很高的廢水，需要進行復(fù)雜的處理后才可能達到排放標準；
[0031]7、發(fā)酵尾氣、干燥制粒尾氣均通過收集系統(tǒng)收集，經(jīng)化學(xué)氧化、等離子照射、紫外照射等去味、脫氨氮、脫硫化氫尾氣處理方式處理后能達標排放。

【具體實施方式】
[0032]本發(fā)明取多粘芽孢桿菌種子凍干管菌種，接種于115_121°C濕熱滅菌15_30min的一級種子培養(yǎng)基中，進行一級種子培養(yǎng)。將一級種子接種于經(jīng)115-121°C滅菌15-30min，二級種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行二級種子培養(yǎng)。發(fā)酵，在發(fā)酵過程中補料，結(jié)束發(fā)酵。
[0033]一、二級種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基經(jīng)濕熱滅菌后，培養(yǎng)基要迅速降至30°C左右。
[0034]使用真空薄膜濃縮器濃縮發(fā)酵液，濃縮器為MVR濃縮器、降膜蒸發(fā)器或板式蒸發(fā)濃縮器。采用MVR濃縮器，從蒸發(fā)室出來的二次蒸汽經(jīng)壓縮機壓縮，壓力溫度升高至100C -115°C，送至加熱室當(dāng)加熱蒸汽使用，加熱發(fā)酵液至進料溫度，加熱蒸汽本身冷凝成水。
[0035]多級低溫噴霧流化干燥造粒:濃縮發(fā)酵液用多級低溫噴霧流化干燥設(shè)備進行干燥造粒，顆粒經(jīng)過分選，符合顆粒要求直接出塔，得CFU不少于1.5 X 1ltl個的多粘芽孢桿菌產(chǎn)品；所述進風(fēng)溫度130°C _180°C，出口溫度60°C -80°C ；
[0036]下面用具體實施例詳述本發(fā)明:
[0037]實施例1:(以5m3發(fā)酵罐為例)
[0038]I) 一級種子培養(yǎng):5000ml三角瓶中裝有2000ml —級種子培養(yǎng)基，121 °C濕熱滅菌15min。取1ml多粘芽孢桿菌活菌凍干管菌種接種于一級種子培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)16h ；一級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖0.5%，牛肉膏0.5%，蛋白胨3%，氯化鈉0.5%，培養(yǎng)基pH為7.5 ;
[0039]2) 二級種子培養(yǎng):在400L發(fā)酵罐中裝有150L 二級種子培養(yǎng)基，121°C濕熱滅菌15min。將3000ml長好的一級種子接種于二級種子培養(yǎng)基中；在28°C培養(yǎng)16h ;二級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖0.5%，酵母抽提物3 %，蛋白胨0.5 %，磷酸氫二鉀
0.02%,氯化鈉0.5%，硫酸鎂0.02%，培養(yǎng)基pH調(diào)為7.5 ;
[0040]3)發(fā)酵:在5m3發(fā)酵罐中裝有4000L多粘芽孢桿菌活菌發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C濕熱滅菌15min。將150L長好的二級種子接種于多粘芽孢桿菌活菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制罐壓
0.02Mpa-0.05Mpa，在28°C培養(yǎng)46h ;發(fā)酵所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖1%，豆柏
I%，玉米漿I %，酵母粉I %，蛋白胨3 %，麥芽浸粉2 %，磷酸氫二鉀0.01%，硫酸鎂0.1%，硫酸錳0.002 %，培養(yǎng)基pH為7.5 ;
[0041]4)補料:當(dāng)發(fā)酵至12h開始流加由葡萄糖60%、水40%配制成的碳源葡萄糖補料培養(yǎng)基，發(fā)酵至38小時結(jié)束；
[0042]5) pH控制:根據(jù)需要用質(zhì)量百分濃度20%的氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液液pH控制在6.0-6.5之間；
[0043]6)至芽孢形成率大于等于90%時，結(jié)束發(fā)酵；
[0044]7)將發(fā)酵液加熱到35°C時進入濃縮器，在真空度為_95kpa下進行濃縮，濃縮至含固量達到10% -20%時，開始出料；從蒸發(fā)室出來的二次蒸汽經(jīng)壓縮機壓縮，壓力溫度升高至100°C _115°C，送至加熱室當(dāng)加熱蒸汽使用，加熱發(fā)酵液至35°C，加熱蒸汽本身冷凝成水。整個過程中，二次蒸汽得到了充分利用，極大的提高了熱效率。
[0045]8)濃縮發(fā)酵液用多級低溫噴霧流化干燥設(shè)備進行干燥造粒，顆粒經(jīng)過分選，符合顆粒要求直接出塔，得CFU不少于1.5X 1ltl個的多粘芽孢桿菌產(chǎn)品；所述進風(fēng)溫度130°C，出口溫度60°C ；
[0046]9)尾氣處理:干燥制粒尾氣通過收集系統(tǒng)收集，然后通過化學(xué)洗滌塔，與化學(xué)氧化劑如雙氧水，次氯酸鈉發(fā)生氣-液接觸，這個過程中氣相中的臭味成分轉(zhuǎn)移到液相，并被化學(xué)氧化劑氧化，從而達到去味、脫氨氮、脫硫化氫等目的，然后有組織達標排放。
[0047]實施例2、同實施例1，不同的是，
[0048]I) 一級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖1.5%,牛肉膏3%,蛋白胨
0.5%，氯化鈉1%，培養(yǎng)基pH為6.5 ;115°C濕熱滅菌30min，接種后30°C培養(yǎng)12h。
[0049]2) 二級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖1.5%，酵母抽提物1%，蛋白胨2%，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉1%，硫酸鎂0.1%，培養(yǎng)基pH調(diào)為6.5 ;115°C濕熱滅菌30min，接種后30°C培養(yǎng)12h。
[0050]3)發(fā)酵所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖I %，豆柏I %，玉米漿2 %，酵母粉2.5 %，蛋白胨3 %，麥芽浸粉2 %，磷酸氫二鉀0.01 %，硫酸鎂0.1 %，硫酸錳0.002 %，培養(yǎng)基pH為6.5 ;115°C濕熱滅菌30min，接種后32°C培養(yǎng)40h。
[0051]4)補料:當(dāng)發(fā)酵至17h開始流加由葡萄糖20%、水80%配制成的碳源葡萄糖補料培養(yǎng)基，發(fā)酵至42小時結(jié)束；
[0052]6)使用降膜蒸發(fā)器將發(fā)酵液加熱到60°C時進入真空薄膜濃縮器，在真空度為-70kpa下進行蒸發(fā)，然后依次進入二效和三效蒸發(fā)器，濃縮至含固量達到15%-25%時，開始出料。
[0053]8)濃縮發(fā)酵液用多級低溫噴霧流化干燥設(shè)備進行干燥造粒，顆粒經(jīng)過分選，符合顆粒要求直接出塔；所述進風(fēng)溫度180°C，出口溫度80°C ；
[0054]本實施例所制的多粘芽孢桿菌干粉活菌制劑，經(jīng)檢驗每克菌粉CFU不少于
1.5X1010 個。
[0055]實施例3、同實施例1，不同的是，
[0056]I) 一級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖2%,牛肉膏0.5%,蛋白胨2%，氯化鈉1%，培養(yǎng)基pH為7.0 ;115°C濕熱滅菌30min，接種后30。。培養(yǎng)12h。
[0057]2) 二級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖1.5%，酵母抽提物3%，蛋白胨2.5%，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉1%，硫酸鎂0.1%，培養(yǎng)基pH調(diào)為7.0 ;115°C濕熱滅菌30min，接種后30°C培養(yǎng)12h。
[0058]3)發(fā)酵所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖1.5%，豆柏3%，玉米漿1%，酵母粉I %，蛋白胨3 %，麥芽浸粉2 %，磷酸氫二鉀0.05 %，硫酸鎂0.2 %，硫酸錳0.002 %，培養(yǎng)基pH為7.0 ; 115 °C濕熱滅菌30min，接種后32°C培養(yǎng)40h。
[0059]4)補料:當(dāng)發(fā)酵至14h開始流加由葡萄糖50%、水50%配制成的碳源葡萄糖補料培養(yǎng)基，發(fā)酵至40小時結(jié)束；
[0060]6)使用板式蒸發(fā)濃縮器濃縮發(fā)酵液:將發(fā)酵液加熱到50°C時進入板式蒸發(fā)濃縮器進行濃縮，在真空度_86kp下進行蒸發(fā)濃縮。然后當(dāng)發(fā)酵液濃縮至含固量達到15%-25%時，開始出料。
[0061]8)濃縮發(fā)酵液用多級低溫噴霧流化干燥設(shè)備進行干燥造粒，顆粒經(jīng)過分選，符合顆粒要求直接出塔；所述進風(fēng)溫度150°C，出口溫度70°C ；
[0062]本實施例所制的多粘芽孢桿菌干粉活菌制劑，經(jīng)檢驗每克菌粉CFU不少于
1.5X1010 個。
[0063]9)尾氣處理:發(fā)酵尾氣、干燥制粒尾氣通過收集系統(tǒng)收集，然后通過等離子體反應(yīng)區(qū)，該區(qū)富含極高化學(xué)活性的物質(zhì)，如高能電子，離子，自由基和激發(fā)態(tài)分子等，廢氣中的污染物質(zhì)與這些高能量物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，在極短時間內(nèi)發(fā)生分解，從而達到去味、脫氨氮、脫硫化氫等目的，然后有組織達標排放。
[0064]實施例4:(以40m3發(fā)酵罐為例)，同實施例1，不同的是
[0065]I) 一級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖2.5%,牛肉膏0.5%,蛋白胨3%，氯化鈉0.5%，培養(yǎng)基pH為7.5 ;
[0066]2) 二級種子培養(yǎng):在400L發(fā)酵罐中裝有300L 二級種子培養(yǎng)基，二級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖0.5 %，酵母抽提物0.5 %，蛋白胨2.5 %，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉0.8%，硫酸鎂0.08%，培養(yǎng)基pH調(diào)為7.5 ;
[0067]3)發(fā)酵:在40m3發(fā)酵罐中裝有30m3多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，接入300L 二級種子。發(fā)酵所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖2 %，豆柏I %，玉米漿I %，酵母粉3 %，蛋白胨3 %，麥芽浸粉2 %，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸鎂0.2%，硫酸錳0.002 %，培養(yǎng)基pH為7.5 ;
[0068]4)補料:當(dāng)發(fā)酵至16h開始流加由葡萄糖40%、水60%配制成的碳源葡萄糖補料培養(yǎng)基，發(fā)酵至39小時結(jié)束；
[0069]8)濃縮發(fā)酵液用多級低溫噴霧流化干燥設(shè)備進行干燥造粒，顆粒經(jīng)過分選，符合顆粒要求直接出塔；所述進風(fēng)溫度140°C，出口溫度60°C ；
[0070]本實施例所制的多粘芽孢桿菌干粉活菌制劑，經(jīng)檢驗每克菌粉CFU不少于
1.5X1010 個。
[0071]9)尾氣處理:發(fā)酵尾氣、干燥制粒尾氣通過收集系統(tǒng)收集，然后通過等離子體反應(yīng)區(qū)，該區(qū)富含極高化學(xué)活性的物質(zhì)，如高能電子，離子，自由基和激發(fā)態(tài)分子等，廢氣中的污染物質(zhì)與這些高能量物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，在極短時間內(nèi)發(fā)生分解，從而達到去味、脫氨氮、脫硫化氫等目的，然后有組織達標排放。
[0072]實施例5:(以40m3發(fā)酵罐為例)同實施例1，不同的是，
[0073]I) 一級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨
2.5%，氯化鈉0.5%，培養(yǎng)基pH為7.5 ;
[0074]2) 二級種子培養(yǎng):在400L發(fā)酵罐中裝有300L 二級種子培養(yǎng)基，二級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖0.5%，酵母抽提物2.5%，蛋白胨0.5%，磷酸氫二鉀
0.02%,氯化鈉0.5%，硫酸鎂0.02%，培養(yǎng)基pH調(diào)為7.5 ;
[0075]3)發(fā)酵:在40m3發(fā)酵罐中裝有30m3多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，接入300L 二級種子。發(fā)酵所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖1.5 %，豆柏2.5 %，玉米漿I %，酵母粉2.5%，蛋白胨I %，麥芽浸粉I %，磷酸氫二鉀0.01%，硫酸鎂0.1%，硫酸錳0.002 %，培養(yǎng)基pH為7.5 ；
[0076]4)補料:當(dāng)發(fā)酵至13h開始流加由葡萄糖30%、水70%配制成的碳源葡萄糖補料培養(yǎng)基，發(fā)酵至41小時結(jié)束；
[0077]6)使用降膜蒸發(fā)器將發(fā)酵液加熱到45 °C時進入真空薄膜濃縮器，在真空度為-90kpa下進行蒸發(fā)，然后依次進入二效和三效蒸發(fā)器，濃縮至含固量達到15%-25%時，開始出料。
[0078]本實施例所制的多粘芽孢桿菌干粉活菌制劑，經(jīng)檢驗每克菌粉CFU不少于
1.5X1010 個。
[0079]9)尾氣處理:發(fā)酵尾氣、干燥制粒尾氣通過收集系統(tǒng)收集，然后通過高能UV紫外線反應(yīng)區(qū)，該區(qū)的空氣中的氧分子會被分解產(chǎn)生游離氧，游離氧不穩(wěn)定與氧分子結(jié)合產(chǎn)生臭氧。臭氧對有機物有極強的氧化作用，能與廢氣中的有機污染物產(chǎn)生分解氧化反應(yīng)，使其降解轉(zhuǎn)化成低分子化合物、水和二氧化碳，從而達到去味、脫氨氮、脫硫化氫等目的，然后有組織達標排放。
[0080]實施例6:(以40m3發(fā)酵罐為例)
[0081]I) 一級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖2.5%,牛肉膏1.5%,蛋白胨2.5%，氯化鈉0.5%，培養(yǎng)基pH為7.5 ;
[0082]2) 二級種子培養(yǎng):在400L發(fā)酵罐中裝有300L 二級種子培養(yǎng)基，二級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖2.5%，酵母抽提物1.6%，蛋白胨1.7%，磷酸氫二鉀
0.02%,氯化鈉0.5%，硫酸鎂0.02%，培養(yǎng)基pH調(diào)為7.5 ;
[0083]3)發(fā)酵:在40m3發(fā)酵罐中裝有30m3多粘芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，接入300L 二級種子。發(fā)酵所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖2%，豆柏1%，玉米漿3%，酵母粉2.5%，蛋白胨I %，麥芽浸粉2%，磷酸氫二鉀0.01%，硫酸鎂0.1%，硫酸錳0.002%，培養(yǎng)基pH為7.5 ；
[0084]5)結(jié)束發(fā)酵:至芽孢形成率大于等于90%時，結(jié)束發(fā)酵；
[0085]6)使用板式蒸發(fā)濃縮器濃縮發(fā)酵液:將發(fā)酵液加熱到60°C時進入板式蒸發(fā)濃縮器進行濃縮，在真空度_70kp下進行蒸發(fā)。濃縮至含固量達到15% -25%時，開始出料。
[0086]本實施例所制的多粘芽孢桿菌干粉活菌制劑，經(jīng)檢驗每克菌粉CFU不少于
1.5X1010 個。
[0087]9)發(fā)酵尾氣、干燥制粒尾氣通過收集系統(tǒng)收集，然后通過高能UV紫外線反應(yīng)區(qū)，該區(qū)的空氣中的氧分子會被分解產(chǎn)生游離氧，游離氧不穩(wěn)定與氧分子結(jié)合產(chǎn)生臭氧。臭氧對有機物有極強的氧化作用，能與廢氣中的有機污染物產(chǎn)生分解氧化反應(yīng)，使其降解轉(zhuǎn)化成低分子化合物、水和二氧化碳，從而達到去味、脫氨氮、脫硫化氫等目的，然后有組織達標排放。
【權(quán)利要求】
1.一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝，其特征在于具體步驟如下: 1)一級種子培養(yǎng):5000ml三角瓶中裝有2000ml —級種子培養(yǎng)基，115 °C -121 V濕熱滅菌15-30min，取1ml多粘芽孢桿菌活菌凍干管菌種接種于一級種子培養(yǎng)基中，在28°C -30°C培養(yǎng)12?16h ;—級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖0.5 % -2.5 %，牛肉膏0.5 % -3 %，蛋白胨0.5 % -3 %，氯化鈉0.5 % -1 %，培養(yǎng)基pH為6.5-7.5 ； 2)二級種子培養(yǎng):在400L發(fā)酵罐中裝有150L或300L 二級種子培養(yǎng)基，115°C -121 °C濕熱滅菌15_30min，將3000ml長好的一級種子接種于二級種子培養(yǎng)基中；在281:-301:培養(yǎng)12?16h ;二級種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖0.5% -2.5%，酵母抽提物0.5% _3%，蛋白胨0.5% -2.5%，磷酸氫二鉀0.02% -0.05%，氯化鈉0.5% _1%，硫酸鎂0.02% -0.1%，培養(yǎng)基 pH 調(diào)為 6.5-7.5 ； 3)發(fā)酵:在5m3或40m3發(fā)酵罐中裝有4000L或30m3多粘芽孢桿菌活菌發(fā)酵培養(yǎng)基，115°C _121°C濕熱滅菌15-30min，將150L或300L長好的二級種子接種于多粘芽孢桿菌活菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制罐壓0.02Mpa-0.05Mpa，在28°C _32°C培養(yǎng)40_46h ;發(fā)酵所用培養(yǎng)基的原料及用量為:葡萄糖1% _2%，豆柏1% -3%，玉米漿1% _3%，酵母粉1% -3%，蛋白胨I % -3 %，麥芽浸粉I % -2 %，磷酸氫二鉀0.01 % -0.05 %，硫酸鎂0.1 % -0.2 %，硫酸錳0.002 %，培養(yǎng)基 pH 為 6.5-7.5 ； 4)補料:當(dāng)發(fā)酵至12-17h開始流加由葡萄糖20%-60%、水40% -80%配制成的碳源葡萄糖補料培養(yǎng)基，發(fā)酵至38-42小時結(jié)束； 5)pH控制:根據(jù)需要用質(zhì)量百分濃度18%-24%的氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液液pH控制在6.0-6.5之間； 6)至芽孢形成率大于等于90%時，結(jié)束發(fā)酵； 7)將發(fā)酵液加熱到35°C_60°C時進入濃縮器，在真空度為_70kpa?_95kpa下進行濃縮，濃縮至含固量達到10% -25%時，開始出料； 8)濃縮發(fā)酵液用多級低溫噴霧流化干燥設(shè)備進行干燥造粒，顆粒經(jīng)過分選，符合顆粒要求直接出塔，得CFU不少于1.5 X 101°個的多粘芽孢桿菌產(chǎn)品；所述進風(fēng)溫度130-180°C，出口溫度60-80°C ； 9)尾氣處理:采用化學(xué)氧化、等離子照射或紫外照射去味、脫氨氮或脫硫化氫處理后排放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝，其特征在于一、二級種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基經(jīng)濕熱滅菌后，培養(yǎng)基要迅速降至30°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝，其特征在于濃縮器為MVR濃縮器、降膜蒸發(fā)器或板式蒸發(fā)濃縮器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多粘芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝，其特征在于采用MVR濃縮器，從蒸發(fā)室出來的二次蒸汽經(jīng)壓縮機壓縮，壓力溫度升高至100°C _115°C，送至加熱室當(dāng)加熱蒸汽使用，加熱發(fā)酵液至進料溫度，加熱蒸汽本身冷凝成水。
【文檔編號】C12N1/20GK104263675SQ201410436901
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】饒犇, 周榮華, 廖先清, 陳偉, 劉芳, 黃大野, 明京, 張光陽, 楊自文 申請人:湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心