白化病模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法和模型豬的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種白化病模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法和模型豬的構(gòu)建方法，該重構(gòu)卵的構(gòu)建方法通過敲除酪氨酸酶基因獲得了白化小型豬的重構(gòu)卵，且將CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)結(jié)合，證明該方法用于構(gòu)建基因修飾豬的高效可行性。獲得TYR基因敲除豬具有典型白化特征，可為人類白化疾病研究提供一種可靠的動(dòng)物模型，且能應(yīng)用于毒性及過敏反應(yīng)的檢測(cè)等多方面，有望成為類似白化小鼠的一種標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
【專利說明】白化病模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法和模型豬的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種白化病模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法 和模型豬的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人類疾病的研究和治療離不開實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。嚙齒類動(dòng)物在基因表達(dá)和各項(xiàng)生理 指標(biāo)方面與人類差異較大，而非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物雖是最接近于人類的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但價(jià)格昂貴， 且存在倫理方面的障礙。豬在體型大小、生理?xiàng)l件、器官發(fā)育和疾病發(fā)展等方面與人類相 似，因此，豬被認(rèn)為是一種合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型?；蛐揎椮i模型有望在人類疾病發(fā)病機(jī)理 研究、治療策略研究中發(fā)揮重要的作用。目前制作基因修飾動(dòng)物的方法中只有胚胎細(xì)胞嵌 合法和轉(zhuǎn)基因克隆法能夠?qū)崿F(xiàn)哺乳動(dòng)物的基因打靶。通過基因修飾胚胎干細(xì)胞和嵌合體 技術(shù)相對(duì)容易獲得基因修飾小鼠，但迄今還沒有辦法獲得具有生殖系嵌合能力的豬胚胎細(xì) 胞，因而基因修飾豬制備要比小鼠困難很多。
[0003] 研究人員一直致力于開發(fā)新方法，實(shí)現(xiàn)高效率的基因定點(diǎn)修飾。最近興起的鋅指 技術(shù)（Zinc Finger Nucleases, ZFNs)和 TALENs (TRNAscription activator-like (TAL) effector nucleases)技術(shù)為基因打祀技術(shù)創(chuàng)造了新的途徑。有研究顯不利用ZFNs 技術(shù)可使豬體細(xì)胞中基因打靶效率從KT6提高到4 %以上（Yang D，Yang H，Li W，et al.Production of PPAR-gamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear tRNAsfer cloning. Cell Research，2011，21 (6) :979-82.)。利用 TALENs技術(shù) 也成功高效率地獲得了大鼠、斑馬魚、爪蟾、小鼠、兔等多種基因打靶動(dòng)物。ZFNs和TALENs 技術(shù)極大地提高了基因打靶效率，但ZFNs和TALENs技術(shù)設(shè)計(jì)和構(gòu)建組裝仍需要有前后序 列特異的要求，經(jīng)大量的優(yōu)化條件以獲得特定的基因打靶，在的獲得性、靈活性、費(fèi)用上均 受至丨J限制（Juillerat，A.，Dubois，G.，Valton，J.，et al. Comprehensive analysis of the specificity of tRNAscription activator-like effector nucleases. Nucleic Acids Res.，2014,42,5390 - 5402.)。
[0004] CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) /CRISPR-associated endonuclease (Cas9))技術(shù)主要基于細(xì)菌的一種 獲得性免疫系統(tǒng)改造而成。該系統(tǒng)由兩部分組成：一是哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化版本的Cas9 蛋白，其帶有一個(gè)核定位信號(hào)，以確保在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的核中表達(dá)；二是引導(dǎo)核糖核酸 (Single-guide RNA，gRNAs)指引Cas9的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列特異性地切割目標(biāo)DNA。較ZFNs 或TALENS而言，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有可擴(kuò)展性和復(fù)用性、能同時(shí)作用于多個(gè)靶位點(diǎn)（Wang H,Yang HjShivalila C S,et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell,2013,153:910 -918)等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具（Mussolino C， Cathomen T.RNA guides genome engineering. NatBiotechnol,2013,31 (3):208_209)。利 用CRISPR/Cas9已獲得多種基因打靶動(dòng)物，如大鼠、小鼠、兔子、猴子等，但均是通過注射 Cas9 mRNA和gRM mRNA到一細(xì)胞胚胎的方法獲得的，這種方法獲得的克隆動(dòng)物多是帶有多 種突變類型的嵌合體，需進(jìn)行多次交配和選擇才能得到單一突變基因型的動(dòng)物。
[0005] 白化病是人和動(dòng)物界的一種常見疾病。目前白化小鼠己成為生物醫(yī)藥研究中常用 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在燒傷、皮膚毒性、過敏檢測(cè)等研究中使用較多，但是迄今為止仍未有基因修 飾型白化豬的報(bào)道。目前野生型小型豬的皮膚和毛發(fā)多為黑色或花色，在研究中不利于觀 察，而野生型白色豬中多見于商品肉用大型豬種，體型大不利于實(shí)驗(yàn)操作，不適合做實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，有必要提供一種白化病模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法和模型豬的構(gòu)建方 法。
[0007] -種白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟一：針對(duì)豬物種的酪氨酸酶基因的第一外顯子的正鏈及互補(bǔ)鏈上滿足 G (N) 19NGG序列模式的序列部分分別設(shè)計(jì)gRNA的識(shí)別序列，分別記為第一 gRNA識(shí)別序列和 第二gRNA識(shí)別序列，其中，所述第一 gRNA識(shí)別序列與所述第一外顯子的正鏈上序列G (N) 19 一致，所述第二gRNA識(shí)別序列與所述第一外顯子的互補(bǔ)鏈上序列G(N)19 -致，N為A、T、C 或G，下標(biāo)19表示N的個(gè)數(shù)；
[0009] 步驟二：分別對(duì)所述第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA識(shí)別序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列，以構(gòu) 建含有所述第一 gRNA識(shí)別序列的第一雙鏈DNA和含有第二gRNA識(shí)別序列的第二雙鏈DNA ;
[0010] 步驟三：分別根據(jù)所述第一雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA設(shè)計(jì)gRNA表達(dá)載體，記 為第一 gRNA載體和第二gRNA載體，其中，所述第一 gRNA載體中含有所述第一雙鏈DNA，所 述第二gRNA載體中含有所述第二雙鏈DNA ;
[0011] 步驟四：將所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)微型豬胎兒成纖維細(xì)胞中，篩選出酪氨酸酶基因敲除的陽性克隆細(xì)胞；
[0012] 步驟五：將所述陽性克隆細(xì)胞注入母豬的去核卵母細(xì)胞中，形成重構(gòu)卵。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟一中，所述豬物種的酪氨酸酶基因的序列為NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中基因編號(hào)為407745所示的序列；所述第一外顯子的正鏈上滿足G (N) 19NGG序列模 式的序列如SEQ ID No. 1所示，所述第一外顯子的互補(bǔ)鏈上滿足G(N)19NGG序列模式的序列 如SEQ ID No. 2所示；所述第一 gRNA識(shí)別序列如SEQ ID No. 3所示，所述第二gRNA識(shí)別序 列如SEQ ID No. 4所示。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟二具體包括如下步驟：
[0015] 分別對(duì)所述第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA識(shí)別序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列；
[0016] 在所述第一 gRNA識(shí)別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 7所示 的序列片段，并在所述第一 gRNA識(shí)別序列的互補(bǔ)序列的5'端加上AAAC序列片段，形成如 SEQID No. 8所示的序列片段，將加有粘性末端的第一 gRNA識(shí)別序列及加有粘性末端的互 補(bǔ)序列進(jìn)行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第一雙鏈DNA ;
[0017] 在所述第二gRNA識(shí)別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 9所示 的序列片段，并在所述第二gRNA識(shí)別序列的互補(bǔ)序列的5'端加上AAAC序列片段，形成如 SEQID No. 10所示的序列片段，將加有粘性末端的第二gRNA識(shí)別序列及加有粘性末端的互 補(bǔ)序列進(jìn)行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第二雙鏈DNA。
[0018] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟三具體包括如下步驟：
[0019] 在gRNA-GFP-Tl質(zhì)粒載體中引入兩個(gè)BbsI酶切位點(diǎn)，得到中間體質(zhì)粒；
[0020] 對(duì)所述中間體質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶BbsI酶切，并將帶有粘性末端的所述第一 雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA對(duì)應(yīng)連接到酶切后的中間體質(zhì)粒上，分別得到所述第一 gRNA 載體和所述第二gRNA載體。
[0021] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟四中，在將所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載 體及含有Cas9切口酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)微型豬胎兒成纖維細(xì)胞之前，還包括分別對(duì) 所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化處理后 擴(kuò)大培養(yǎng)，再提取所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達(dá) 載體的步驟。
[0022] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述重構(gòu)卵的構(gòu)建方法還包括對(duì)得到的重構(gòu)卵進(jìn)行融合和 激活的步驟，具體如下：
[0023] 將所述重構(gòu)卵從去核操作液中轉(zhuǎn)至胚胎培養(yǎng)液中待融合與激活；
[0024] 將所述重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移至融合液激活液進(jìn)行平衡，將平衡好的重構(gòu)卵移入融合容器 內(nèi)，輕輕撥動(dòng)重構(gòu)卵，使卵母細(xì)胞與注入的細(xì)胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極之間間 隔為1mm，然后進(jìn)行電脈沖刺激，電融合參數(shù)為：120volts/mm、30 μ s、2次；
[0025] 電脈沖刺激后將重構(gòu)卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構(gòu)卵。
[0026] -種采用上述任一實(shí)施例所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的 重構(gòu)卵。
[0027] -種白化病模型豬的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0028] 按照上述任一實(shí)施例所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法構(gòu)建重構(gòu)卵；
[0029] 對(duì)所述重構(gòu)卵進(jìn)行細(xì)胞融合和激活，得到激活的重構(gòu)卵；
[0030] 將所述激活的重構(gòu)卵至于代孕母豬的輸卵管中，或者將所述激活的重構(gòu)卵在體外 或體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，形成重構(gòu)胚，然后再將所述重構(gòu)胚移植到代孕母豬的子宮內(nèi)；
[0031] 飼養(yǎng)所述代孕母豬，產(chǎn)生白化病模型豬。
[0032] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述對(duì)所述重構(gòu)卵進(jìn)行細(xì)胞融合和激活，得到激活的重構(gòu) 卵，具體包括如下步驟：
[0033] 將所述重構(gòu)卵從去核操作液中轉(zhuǎn)至胚胎培養(yǎng)液中待融合與激活；
[0034] 將所述重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移至融合液激活液進(jìn)行平衡，將平衡好的重構(gòu)卵移入融合容器 內(nèi)，輕輕撥動(dòng)重構(gòu)卵，使卵母細(xì)胞與注入的細(xì)胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極之間間 隔為1mm，然后進(jìn)行電脈沖刺激，電融合參數(shù)為：120 volts/mm、30 μ s、2次；
[0035] 電脈沖刺激后將重構(gòu)卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構(gòu)卵。
[0036] 上述白化病模型豬的重構(gòu)卵及模型豬的構(gòu)建方法，通過敲除酪氨酸酶基因 （TYR 基因）獲得了白化小型豬，且將CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)結(jié)合，證 明該方法用于構(gòu)建基因修飾豬的高效可行性。獲得TYR基因敲除豬具有典型白化特征，可 為人類白化疾病研究提供一種可靠的動(dòng)物模型，且能應(yīng)用于毒性及過敏反應(yīng)的檢測(cè)等多方 面，有望成為類似白化小鼠的一種標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為一實(shí)施方式的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法的流程示意圖；
[0038] 圖2為白化病模型豬與黑豬的外形及眼睛對(duì)比圖；
[0039] 圖3為另一視角的白化病模型豬與黑豬的外形對(duì)比圖；
[0040] 圖4為白化病模型豬與黑豬的皮膚基層對(duì)比圖，其中A表示黑豬，B表示白化病模 型豬；
[0041] 圖5為白化病模型豬與黑豬的虹膜組織對(duì)比圖，其中C表示黑豬，D表示白化病模 型豬。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)白化病模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法及模型 豬的構(gòu)建方法作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0043] -實(shí)施方式的白化病模型豬的構(gòu)建方法包括構(gòu)建模型豬的重構(gòu)卵、對(duì)該重構(gòu)卵進(jìn) 行激活以及將激活的重構(gòu)卵導(dǎo)入代孕母豬體內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)的過程。
[0044] 如圖1所示，本實(shí)施方式的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0045] 步驟S110,針對(duì)豬物種的酪氨酸酶基因的第一外顯子的正鏈及互補(bǔ)鏈上滿足 G (N) 19NGG序列模式的序列部分分別設(shè)計(jì)gRNA的識(shí)別序列，分別記為第一 gRNA識(shí)別序列和 第二gRNA識(shí)別序列。其中，所述第一 gRNA識(shí)別序列與所述第一外顯子的正鏈上序列G (N) 19 一致，所述第二gRNA識(shí)別序列與所述第一外顯子的互補(bǔ)鏈上序列G(N)19 -致，N為A、T、C 或G，下標(biāo)19表示N的個(gè)數(shù)。
[0046] 上述豬物種優(yōu)選但不限于山豬（學(xué)名：Sus scrofa)，其酪氨酸酶基因的序列為 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因編號(hào)為407745 (Gene ID :407745)所示的序列。本實(shí)施方式所用的第一 外顯子的正鏈的部分序列（5 '-GCACCCCTGGGACCTCAGTTCCCCTTCACCGGGGTGGATGAACGGGAGTCT TGGCCCT-3'）如SEQ ID No. 1所示，第一外顯子的互補(bǔ)鏈的部分序列（3'-CGTGGGGACCCTGGA GTCAAGGGGAAGTGGCCCCACCTACTTGCCCTCAGAACCGGGA-5'）如SEQIDNo·2所示。針對(duì)該正鏈 及互補(bǔ)鏈的部分序列設(shè)計(jì)的第一 gRNA識(shí)別序列（5' -GGGTGGATGA ACGGGAGTCT-3'）如SEQ ID No. 3 所示，第二 gRNA 識(shí)別序列（5' -GAAGGGGAAC TGAGGTCCCA-3'）如 SEQ ID No. 4 所 示。可理解，在其他實(shí)施方式中，第一 sgRNA識(shí)別序列及第二gRNA識(shí)別序列還可以為其他 序列結(jié)構(gòu)，只要該第一外顯子的正鏈上及互補(bǔ)鏈上存在滿足G(N)19NGG的序列模式的序列 就可對(duì)應(yīng)設(shè)計(jì)第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA識(shí)別序列。
[0047] 步驟S120 :分別對(duì)第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA識(shí)別序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列，以構(gòu) 建含有第一 gRNA識(shí)別序列的第一雙鏈DNA和含有第二gRNA識(shí)別序列的第二雙鏈DNA。
[0048] 具體在本實(shí)施方式中，第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA的構(gòu)建過程包括如下步驟：
[0049] 分別對(duì)所述第一 gRNA識(shí)別序列（GGGTGGATGA ACGGGAGTCT)和第二gRNA識(shí)別序列 (GAAGGGGAAC TGAGGTCCCA)設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列；
[0050] 在所述第一 gRNA識(shí)別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 7所示 的序列片段（CACCGGGTGG ATGAACGGGA GTCT)，并在所述弟一 gRNA識(shí)別序列的互補(bǔ)序列的 5'端加上AAAC序列片段，形成如SEQ ID No. 8所示的序列片段（AAACAGACTCCCGTTCATCC ACCC)，將加有粘性末端的第一 gRNA識(shí)別序列及加有粘性末端的互補(bǔ)序列進(jìn)行退火處理， 得到帶有粘性末端的所述第一雙鏈DNA ;
[0051] 在所述第二gRNA識(shí)別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 9所示 的序列片段（CACCGAAGGG GAACTGAGGT CCCA)，并在所述第二gRNA識(shí)別序列的互補(bǔ)序列的 5'端加上AAAC序列片段，形成如SEQ ID No. 10所示的序列片段（AAACTGGGACCTCAGTTCCC CTTC)，將加有粘性末端的第二gRNA識(shí)別序列及加有粘性末端的互補(bǔ)序列進(jìn)行退火處理， 得到帶有粘性末端的所述第二雙鏈DNA。
[0052] 形成的第一雙鏈DNA與第二雙鏈DNA均具有"CACC"和"AAAC"粘性末端，該粘性 末端可用于連接至相應(yīng)的載體上。
[0053] 該加上粘性末端的過程可以使用但不限于全基因合成的方法或設(shè)計(jì)合適的引物 經(jīng)PCR擴(kuò)增得到。
[0054] 步驟S130 :分別根據(jù)第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA設(shè)計(jì)gRNA表達(dá)載體，記為第一 gRNA載體和第二gRNA載體。其中，所述第一 gRNA載體中含有所述第一雙鏈DNA，所述第二 gRNA載體中含有所述第二雙鏈DNA。
[0055] 本步驟是將第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA對(duì)應(yīng)連接到含有g(shù)RNA編碼序列的質(zhì)粒 中，如gRNA-GFP-Tl質(zhì)粒載體，該過程具體包括如下步驟：在含有g(shù)RNA編碼序列的質(zhì)粒載體 中引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，如BbsI酶切位點(diǎn)，得到中間體質(zhì)粒，再將第一雙鏈DNA和第二雙鏈 DNA通過引入的酶切位點(diǎn)（即粘性末端）連接到酶切后的中間體質(zhì)粒的對(duì)應(yīng)位置得到所需 的質(zhì)粒。其中，酶切位點(diǎn)可以但不限于BbsI酶切位點(diǎn)，當(dāng)酶切位點(diǎn)為BbsI酶切位點(diǎn)時(shí)，該 第一雙鏈DNA與該第二雙鏈DNA均連接有上述"CACC"和"AAAC"粘性末端，且克隆載體經(jīng) BbsI酶切處理。
[0056] 步驟S140 :將第一 gRNA載體、第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染進(jìn)微型豬胎兒成纖維細(xì)胞中，篩選出酪氨酸基因敲除的陽性克隆細(xì)胞。
[0057] 篩選出酪氨酸基因敲除的陽性克隆細(xì)胞包括如下步驟：
[0058] 對(duì)部分培養(yǎng)的克隆細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取裂解液；
[0059] 對(duì)裂解液進(jìn)行PCR處理，其中，PCR的引物序列分別如SEQ ID No. 5及SEQ ID No. 6 所示，PCR條件為：95°C預(yù)變性5分鐘，94°C變形20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共 35個(gè)循環(huán)；
[0060] 取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選陽性克隆細(xì)胞。
[0061] 此外，在本實(shí)施方式中，在將第一 gRNA載體、第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基 因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)豬胎兒成纖維細(xì)胞之前，還包括分別對(duì)第一 gRNA載體、第二gRNA載體 及含有Cas9切口酶基因的表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化處理后擴(kuò)大培養(yǎng)，再分別提取第一 gRNA載體、第 二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達(dá)載體的步驟。
[0062] 步驟S150 :將陽性克隆細(xì)胞注入母豬的去核卵母細(xì)胞中，形成重構(gòu)卵。
[0063] 具體在本實(shí)施方式中，可以采用如下步驟進(jìn)行：
[0064] 將陽性克隆細(xì)胞使用胰蛋白酶進(jìn)行消化之后進(jìn)行離心處理，棄上清，重懸細(xì)胞；
[0065] 在去核操作液中對(duì)卵母細(xì)胞用盲吸法去核后，吸取上步重懸的細(xì)胞直接注射于去 核的卵母細(xì)胞的卵周隙中，輕輕擠壓卵母細(xì)胞，使卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜與注入的細(xì)胞的細(xì)胞 膜接觸。
[0066] 步驟S160,對(duì)得到的重構(gòu)卵進(jìn)行融合和激活。
[0067] 具體在本實(shí)施方式中，可通過如下步驟進(jìn)行：
[0068] 將重構(gòu)卵從去核操作液中轉(zhuǎn)至胚胎培養(yǎng)液中待融合與激活；
[0069] 將重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移至融合激活液進(jìn)行平衡，并將平衡好的重構(gòu)卵移入融合容器內(nèi)，輕 輕撥動(dòng)重構(gòu)卵，使卵母細(xì)胞與注入的細(xì)胞的接觸面平行于兩條電極，再進(jìn)行電脈沖刺激融 合；
[0070] 電脈沖刺激后將重構(gòu)卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構(gòu)卵。
[0071] 本實(shí)施方式所述的將激活的重構(gòu)卵導(dǎo)入代孕母豬體內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)的過程，可以是 將激活的重構(gòu)卵至于代孕母豬的輸卵管中，或者將激活的重構(gòu)卵在體外或體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)， 形成重構(gòu)胚，然后再將重構(gòu)胚移植到代孕母豬的子宮內(nèi)，再飼養(yǎng)代孕母豬，產(chǎn)生白化病模型 豬。
[0072] 該白化病模型豬的重構(gòu)卵及模型豬的構(gòu)建方法，通過敲除酪氨酸酶基因（TYR基 因）獲得了白化小型豬，且將CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)結(jié)合，證明該 方法用于構(gòu)建基因修飾豬的高效可行性。獲得TYR基因敲除豬具有典型白化特征，可為人 類白化疾病研究提供一種可靠的動(dòng)物模型，且能應(yīng)用于毒性及過敏反應(yīng)的檢測(cè)等多方面， 有望成為類似白化小鼠的一種標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
[0073] 以下為具體實(shí)施例部分：
[0074] 以下試劑，除非特別說明，均購(gòu)自Sigma公司，括弧后面為對(duì)應(yīng)的中文名稱和/或 商品目錄號(hào)。
[0075] 本實(shí)施例主要包括以下步驟：（1)CRISPR/Cas9打靶系統(tǒng)的構(gòu)建；（2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染與 篩選，以及TYR基因敲除細(xì)胞克隆的獲得；（3)體細(xì)胞核移植；（4)基因修飾豬的基因型和 表型鑒定。
[0076] (I) CRISPR/Cas9打靶系統(tǒng)的構(gòu)建：
[0077] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中豬物種Sus scrofa的TYR基因的序列（Gene ID :407745)，在 第一外顯子序列上按照G(N)19NGG原則，分別對(duì)正鏈（部分序列如SEQ ID No. 1所示）和互 補(bǔ)鏈（部分序列如SEQ ID No. 2所示）設(shè)計(jì)一 gRNA的識(shí)別序列，分別記為第一 gRNA識(shí)別 序列（如SEQ ID No. 3所示）和第二gRNA識(shí)別序列（如SEQ ID No. 4所示）。
[0078] 提取用于待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組，在gRNA的識(shí)別序列識(shí)別的靶序列兩端設(shè)計(jì)一對(duì) 引物，其中上游引物序列為：5'-CCTGATGGAGAAGGAAT GCTGC-3'（如SEQ ID No. 5所示），下 游引物序列為：5' -TTGGCCATAGGTGCCTGTG-3'（如SEQ ID No. 6所示），PCR擴(kuò)增含有靶序 列的DNA片段，片段大小為388bp。PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C 退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增的靶序列片段經(jīng)測(cè)序后與GenBank上的序列比對(duì)， 確定序列正確。
[0079] 在質(zhì)粒gRNA-GFP-Tl (購(gòu)自Addgene公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為41819)質(zhì)粒引入2個(gè) Bbs I酶切位點(diǎn)，得到U6-gRNA克隆載體。分別對(duì)第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA識(shí)別序列 設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列，并在第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA識(shí)別序列及對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列兩端加上 粘性末端，再退火處理形成第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA。第一雙鏈DNA與第二雙鏈DNA均 包含有粘性末端"CACC"和"AAAC"，其中，第一雙鏈DNA中兩條鏈的序列分別如SEQID No. 7 和SEQ ID No. 8所示，第二雙鏈DNA中兩條鏈的序列分別如SEQ ID No. 9和SEQ IDNo. 10 所示。
[0080] 分別將第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA對(duì)應(yīng)連接到經(jīng)BbsI酶切的U6-gRNA克隆載 體中，得到第一 gRNA載體和第二gRNA載體，經(jīng)測(cè)序確定序列連接正確。
[0081] (2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選：
[0082] 將含有Cas9基因的質(zhì)粒載體（Cas9_nickase，購(gòu)自Addgene公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 41816)以及得到的第一 gRNA載體和第二gRNA載體經(jīng)轉(zhuǎn)化后擴(kuò)大培養(yǎng)，大提質(zhì)粒，三種質(zhì)粒 各制備20 μ g。
[0083] 轉(zhuǎn)染前一天復(fù)蘇版納微型豬胎兒成纖維細(xì)胞（來源于版納微型豬37日齡胎兒）， 在IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入IOmL 15% FBS DMEM培養(yǎng)基，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)24小 時(shí)后電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)入Cas9質(zhì)粒載體、第一 gRNA載體和第二gRNA載體各20 μ g，電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓 230V電容500 μ F，儀器為美國(guó)伯樂電穿孔系統(tǒng)（Bio-Rad Gene Pulser Xcell)。
[0084] 電轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分成25個(gè)IOcm大培養(yǎng)皿培養(yǎng)；隔天換液，換成含G418(濃度為 200 μ g/mL)的15% FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；隔2天換液，約10天后克隆生長(zhǎng)，用記號(hào)筆在大 培養(yǎng)皿底部畫出克隆，在超凈臺(tái)中去掉培養(yǎng)基后用PBS溶液洗一次，用克隆環(huán)圈住記號(hào)筆 畫出的克隆，加入50-100 μ 1 0. 05 %胰酶消化5-8min，加培養(yǎng)基終止，將克隆環(huán)中的細(xì)胞 盡量全部轉(zhuǎn)移到48孔板中，并用培養(yǎng)基洗兩次。傳代時(shí)取1/10的細(xì)胞用于鑒定。
[0085] 離心收集取出用于鑒定的單克隆細(xì)胞，加15μ I NP40裂解液（含0.45%NP-40和 〇. 6%蛋白酶K)，依次在56°C裂解Ih、在95°C裂解IOmin，得到的裂解液于-20°C保存?zhèn)溆谩?[0086] 對(duì)得到的裂解液利用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其中上游引物序列為： 5' -CCTGATGGAGAAGGAAT GCTGC-3'（如 SEQ ID No. 5 所示），下游引物序列為： 5' -TTGGCCATAGGTGCCTGTG-3'（如 SEQ ID No. 6 所示），采用 PCR 程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 條件 為：95°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)。取 3μ I PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。得到單一明亮一條帶的PCR產(chǎn)物以正向引物送深 圳華大基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與原序列比對(duì)，部分測(cè)序結(jié)果為后雙峰圖譜的PCR產(chǎn)物，回收純 化后與PMD18T載體經(jīng)TA克隆連接，轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒后用通用引物Μ13測(cè)序，得到序列。部分陽 性克隆的靶位點(diǎn)序列測(cè)序結(jié)果如表1所示。
[0087] 表 1
[0088]

【權(quán)利要求】
1. 一種白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一：針對(duì)豬物種的酪氨酸酶基因的第一外顯子的正鏈及互補(bǔ)鏈上滿足g(n)19ngg 序列模式的序列部分分別設(shè)計(jì)gRNA的識(shí)別序列，分別記為第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA 識(shí)別序列，其中，所述第一 gRNA識(shí)別序列與所述第一外顯子的正鏈上序列G (N) 19 -致，所述 第二gRNA識(shí)別序列與所述第一外顯子的互補(bǔ)鏈上序列G (N) 19 -致，N為A、T、C或G，下標(biāo) 19表示N的個(gè)數(shù)； 步驟二：分別對(duì)所述第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA識(shí)別序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列，以構(gòu)建含 有所述第一 gRNA識(shí)別序列的第一雙鏈DNA和含有第二gRNA識(shí)別序列的第二雙鏈DNA ; 步驟三：分別根據(jù)所述第一雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA設(shè)計(jì)gRNA表達(dá)載體，記為第 一 gRNA載體和第二gRNA載體，其中，所述第一 gRNA載體中含有所述第一雙鏈DNA，所述第 二gRNA載體中含有所述第二雙鏈DNA ; 步驟四：將所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達(dá)載 體轉(zhuǎn)染進(jìn)微型豬胎兒成纖維細(xì)胞中，篩選出酪氨酸酶基因敲除的陽性克隆細(xì)胞； 步驟五：將所述陽性克隆細(xì)胞注入母豬的去核卵母細(xì)胞中，形成重構(gòu)卵。
2. 如權(quán)利要求1所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟一 中，所述豬物種的酪氨酸酶基因的序列為NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因編號(hào)為407745所示的序列；所 述第一外顯子的正鏈上滿足G(N) 19NGG序列模式的序列如SEQ ID No. 1所示，所述第一外顯 子的互補(bǔ)鏈上滿足G(N) 19NGG序列模式的序列如SEQ ID No. 2所示；所述第一 gRNA識(shí)別序 列如SEQ ID No. 3所示，所述第二gRNA識(shí)別序列如SEQ ID No. 4所示。
3. 如權(quán)利要求2所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟二 具體包括如下步驟： 分別對(duì)所述第一 gRNA識(shí)別序列和第二gRNA識(shí)別序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列； 在所述第一 gRNA識(shí)別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 7所示的序 列片段，并在所述第一 gRNA識(shí)別序列的互補(bǔ)序列的5'端加上AAAC序列片段，形成如SEQID No. 8所示的序列片段，將加有粘性末端的第一 gRNA識(shí)別序列及加有粘性末端的互補(bǔ)序列 進(jìn)行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第一雙鏈DNA ; 在所述第二gRNA識(shí)別序列的5'端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No. 9所示的序 列片段，并在所述第二gRNA識(shí)別序列的互補(bǔ)序列的5'端加上AAAC序列片段，形成如SEQID No. 10所示的序列片段，將加有粘性末端的第二gRNA識(shí)別序列及加有粘性末端的互補(bǔ)序列 進(jìn)行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第二雙鏈DNA。
4. 如權(quán)利要求3所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟三 具體包括如下步驟： 在gRNA-GFP-Tl質(zhì)粒載體中引入兩個(gè)Bbsl酶切位點(diǎn)，得到中間體質(zhì)粒； 對(duì)所述中間體質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶Bbsl酶切，并將帶有粘性末端的所述第一雙鏈 DNA和所述第二雙鏈DNA對(duì)應(yīng)連接到酶切后的中間體質(zhì)粒上，分別得到所述第一 gRNA載體 和所述第二gRNA載體。
5. 如權(quán)利要求4所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟四 中，在將所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 進(jìn)微型豬胎兒成纖維細(xì)胞之前，還包括分別對(duì)所述第一 gRNA載體、所述第二gRNA載體及含 有Cas9切口酶基因的表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化處理后擴(kuò)大培養(yǎng)，再提取所述第一 gRNA載體、所述第 二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達(dá)載體的步驟。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，其特征在于， 還包括對(duì)得到的重構(gòu)卵進(jìn)行融合和激活的步驟，具體如下： 將所述重構(gòu)卵從去核操作液中轉(zhuǎn)至胚胎培養(yǎng)液中待融合與激活； 將所述重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移至融合液激活液進(jìn)行平衡，將平衡好的重構(gòu)卵移入融合容器內(nèi)，輕 輕撥動(dòng)重構(gòu)卵，使卵母細(xì)胞與注入的細(xì)胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極之間間隔為 1_，然后進(jìn)行電脈沖刺激，電融合參數(shù)為：120 volts/mm、30y s、2次； 電脈沖刺激后將重構(gòu)卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構(gòu)卵。
7. -種如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法構(gòu)建得到 的重構(gòu)卵。
8. -種白化病模型豬的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟： 按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的白化病模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法構(gòu)建重構(gòu)卵； 對(duì)所述重構(gòu)卵進(jìn)行細(xì)胞融合和激活，得到激活的重構(gòu)卵； 將所述激活的重構(gòu)卵至于代孕母豬的輸卵管中，或者將所述激活的重構(gòu)卵在體外或體 內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，形成重構(gòu)胚，然后再將所述重構(gòu)胚移植到代孕母豬的子宮內(nèi)； 飼養(yǎng)所述代孕母豬，產(chǎn)生白化病模型豬。
9. 如權(quán)利要求8所述的白化病模型豬的構(gòu)建方法，其特征在于，所述對(duì)所述重構(gòu)卵進(jìn) 行細(xì)胞融合和激活，得到激活的重構(gòu)卵，具體包括如下步驟： 將所述重構(gòu)卵從去核操作液中轉(zhuǎn)至胚胎培養(yǎng)液中待融合與激活； 將所述重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移至融合液激活液進(jìn)行平衡，將平衡好的重構(gòu)卵移入融合容器內(nèi)，輕 輕撥動(dòng)重構(gòu)卵，使卵母細(xì)胞與注入的細(xì)胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極之間間隔為 1mm，然后進(jìn)行電脈沖刺激，電融合參數(shù)為：120volts/mm、30 μ s、2次； 電脈沖刺激后將重構(gòu)卵移入胚胎操作液中，篩選出融合成功的重構(gòu)卵。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104263754SQ201410438927
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】賴良學(xué), 信吉閣, 楊化強(qiáng), 鄒慶劍, 樊娜娜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院