一種乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。它是將乳腺組織先用組織勻漿機(jī)處理成乳糜狀的組織塊，然后將組織塊依次接種在標(biāo)定的培養(yǎng)瓶底壁處進(jìn)行培養(yǎng)，2-3天后每個(gè)組織塊周?chē)谐衫w維細(xì)胞游離出來(lái)并貼壁生長(zhǎng)，4-5天后上皮細(xì)胞開(kāi)始游離出來(lái)貼壁生長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞被驅(qū)向上皮細(xì)胞外周并圍繞其生長(zhǎng)；這時(shí)加入胰蛋白酶將貼壁的成纖維細(xì)胞消化下來(lái)，終止消化后繼續(xù)培養(yǎng)，5-7天后有約80-90％細(xì)胞貼壁，得到較高純度的乳腺上皮細(xì)胞。與現(xiàn)有的培養(yǎng)方法相比，該方法在培養(yǎng)初期對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行消化處理，這時(shí)僅有少量的上皮細(xì)胞游離生長(zhǎng)(消化處理時(shí)可完全去掉)，之后游離生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞不受消化處理?yè)p傷，細(xì)胞活性和純度都非常高。
【專利說(shuō)明】一種乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺是哺乳動(dòng)物所特有的器官，具有合成和分泌乳汁的功能，是蛋白質(zhì)合成十分 活躍的場(chǎng)所。研究表明，乳蛋白編碼的基因其表達(dá)具有明顯的組織特異性和階段特異性， 即乳蛋白的合成僅在乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行，并且發(fā)生在哺乳母體即將分娩之前和分娩之后 的相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間的泌乳期中，所以乳腺上皮細(xì)胞被公認(rèn)為是制作乳腺生物反應(yīng)器的靶細(xì) 胞。即利用體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，通過(guò)構(gòu)建特異性表達(dá)載體生產(chǎn)醫(yī)療上價(jià)值極大的藥 用蛋白或其他蛋白質(zhì)。另外，乳腺上皮細(xì)胞也是研究乳蛋白基因表達(dá)、調(diào)控及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的 有利工具，它從細(xì)胞水平上對(duì)泌乳機(jī)制進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步研究各種因素對(duì)乳腺發(fā)育 及泌乳過(guò)程的影響奠定了基礎(chǔ)。
[0003] 人們對(duì)乳腺細(xì)胞的培養(yǎng)始于上世紀(jì)五、六十年代，最初利用膠原酶消化乳腺組織， 將乳腺細(xì)胞從中分離出來(lái)直接培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)上皮細(xì)胞所占比例很大，然而隨著傳 代的不斷進(jìn)行，上皮細(xì)胞逐漸被生長(zhǎng)較快的成纖維細(xì)胞所取代。為了解決培養(yǎng)的乳腺上皮 細(xì)胞中混有成纖維細(xì)胞的問(wèn)題，McGrath等將含乳腺上皮細(xì)胞的膠原酶消化液進(jìn)行密度梯 度離心，去除消化液中的成纖維細(xì)胞、脂肪顆粒、細(xì)胞碎片、DNA纖維等成分（McGrath MF. A novel system for mammary epithelial cell culture. J Dairy Sci. 1987, 70:1967-80), 但使用這種方法來(lái)分離乳腺上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生不可逆地機(jī)械性損傷。Wang等試圖通過(guò)細(xì) 胞克隆得到純凈的乳腺上皮細(xì)胞（Wang S,Haslam SZ. Serum-free primary culture of normal mouse mammary epithelial and stromal cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1994, 30A:859-66)，但正常乳腺上皮細(xì)胞的克隆率極低，要獲得上皮細(xì)胞的單細(xì)胞克 隆非常困難，即使有克隆出現(xiàn)，這些克隆極易老化，失去增殖能力。Zavizion等利用放射性 射線照射的方法去除成纖維細(xì)胞，即用小片鉛板擋住需保留的上皮細(xì)胞區(qū)域，讓射線照射 上皮細(xì)胞外的區(qū)域。這樣未受到射線照射的細(xì)胞便存活下來(lái)，照射過(guò)的細(xì)胞便失去增殖能 力，逐漸衰退、死亡（Zavizion B, van Duffelen M, Schaeffer W, Politis I. Establishment and characterization of a bovine mammary epithelial cell line with unique properties. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1996, 32:138-48)，但這種方法操作起來(lái)非常 困難，因?yàn)槿橄偕掀ぜ?xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域不規(guī)則、大小不一，而鉛板的尺寸、形狀都是固定的， 所以很難控制鉛板能完全遮擋住上皮細(xì)胞，當(dāng)然成纖維細(xì)胞也不可能完全被遮擋住，這樣 造成實(shí)際的純化效果并不理想。也有報(bào)道提出由于乳汁中含有上皮細(xì)胞，可低速離心然 后收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行培養(yǎng)（Buehring GC. Culture of mammary epithelial cells from bovine milk. J. Dairy Sci. 1990, 73:956-63)，但乳汁中的上皮細(xì)胞通常是從乳腺內(nèi)膜上 自然脫落下來(lái)，細(xì)胞狀態(tài)或活力很差，所以培養(yǎng)后細(xì)胞增殖能力很低，很難維持生長(zhǎng)。近年 來(lái)研究人員在利用膠原酶將乳腺組織消化成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)成纖維細(xì)胞 和上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶敏感性不同及貼壁時(shí)間差異在消化傳代時(shí)逐步將成纖維細(xì)胞去除， 但這種方法由于最初是利用膠原酶分離乳腺組織，所以獲得的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞和上皮細(xì) 胞的混合群體，培養(yǎng)后也是兩種細(xì)胞相互混雜生長(zhǎng)。這就造成消化傳代時(shí)很難完全將成纖 維細(xì)胞去除，而且多次消化傳代造成乳腺上皮細(xì)胞活力下降和生物學(xué)功能降低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法存在的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種乳腺上 皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法根據(jù)乳腺組織塊中成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特 性，采取不經(jīng)膠原酶消化，而是直接將組織塊接種培養(yǎng)，將先游離出來(lái)生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞利 用胰蛋白酶消化徹底去掉，再培養(yǎng)后游離出來(lái)生長(zhǎng)的細(xì)胞即為上皮細(xì)胞。與上述幾種培養(yǎng) 方法相比，該方法在培養(yǎng)初期對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行消化處理，這時(shí)僅有少量的上皮細(xì)胞游離 生長(zhǎng)（消化處理時(shí)可完全去掉），之后游離生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞不受消化處理?yè)p傷，所以細(xì)胞活 性和純度都非常高。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，將乳腺組織 先用組織勻漿機(jī)處理成乳糜狀的組織塊，然后將組織塊依次接種在標(biāo)定的培養(yǎng)瓶底壁處進(jìn) 行培養(yǎng)；2-3天后每個(gè)組織塊周?chē)谐衫w維細(xì)胞游離出來(lái)并貼壁生長(zhǎng)，4-5天后上皮細(xì)胞 開(kāi)始游離出來(lái)貼壁生長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞被驅(qū)向上皮細(xì)胞外周并圍繞其生長(zhǎng)；這時(shí)加入0. 25% 胰蛋白酶將貼壁的成纖維細(xì)胞消化下來(lái)（控制加入胰蛋白酶的量，使其消化時(shí)僅將貼壁 的成纖維細(xì)胞層去掉，而不會(huì)對(duì)組織塊進(jìn)行消化處理），終止消化后繼續(xù)培養(yǎng)，5-7天后有 80-90 %細(xì)胞貼壁，得到較高純度的乳腺上皮細(xì)胞。
[0006] 具體包括以下步驟：
[0007] (1)培養(yǎng)液配制
[0008] 細(xì)胞培養(yǎng)液：按照每450-500毫升的DMEM/F12培養(yǎng)液加入50-60毫升的胎牛血 清（FBS)、2-3毫升的青鏈霉素混合液、0. 12-0. 15g?；撬岷?. 3-0. 5毫升表皮生長(zhǎng)因子 (10 μ g/ml)的比例配制細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值為6. 9-7. 2 ;然后經(jīng)0. 22微米濾膜過(guò)濾后， 放置4°C保存；
[0009] (2)培養(yǎng)瓶處理
[0010] 將T25培養(yǎng)瓶的底壁朝上平放，然后在底壁上劃出橫向和縱向間距均為0. 4cm的 網(wǎng)格線，每個(gè)交匯點(diǎn)處即是組織塊的接種點(diǎn)；
[0011] (3)乳腺組織的取樣與勻漿處理
[0012] 首先將乳腺組織用含1 %青鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗，以徹底清除為組織中攜帶 的乳汁；然后將乳腺組織剪成〇. 5-0. 7cm3的塊狀，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾2-3 下，讓組織塊稍微干燥后，放入組織勻漿機(jī)的無(wú)菌試管內(nèi)，180-200轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理2-3分 鐘，這時(shí)組織塊成大小均一、體積為0. 8-lmm3的乳糜粒狀的組織塊；
[0013] ⑷乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)
[0014] 將乳糜粒狀的組織塊依次接種到培養(yǎng)瓶底壁的接種點(diǎn)處；然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入 4-5毫升細(xì)胞培養(yǎng)液，平放入含5% C02、37°C培養(yǎng)箱中，0. 5-1小時(shí)后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，讓 培養(yǎng)液緩慢進(jìn)入培養(yǎng)瓶底壁后立即放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；2-3天后每個(gè)組織塊有成纖維細(xì) 胞游離出來(lái)并貼壁生長(zhǎng)，4-5天后上皮細(xì)胞開(kāi)始游離出來(lái)貼壁生長(zhǎng)并逐漸形成形狀大致規(guī) 則的圓形細(xì)胞區(qū)域，成纖維細(xì)胞被驅(qū)向這片細(xì)胞區(qū)域外周并圍繞其生長(zhǎng)，這時(shí)加入〇. 8-1. 0 毫升的0.25%胰蛋白酶（含0.05% EDTA)輕輕混勻覆蓋培養(yǎng)瓶底壁后棄掉，再重新加入 0. 4-0. 5毫升0. 25 %胰蛋白酶（含0. 05 % EDTA)，然后放在37°C培養(yǎng)箱中，在相差顯微鏡下 每隔1-2分鐘觀察一次，待組織塊外周所有貼壁的成纖維細(xì)胞都徹底消化下來(lái)后加入5-6 毫升細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化并棄掉，再加入5-6毫升PBS液輕輕漂洗殘留的成纖維細(xì)胞3-4 次；之后加入細(xì)胞培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；5-7天后有80-90%細(xì)胞貼壁，此即為乳腺 上皮細(xì)胞。
[0015] 備注：在培養(yǎng)至4-5天時(shí)采用胰蛋白酶消化，理論上可以除去所有的成纖維細(xì)胞； 如果有個(gè)別的組織塊的細(xì)胞游離速度較慢，胰蛋白酶消化結(jié)束后，組織塊周?chē)坞x出來(lái)的 還是成纖維細(xì)胞，用細(xì)胞刮將組織塊連同其周?chē)某衫w維細(xì)胞直接刮掉。最后加入培養(yǎng)液 放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：（1)本發(fā)明先將乳腺組織勻漿成乳糜粒，這種處理不僅比 傳統(tǒng)的徒手剪碎省時(shí)、省力，而且使單個(gè)組織粒大小更均勻一致，接種到培養(yǎng)瓶底壁后從每 個(gè)乳糜粒游離出來(lái)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度基本一致，這樣既有利于判定并控制合適的胰蛋白酶處 理時(shí)間，又既能保證外周的成纖維細(xì)胞完全被消化下來(lái)。（2)本發(fā)明一改傳統(tǒng)培養(yǎng)中先用 膠原酶將乳腺組織消化成單個(gè)細(xì)胞的做法，而是使用組織勻漿機(jī)將乳腺組織處理成細(xì)小的 乳糜粒直接接種，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域存在明顯的界限，即以乳糜 粒為中心，上皮細(xì)胞基本按圓形區(qū)域生長(zhǎng)，圍繞外周的是成纖維細(xì)胞及極少量的其他雜細(xì) 胞（如脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等），所以在上皮細(xì)胞剛游離出來(lái)生長(zhǎng)時(shí)加入胰蛋白酶，將外周 的成纖維細(xì)胞消化下來(lái)漂洗去掉，繼續(xù)培養(yǎng)后游離出來(lái)生長(zhǎng)的是上皮細(xì)胞，這些新生長(zhǎng)的 上皮細(xì)胞不受消化處理的損傷，所以活性非常高。（3)本發(fā)明嚴(yán)格控制加入胰蛋白酶的量， 所以消化時(shí)僅將貼壁的成纖維細(xì)胞層（有時(shí)也有少許的上皮細(xì)胞）去掉，而不會(huì)對(duì)組織塊 進(jìn)行消化處理，這樣不僅可以避免在后續(xù)培養(yǎng)中混入雜細(xì)胞，而且可以保持組織塊的位置 不動(dòng)，進(jìn)而保證在外周的成纖維細(xì)胞去掉后重新生長(zhǎng)的全部為上皮細(xì)胞。（4)本發(fā)明在培 養(yǎng)液中添加促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的能量物質(zhì)牛磺酸和表皮生長(zhǎng)因子，有利于維持乳腺上皮細(xì)胞 活性，保持較高的增殖速度。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為組織塊在培養(yǎng)瓶底壁的接種位置示意圖；其中，1、組織塊，2、劃線，3、培養(yǎng) 瓶底壁；4、瓶口；
[0018] 圖2為乳腺上皮細(xì)胞采用實(shí)施例1的方法培養(yǎng)6天后的100 X照片；
[0019] 圖3為乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行角蛋白18單克隆抗體免疫熒光染色。A指示區(qū)（白色） 為細(xì)胞核，B指示區(qū)為角蛋白18陽(yáng)性。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 1、培養(yǎng)液配制
[0022] 將50毫升FBS、2. 5毫升青鏈霉素混合液[青霉素-鏈霉素混合液（100X)，青霉 素含量為l0000U/ml，鏈霉素的含量為10mg/ml]、0. 15克?；撬岷?. 4ml的表皮生長(zhǎng)因子 (10 μ g/ml)溶解在450毫升DMEM/F12培養(yǎng)液中，經(jīng)0. 22微米濾膜過(guò)濾后分裝到滅菌的50 毫升離心管中，每管40毫升，放置4°C保存。細(xì)胞培養(yǎng)前半小時(shí)將兩管共80毫升培養(yǎng)液放 在37 °C水浴鍋中預(yù)熱。
[0023] 2、培養(yǎng)瓶處理
[0024] 將無(wú)菌包裝的T25培養(yǎng)瓶在超凈臺(tái)內(nèi)取出，培養(yǎng)瓶底壁朝上平放，用比例尺從底 壁靠瓶底處開(kāi)始每隔〇. 4厘米用記號(hào)筆劃一橫線直到接近瓶口處，然后從培養(yǎng)瓶底壁一側(cè) 開(kāi)始按每隔〇. 4厘米用記號(hào)筆劃一縱線直到底壁另一側(cè)，這樣每個(gè)交匯點(diǎn)處即是組織塊的 接種點(diǎn)（如圖1所示）。
[0025] 3、乳腺組織的取樣與勻漿處理
[0026] 乳腺組織必須選自處于泌乳中后期、不攜帶傳染性疾病及乳腺疾病的健康個(gè)體。 取樣前按常規(guī)消毒處理乳房，然后切取乳房后側(cè)乳溝處乳腺組織塊放在含1%青鏈霉素的 磷酸鹽緩沖液（PBS)中帶回實(shí)驗(yàn)室。在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)首先將乳腺組織放在平皿中用含1% 青鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗，直到將組織中攜帶的乳汁徹底清除為止；然后將乳腺組織修 剪成0. 6cm3的塊狀，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾3下，讓組織塊稍微干燥后，放入 組織勻漿機(jī)的無(wú)菌試管內(nèi)，190轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理3分鐘，這時(shí)組織塊成大小均一、體積為 0. 8mm3的乳糜粒。
[0027] 4、乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)
[0028] 用吸管將乳糜粒從無(wú)菌試管內(nèi)轉(zhuǎn)移到平皿中，輕輕攤成薄薄的一層，用尖端微細(xì) 的眼科鑷夾取乳糜粒，依次接種到培養(yǎng)瓶底壁劃線的交匯處；然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入5毫升 細(xì)胞培養(yǎng)液，平放入含5% C02、37°C培養(yǎng)箱中，0. 5小時(shí)后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液緩 慢進(jìn)入培養(yǎng)瓶底壁后立即放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2天后每個(gè)乳糜粒有成纖維細(xì)胞游離出來(lái) 并貼壁生長(zhǎng)，4天后上皮細(xì)胞開(kāi)始游離出來(lái)貼壁生長(zhǎng)并逐漸形成形狀大致規(guī)則的圓形細(xì)胞 區(qū)域，成纖維細(xì)胞被驅(qū)向這片細(xì)胞區(qū)域外周并圍繞其生長(zhǎng)。這時(shí)加入0. 8毫升0. 25%胰蛋 白酶（含0.05% EDTA)輕輕混勻覆蓋培養(yǎng)瓶底壁后棄掉，再重新加入0.5毫升0.25%胰蛋 白酶（含0. 05% EDTA)，然后放在37°C培養(yǎng)箱中，在相差顯微鏡下每隔1分鐘觀察一次，待 組織塊外周所有成纖維細(xì)胞都徹底消化下來(lái)后加入5毫升細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化并棄掉，再 加入6毫升PBS液輕輕漂洗殘留的成纖維細(xì)胞4次，之后加入細(xì)胞培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱繼續(xù) 培養(yǎng)。后續(xù)如果有少許組織塊周?chē)坞x出來(lái)的還是成纖維細(xì)胞，用細(xì)胞刮將組織塊連同其 周?chē)某衫w維細(xì)胞直接刮掉。最后加入培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6天后有約80-90%細(xì) 胞貼壁（如圖2所示）。采用上皮細(xì)胞特征表達(dá)蛋白即角蛋白18單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞 進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角蛋白18在乳腺上皮細(xì)胞中均呈陽(yáng)性（如圖3所示）。
【權(quán)利要求】
1. 一種乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，將乳腺組織先用組織勻漿機(jī)處理成 乳糜狀的組織塊，然后將組織塊依次接種在標(biāo)定的培養(yǎng)瓶底壁處進(jìn)行培養(yǎng)；2-3天后每個(gè) 組織塊周?chē)谐衫w維細(xì)胞游離出來(lái)并貼壁生長(zhǎng)，4-5天后上皮細(xì)胞開(kāi)始游離出來(lái)貼壁生長(zhǎng)， 成纖維細(xì)胞被驅(qū)向上皮細(xì)胞外周并圍繞其生長(zhǎng)；這時(shí)加入〇. 25%胰蛋白酶將貼壁的成纖 維細(xì)胞消化下來(lái)，終止消化后繼續(xù)培養(yǎng)，5-7天后有80-90%細(xì)胞貼壁，得到較高純度的乳 腺上皮細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，所述細(xì)胞培養(yǎng)采用 的細(xì)胞培養(yǎng)液為：按照每450-500ml的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入50-60ml的胎牛血清、2-3ml 的青鏈霉素混合液、〇. 12-0. 15g?；撬岷?. 3-0. 5ml表皮生長(zhǎng)因子的比例配制細(xì)胞培養(yǎng) 液，調(diào)節(jié)PH值為6. 9-7. 2 ;然后經(jīng)0. 22微米濾膜過(guò)濾后，放置4°C保存。
3. 如權(quán)利要求1所述的乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，所述加入0. 25%胰 蛋白酶將貼壁的成纖維細(xì)胞消化下來(lái)，終止消化后繼續(xù)培養(yǎng)的具體步驟如下：采用T25培 養(yǎng)瓶時(shí)，加入0. 8-1. 0毫升的0. 25%胰蛋白酶輕輕混勻覆蓋培養(yǎng)瓶底壁后棄掉，再重新加 入0. 4-0. 5毫升0. 25 %胰蛋白酶，然后放在37°C培養(yǎng)箱中，在相差顯微鏡下每隔1-2分鐘 觀察一次，待組織塊外周所有貼壁的成纖維細(xì)胞都徹底消化下來(lái)后加入5-6毫升細(xì)胞培養(yǎng) 液終止消化并棄掉，再加入5-6毫升PBS液輕輕漂洗殘留的成纖維細(xì)胞3-4次；所述0. 25 % 胰蛋白酶中含有〇. 05%的EDTA。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是， (1) 細(xì)胞培養(yǎng)液配制 細(xì)胞培養(yǎng)液：按照每450-500ml的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入50-60ml的胎牛血清、2-3ml 的青鏈霉素混合液、〇. 12-0. 15g?；撬岷?. 3-0. 5ml表皮生長(zhǎng)因子的比例配制細(xì)胞培養(yǎng) 液，調(diào)節(jié)PH值為6. 9-7. 2 ;然后經(jīng)0. 22微米濾膜過(guò)濾后，放置4°C保存； (2) 培養(yǎng)瓶處理 將T25培養(yǎng)瓶的底壁朝上平放，然后在底壁上劃出橫向和縱向間距均為0. 4cm的網(wǎng)格 線，每個(gè)交匯點(diǎn)處即是組織塊的接種點(diǎn)； (3) 乳腺組織的取樣與勻漿處理 首先將乳腺組織用含1 %青鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗清除組織中攜帶的乳汁；然后將 乳腺組織剪成〇. 5-0. 7cm3的塊狀，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾2-3下，放入組織勻 漿機(jī)的無(wú)菌試管內(nèi)，180-200轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理2-3分鐘，這時(shí)組織塊成大小均一、體積為 0. 8-lmm3的乳糜粒狀的組織塊； (4) 乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng) 將乳糜粒狀的組織塊依次接種到培養(yǎng)瓶底壁的接種點(diǎn)處；然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入4-5毫 升細(xì)胞培養(yǎng)液，平放入含5% C02、37°C培養(yǎng)箱中，0. 5-1小時(shí)后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng) 液緩慢進(jìn)入培養(yǎng)瓶底壁后立即放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；2-3天后每個(gè)組織塊有成纖維細(xì)胞游 離出來(lái)并貼壁生長(zhǎng)，4-5天后上皮細(xì)胞開(kāi)始游離出來(lái)貼壁生長(zhǎng)并逐漸形成形狀大致規(guī)則的 圓形細(xì)胞區(qū)域，成纖維細(xì)胞被驅(qū)向這片細(xì)胞區(qū)域外周并圍繞其生長(zhǎng)，這時(shí)加入〇. 8-1. 0毫 升的0. 25 %胰蛋白酶輕輕混勻覆蓋培養(yǎng)瓶底壁后棄掉，再重新加入0. 4-0. 5毫升0. 25 %胰 蛋白酶，然后放在37°C培養(yǎng)箱中，在相差顯微鏡下每隔1-2分鐘觀察一次，待組織塊外周所 有貼壁的成纖維細(xì)胞都徹底消化下來(lái)后加入5-6毫升細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化并棄掉，再加入 5-6毫升PBS液輕輕漂洗殘留的成纖維細(xì)胞3-4次；5-7天后有80-90%細(xì)胞貼壁，得到較 高純度的乳腺上皮細(xì)胞；所述〇. 25%胰蛋白酶中含有0. 05%的EDTA。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104195100SQ201410438103
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】游偉, 譚秀文, 趙紅波, 劉曉牧, 劉桂芬, 成海建, 劉倚帆, 萬(wàn)發(fā)春, 宋恩亮 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所