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      一種提高微藻油脂產(chǎn)率的方法

      文檔序號:486282閱讀:288來源:國知局
      一種提高微藻油脂產(chǎn)率的方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高微藻油脂產(chǎn)率的方法,首先將微藻在存在植物激素的改良培養(yǎng)基中進(jìn)行光自養(yǎng)培養(yǎng),到穩(wěn)定期后將離心獲得的藻體作為種子在脅迫培養(yǎng)基中進(jìn)行光脅迫、氮脅迫培養(yǎng)。本發(fā)明公開的方法降低了培養(yǎng)過程對營養(yǎng)物質(zhì)的需求量,降低了培養(yǎng)成本,能夠同時提高小球藻的生物量和油脂產(chǎn)率,培養(yǎng)方法簡單、易操作、不易污染,所受影響因素較少,適合大規(guī)模培養(yǎng)。
      【專利說明】一種提高微藻油脂產(chǎn)率的方法

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及一種提高微藻油脂產(chǎn)率的方法,屬于生物工程領(lǐng)域。

      【背景技術(shù)】
      [0002] 微藻是一類體較小的單細(xì)胞藻類,具有含油量高、生長速度快、光合效率高、環(huán)境 適應(yīng)力強(qiáng)、不占用耕地等特點,并且微藻體內(nèi)的油脂可通過酯交換反應(yīng)生成脂肪酸甲酯,即 生物柴油,被認(rèn)為是發(fā)展生物柴油最具潛力的原料。盡管微藻具有如此多的優(yōu)點,但是利用 微藻生產(chǎn)生物柴油成本高于石油為主的石化燃料,在這之中獲取具有高油脂產(chǎn)率的微藻種 質(zhì)資源是發(fā)展生物柴油的關(guān)鍵步驟之一。
      [0003] 高油脂產(chǎn)率的微藻需要微藻具有積累較高生物量和油脂含量的能力,微藻的生長 過程易受到外界環(huán)境因素的影響,如培養(yǎng)基成分、光照強(qiáng)度、鹽度、pH等,以及不同的培養(yǎng)方 式,如異養(yǎng)、兼養(yǎng)、光自養(yǎng)等,都會導(dǎo)致微藻細(xì)胞內(nèi)各類生化物質(zhì)的含量不同。
      [0004] 陳必鏈等(01'11010165144)通過微波處理微藻可使微藻生物量提升10(%?60 (%, 但該方法設(shè)備投入多、能耗大,生產(chǎn)成本較高;張霖等(CN 102443562A)通過在培養(yǎng)基中添 加含羥基的三碳有機(jī)物光自養(yǎng)培養(yǎng)微藻,使小球藻生物量提高至500mg/L以上;李元廣等 人(CN 102154110A)通過先異養(yǎng)后自養(yǎng)培養(yǎng)步驟,使普通小球藻生物量達(dá)到2g/L以上,油 脂產(chǎn)率達(dá)到150mg/L ·(!以上;王艷等人(CN 103045478A)通過交替添加碳源或氮源使得產(chǎn) 油小球藻生物量高達(dá)18g/L,油脂含量高達(dá)48%;以上通過異養(yǎng)或兼養(yǎng)方式能顯著提高微藻 生物量,但培養(yǎng)中易染菌,所需設(shè)備要求較高,隨之能耗也相對較高,并且這種方法不適宜 戶外大規(guī)模培養(yǎng)微藻。光自養(yǎng)微藻較異養(yǎng)與兼養(yǎng)方式相比,培養(yǎng)過程更為簡單,對設(shè)備及營 養(yǎng)要求低,成本投入少,但微藻油脂產(chǎn)率不如以上兩種方式高,因此探尋一種能快速提高光 自養(yǎng)微藻油脂產(chǎn)率的方法尤為重要。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,本發(fā)明公開了一種提高微藻中油脂產(chǎn)率的方法,通過微藻, 主要是小球藻在植物激素存在的光自養(yǎng)條件下獲得的濃縮藻體為種子進(jìn)行光、氮脅迫培 養(yǎng),得到高油脂產(chǎn)率的脅迫條件,從而實現(xiàn)脅迫環(huán)境中生物量和油脂含量同步提高。與傳統(tǒng) 方法相比,本發(fā)明的方法操作簡單,成本較低,適用于大規(guī)模培養(yǎng)微藻用于生物柴油的生產(chǎn) 和研究。
      [0006] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:
      [0007] -種提高微藻油脂產(chǎn)率的方法,首先將小球藻在存在植物激素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn) 行光自養(yǎng)培養(yǎng),到穩(wěn)定期后將離心獲得的濃縮藻體作為種子在脅迫培養(yǎng)基中進(jìn)行光脅迫、 氮脅迫培養(yǎng);其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基為改良BG11培養(yǎng)基,脅迫培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比,NaN0 3濃 度低于基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不含基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其余成分相同;脅迫培養(yǎng)條件下光照強(qiáng)度高于基礎(chǔ) 培養(yǎng)。
      [0008] 在本發(fā)明中,微藻主要是指最常見的用于生產(chǎn)生物柴油的微藻品種:小球藻,整個 培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基的優(yōu)化以小球藻為基礎(chǔ)。
      [0009] 通過上述方法,在氮源缺乏環(huán)境中,即氮脅迫,抑制小球藻體內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等含 氮類化合物的合成,促進(jìn)含氮元素較少的脂類和絕大多數(shù)膜質(zhì)繼續(xù)合成,使其油脂含量增 力口;同時,在基礎(chǔ)培養(yǎng)階段利用植物激素促進(jìn)藻體的生長,使細(xì)胞液泡和細(xì)胞體積不斷增 大,促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的合成,為合成原生質(zhì)體和細(xì)胞壁提供原料,從而使培養(yǎng)所獲得的微 藻生物量較高。
      [0010] 其中,所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為 NaN03 0 . 4 ?1. 5g/L,Κ2ΗΡ04 · 3H20 0. 04 ?0. 16g/ L,MgS04 · 7H20 0· 08 ?0· 24g/L,CaCl2 20 ?30mg/L,檸檬酸 3 ?9mg/L,F(xiàn)e (NH4) 3 (C6H507) 2 2.0?9.011^/1,似#0了4*2!120 0.6?1.811^/1,似2〇)315?3011^/1,微量元素混合液0.1? 1. OmL/L,NaHC03 1 ?3g/L。 toon] 其中,上述的微量元素溶液可采用市售的藻類培養(yǎng)基中所用的微量元素溶液成 品,例如微量元素溶液A5(1000ml 水中溶解!^03約2. 86g、MnCl2 ·4Η20約 1. 81g、ZnS04 ·7Η20 約 0· 222g、Na2Mo04 約 0· 39g、CuS04 · 5Η20 約 0· 079g、Co (Ν03)2· 6Η20 約 0· 049g,不同廠家的 產(chǎn)品各成分含量略有變化)。
      [0012] 在本發(fā)明,植物激素可以是常見的生長素 IAA、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(CTK)、脫 落酸(abscisic acid,ΑΒΑ)等,可根據(jù)需要調(diào)整激素的用量,結(jié)合上述培養(yǎng)基和小球藻的生 長特性,優(yōu)選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的植物激素為三吲哚乙酸,其濃度為〇. 01?〇. 50mg/L。
      [0013] 在本發(fā)明中,脅迫培養(yǎng)基的成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同,但是含氮的成分含量更低或 不使用以實現(xiàn)氮脅迫,具體的,脅迫培養(yǎng)基組成為NaN0 3濃度為0?0. 4g/L,其余與基礎(chǔ)培 養(yǎng)基相同。
      [0014] 在本發(fā)明中,基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件為溫度20?28°C,光照強(qiáng)度3000?60001ux, 光周期24:0。
      [0015] 與上述條件相比,在脅迫培養(yǎng)基階段光照強(qiáng)度更高以實現(xiàn)光脅迫,具體的,脅迫培 養(yǎng)基培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度7000?lOOOOlux,其余與基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件相同。
      [0016] 在本發(fā)明中,濃縮藻體的方法為微藻經(jīng)植物激素處理培養(yǎng)至穩(wěn)定期后,4000? 5000r/min離心藻液5?8min,無菌水沖洗藻泥4?5次,獲得濃縮藻體。
      [0017] 通過上述改進(jìn),本發(fā)明在植物激素培養(yǎng)和光、氮脅迫培養(yǎng)下,微藻油脂產(chǎn)率顯著提 高。與傳統(tǒng)方法相比較,本發(fā)明通過植物激素的添加與脅迫培養(yǎng)降低對營養(yǎng)物質(zhì)的需求量, 減少投入成本,二者集成的方法能高效提高油脂產(chǎn)率,與異養(yǎng)發(fā)酵條件相比,光自養(yǎng)培養(yǎng)方 法簡單、易操作、不易污染,所受影響因素較少,更適合大規(guī)模培養(yǎng)。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0018] 圖1為本發(fā)明培養(yǎng)方法的示意圖。

      【具體實施方式】
      [0019] 在下述實施例中,實驗藻種為小球藻C. vulgaris XJB,來自石河子大學(xué)化學(xué)化工 學(xué)院,新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點實驗室,也可從市場上購買。
      [0020] 參考附圖1,可理解本發(fā)明方法的具體實施步驟和過程。
      [0021] 實施例1
      [0022] 取適量C. vulgaris XJB藻液接種至含600mL培養(yǎng)基的1L錐形瓶中,藻液接種 量為 10%,培養(yǎng)基為:NaN03 0· 83g/L,Κ2ΗΡ04 · 3H20 0· 09g/L,MgS04 · 7H20 0· 12g/L,CaCl2 27. 2mg/L, Citric-acid 6. 6mg/L, Fe (NH4) 3 (C6H507) 2 6. Omg/L, Na2EDTA · 2H20 1. lmg/L, NaC03 20mg/L,A5微量元素混合液0. 2mL/L,NaHC03 2. 34g/L。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加三吲哚 乙酸IAA 0. 08mg/L,于溫度24±2°C,光照強(qiáng)度6000±2001ux,光周期24:0(L:D)下光自養(yǎng) 培養(yǎng),每天搖瓶三次。
      [0023] 通過每天定時檢測的細(xì)胞個數(shù)所繪制的生長曲線,于穩(wěn)定期4000r/min離心藻液 5min,獲得濃縮藻體,并以蒸餾水沖洗5次,洗去無機(jī)鹽離子后全部懸浮在NaN0 3濃度為Og/ L而其他營養(yǎng)成分同上所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的脅迫培養(yǎng)基中,于光照強(qiáng)度為70001ux,光周期為 24:0 (L: D),溫度為24 ± 2 °C條件下,脅迫培養(yǎng)2天。
      [0024] 檢測細(xì)胞生長至穩(wěn)定期后,藻液于4000?5000r/min離心5?8min,藻泥冷凍干 燥10?12h,干藻粉稱重后即為生物量。
      [0025] 小球藻干藻粉采用氯仿甲醇法提取油脂:取適量小球藻干粉于10mL離心管中,力口 入6mL的氯仿甲醇混合液(2 : 1,V : V),室溫下靜置0.5h后加入lmL蒸餾水,將混合物 在混勻器中潤旋30s,室溫靜置2h后于5000r · mirT1離心5min,收集氯仿層至已恒重且已 知質(zhì)量的試管中。取4mL氯仿加入到上述離心管中,渦旋30s后室溫靜置2h,離心收集氯仿 層于上述試管中,將試管在通風(fēng)櫥中70°C水浴蒸干,置于105°C烘箱中烘干至恒重,冷卻至 室溫后稱量試管質(zhì)量,前后質(zhì)量之差為微藻總脂質(zhì)量,計算油脂含量及油脂產(chǎn)率。
      [0026] 檢測結(jié)果顯示,小球藻經(jīng)上述IAA培養(yǎng)和光、氮脅迫培養(yǎng)后,C. vulgaris XJB油脂 產(chǎn)率可達(dá)49. 6mg/L · d,與僅經(jīng)IAA培養(yǎng)的條件相比提高了 2. 3倍,與未經(jīng)IAA培養(yǎng)條件相 比提高了 5. 4倍。
      [0027] 實施例2
      [0028] 本實施例所用小球藻及IAA光自養(yǎng)培養(yǎng)過程同實施例1。
      [0029] 其中,IAA處理后所獲藻泥懸浮至脅迫條件下,S卩NaN03濃度為0. 20g/L,其他營養(yǎng) 成分同實施例1所述培養(yǎng)基的脅迫培養(yǎng)基中,于光照強(qiáng)度為80001UX,光周期為24:0 (L:D), 溫度為24±2°C條件下,脅迫培養(yǎng)2天。
      [0030] 脅迫培養(yǎng)至穩(wěn)定期后,生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)率檢測及計算同實施例1,經(jīng)上述 IAA光自養(yǎng)光、氮脅迫培養(yǎng)后,C. vulgaris XJB油脂產(chǎn)率可達(dá)57. 9mg/L ·(!,與僅經(jīng)IAA 培養(yǎng)的條件相比提高了 2. 8倍,與未經(jīng)IAA或脅迫培養(yǎng)條件相比提高了 6. 5倍。
      【權(quán)利要求】
      1. 一種提高微藻油脂產(chǎn)率的方法,其特征在于首先將小球藻在存在植物激素的基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中進(jìn)行光自養(yǎng)培養(yǎng),到穩(wěn)定期后將離心獲得的濃縮藻體作為種子在脅迫培養(yǎng)基中進(jìn)行 光脅迫、氮脅迫培養(yǎng);其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基為改良BG11培養(yǎng)基,脅迫培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比, NaN03濃度低于基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不含基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其余成分相同;脅迫培養(yǎng)條件下光照強(qiáng)度高 于基礎(chǔ)培養(yǎng)。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為NaN03 0 . 4?1. 5g/ L,K2HP04 ·3Η20 0· 04 ?0· 16g/L,MgS04 ·7Η20 0· 08 ?0· 24g/L,CaCl2 20 ?30mg/L,檸檬酸 3 ?9mg/L,F(xiàn)e (NH4) 3 (C6H507) 2 2· 0 ?9. Omg/L,Na2EDTA · 2H20 0· 6 ?1. 8mg/L,Na2C03 15 ? 30mg/L,微量元素混合液 0· 1 ?1. OmL/L,NaHC03 1 ?3g/L。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的植物激素為三Π 引哚乙 酸,其濃度為〇· 01?〇· 50mg/L。
      4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述脅迫培養(yǎng)基組成為NaN03濃度為0? 〇. 4g/L,其余與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同。
      5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件為溫度20? 28°C,光照強(qiáng)度3000?60001ux,光周期24:0。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于所述脅迫培養(yǎng)基培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度 7000?lOOOOlux,其余與基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件相同。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于濃縮藻體的方法為微藻經(jīng)植物激素處理培 養(yǎng)至穩(wěn)定期后,4000?5000r/min離心藻液5?8min,無菌水沖洗藻泥4?5次,獲得濃縮 藻體。
      8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述微藻為小球藻。
      【文檔編號】C12P7/64GK104195189SQ201410441942
      【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
      【發(fā)明者】徐小琳, 王思雨, 李春, 王長海 申請人:石河子大學(xué)
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