一種小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體及其構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了提供一種小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體及其構(gòu)建方法。所述小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體中含有如SEQ ID NO.1所示的同源臂序列。本發(fā)明在核糖體基因區(qū)較高的同源重組效率基礎(chǔ)上，旨在針對(duì)核糖體基因區(qū)位點(diǎn)，利用本發(fā)明有效地將目的基因打靶到小鼠不同類(lèi)型細(xì)胞的核糖體基因區(qū)，再通過(guò)啟動(dòng)子陷阱策略富集基因打靶陽(yáng)性克隆，此外Loxp序列的引入可以實(shí)現(xiàn)之后不同基因在打靶位置高效替換。本發(fā)明后續(xù)主要應(yīng)用小鼠胚胎干細(xì)胞的核糖體基因區(qū)打靶，再最終建立核糖體基因區(qū)打靶的小鼠模型，為驗(yàn)證以核糖體基因區(qū)基因打靶的有效性、生物安全性提供基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體及其構(gòu)建方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 2007年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的基因打靶技術(shù)本身是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有開(kāi)創(chuàng)性 的方法，該方法通過(guò)構(gòu)建同源重組引導(dǎo)的打靶載體，將其導(dǎo)入細(xì)胞后，利用細(xì)胞內(nèi)靶向的基 因組位點(diǎn)與載體間自發(fā)同源重組，再最終篩選出攜帶重組子的細(xì)胞，從而可在活細(xì)胞中精 確穩(wěn)定的引入基因組修飾，例如可定向敲除（knock-out)特定的內(nèi)源基因，也能定點(diǎn)將外 源基因靶入（knock-in)至基因組。打靶載體的構(gòu)建是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，決定了同源重組的 位點(diǎn)及重組效率，因此打靶載體的選擇與構(gòu)建就顯得尤為關(guān)鍵。
[0003] 自1987年Thomas和Capecchi完成了世界第一例小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC)基因打 靶實(shí)驗(yàn)以來(lái)，基因打靶技術(shù)就給應(yīng)用小鼠進(jìn)行的生物醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)了革命，并為基因治療 引入了新的手段。隨著近30年的發(fā)展，科學(xué)家們利用基因打靶技術(shù)與mESCs的結(jié)合，針對(duì) 不同的基因，設(shè)計(jì)打靶載體，對(duì)小鼠近1萬(wàn)個(gè)基因進(jìn)行了基因操作，并建立了 500多種人類(lèi) 疾病的小鼠模型，其中包括心血管疾病，神經(jīng)退行性疾病，糖尿病和癌癥等。
[0004] 雖然基因打靶技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對(duì)mESC的基因操作中，但是最終獲得穩(wěn)定基 因修飾細(xì)胞的效率卻不勝人意?；虼虬屑夹g(shù)的關(guān)鍵是根據(jù)合適靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)和構(gòu)建打靶載 體。靶位點(diǎn)的選擇可能直接影響到同源重組的效率，同時(shí)也涉及到外源基因靶入細(xì)胞后安 全性和有效性的問(wèn)題。目前文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)實(shí)現(xiàn)基因打靶的位點(diǎn)基本上都是具有特定生理功 能的結(jié)構(gòu)基因，這類(lèi)等位基因在基因組上大部分僅有兩個(gè)拷貝，而基因打靶的成功將導(dǎo)致 其中一個(gè)拷貝甚至兩個(gè)拷貝的失活，極大可能影響或改變打靶后細(xì)胞的生物學(xué)特性。因此 目前針對(duì)不同疾病所進(jìn)行的基因打靶大多是利用其進(jìn)行機(jī)制相關(guān)的研究，尚未能將基因打 靶載體介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)直接進(jìn)行疾病診療的臨床轉(zhuǎn)化。
[0005] 現(xiàn)有通過(guò)基因打靶載體介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)主要缺點(diǎn)在于打靶效率低下，而制約 因素主要有幾個(gè)方面，包括基因組打靶位點(diǎn)的選擇，打靶載體的設(shè)計(jì)策略，載體導(dǎo)入細(xì)胞的 效率。其中靶位點(diǎn)的選擇是基因打靶至關(guān)重要的一步，因?yàn)榇艘蛩乜赡苤苯佑绊懙酵粗?組的效率，同時(shí)也涉及到外源基因靶入細(xì)胞后安全性和有效性的問(wèn)題。此外，目前文獻(xiàn)報(bào)道 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)基因打靶的位點(diǎn)基本上都是具有特定生理功能的結(jié)構(gòu)基因，這類(lèi)等位基因在基因 組上大部分僅有兩個(gè)拷貝，而基因打靶的成功將導(dǎo)致其中一個(gè)拷貝甚至兩個(gè)拷貝的失活， 極大可能影響或改變打靶后細(xì)胞的生物學(xué)特性。因此如何在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)安全穩(wěn)定的基因打 靶是能否將其應(yīng)用于臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體及其構(gòu)建 方法。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0008] 所述小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體中含有如SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列。
[0009] 優(yōu)選地，所述打靶載體的空載體為T(mén)載體，pEGFP載體或pcDNA3. 1載體等。
[0010] 優(yōu)選地，所述打祀載體的序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0011] 上述打靶載體的制備方法包括如下步驟：
[0012] (1)以小鼠胚胎干細(xì)胞的gDNA作為模板，將SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列擴(kuò)增 為AR1和AR2兩段序列，AR1序列如SEQ ID N0. 3所示；AR2序列如SEQ ID N0. 4所示；
[0013] (2)將AR1序列連接至打靶載體的空載體，得載體AR1 ;將AR2序列連接至打靶載 體的空載體，得載體AR2 ;
[0014] (3)待載體AR1和載體AR2測(cè)序正確后，通過(guò)Not I和BamH I將AR1序列從載體 AR1上酶切下來(lái)；通過(guò)Not I和BamH I將AR2序列從載體AR2上酶切下來(lái)；將酶切下來(lái)的 AR1和AR2連接，構(gòu)建成含有SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的載體pMr ;
[0015] (4)在載體pMr中SEQ ID Ν0· 1所示同源臂序列的EcoR I酶切位點(diǎn)出連入正選擇 篩選基因 Neo,構(gòu)建成小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體pMrn。
[0016] 下面結(jié)合原理對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[0017] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明選擇核糖體基因區(qū)作為基因打靶的靶位點(diǎn)并設(shè)計(jì)構(gòu) 建相應(yīng)的基因打靶載體。通過(guò)早期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及生物信息學(xué)分析得知，核糖體基因區(qū)可能 是高效的基因打靶位點(diǎn)。一方面，在小鼠基因組中有50-100個(gè)拷貝的核糖體基因。如此 龐大的拷貝數(shù)為同源重組提供大量的重組位點(diǎn)，可能增加打靶的效率。另一方面，據(jù)報(bào)道， 在酵母和擬芥南細(xì)胞中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)核糖體基因區(qū)有一段有刺激同源重組事件發(fā)生功能的序 列，由于真核細(xì)胞的核糖體基因區(qū)相當(dāng)保守，這段序列很可能鼠細(xì)胞的核糖體基因區(qū)，從而 使之成為一個(gè)同源重組熱點(diǎn)。此外，在細(xì)胞增殖快，細(xì)胞生命活動(dòng)旺盛的干細(xì)胞中，rDNA區(qū) 的轉(zhuǎn)錄活躍，染色質(zhì)松散，可能更易于同源重組的發(fā)生。
[0018] 其次，核糖體基因區(qū)是安全的基因打靶位點(diǎn)。由于小鼠與人核糖體基因區(qū)序列的 同源性高達(dá)95%以上，而人核糖體基因區(qū)拷貝數(shù)的變化是常見(jiàn)的多態(tài)現(xiàn)象，增加或減少對(duì) 人體無(wú)危害。另一方面小鼠每個(gè)細(xì)胞中都有許多拷貝的核糖體基因，破壞少數(shù)拷貝對(duì)細(xì)胞 維持正常的功能應(yīng)該沒(méi)有影響。
[0019] 基于上述分析和實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明首先通過(guò)生物信息學(xué)方式查找到小鼠 rDNA單個(gè)拷 貝的全序列，選取其轉(zhuǎn)錄區(qū)下游+2506至+6875全長(zhǎng)4370bp的一段序列作為同源臂序列。 抽提小鼠胚胎干細(xì)胞的gDNA作為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)引物將該同源序列分為兩段（AR1，AR2)進(jìn) 行擴(kuò)增，其中AR1長(zhǎng)2428bp，AR2長(zhǎng)2421bp。擴(kuò)增后的DNA片段分別連接至T載體上。再 通過(guò)Not I和BamH I酶切AR2的一段序列連接到AR1之后，構(gòu)建成包含4370bp全長(zhǎng)同源 臂的載體pMr。在同源臂上的EcoR I酶切位點(diǎn)處（rDNA轉(zhuǎn)錄取下游+5646位點(diǎn)）連入正選 擇篩選基因 Neo。Neo采用啟動(dòng)子陷阱策略，即上游未帶啟動(dòng)子，而是利用EMCV-IRES (腦心 肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列）的作用依靠核糖體基因自身的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)其表達(dá)， 以富集基因打靶陽(yáng)性克隆。EMCV-IRES及Neo基因?qū)⑷L(zhǎng)同源臂分隔為1229bp的短同源臂 (SH)和3140bp的長(zhǎng)同源臂（LH)，通過(guò)兩個(gè)同源臂與基因組發(fā)生同源重組將Neo打靶至細(xì) 胞基因組rDNA中。EMCV-IRES-Neo序列的兩端加上了 LoxP序列便于后續(xù)工作中去除篩選 基因或進(jìn)行基因交換。
[0020] 本發(fā)明的目的在于證實(shí)該載體能高效介導(dǎo)外源基因靶入到小鼠胚胎干細(xì)胞的核 糖體基因區(qū)，并能穩(wěn)定遺傳，且該載體介導(dǎo)的基因打靶不影響小鼠胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特 性，初步證實(shí)具備安全性。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0022] 1)通過(guò)測(cè)序證實(shí)構(gòu)建好的小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體pMrn的同源臂及其他序列 元件均無(wú)突變，將pMrn通過(guò)核轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞后，經(jīng)G418藥物篩選，能獲 得大量抗性克隆，通過(guò)定點(diǎn)PCR，Southern blot的檢測(cè)，確定pMrn能將外源基因定點(diǎn)靶入 到小鼠 rDNA區(qū)。
[0023] 2)通過(guò)計(jì)算，pMrn所獲的打靶效率高于之前報(bào)道其他位點(diǎn)的打靶效率，具有高效 的優(yōu)點(diǎn)。
[0024] 3)將打靶后的小鼠胚胎干細(xì)胞多次傳代，并經(jīng)核型檢測(cè)和干細(xì)胞標(biāo)志物的檢測(cè)， 表明rDNA區(qū)打靶不僅能穩(wěn)定遺傳，而且不會(huì)改變干細(xì)胞的生物學(xué)特性。具有穩(wěn)定安全的優(yōu) 點(diǎn)。
[0025] 總之，本發(fā)明所述的小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體pMrn包括5'同源臂和3'同源臂， 以小鼠 rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)下游+2506至+6875全長(zhǎng)4370bp的一段序列作為同源臂序列，在同源臂 上的Xbal酶切位點(diǎn)的位置上連入正選擇篩選基因 Neo。Neo基因采用啟動(dòng)子陷阱策略，艮P， 上游未帶啟動(dòng)子，而是利用EMCV-IRES(腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列）的作用依 靠核糖體基因自身的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)其表達(dá)EMCV-IRES-Neo篩選基因的兩端加上了 Loxp序 列，便于后續(xù)工作中去除篩選基因或進(jìn)行基因交換。本發(fā)明在核糖體基因區(qū)較高的同源重 組效率基礎(chǔ)上，旨在針對(duì)核糖體基因區(qū)位點(diǎn)，利用本發(fā)明有效地將目的基因打靶到小鼠不 同類(lèi)型細(xì)胞的核糖體基因區(qū)，再通過(guò)啟動(dòng)子陷阱策略富集基因打靶陽(yáng)性克隆，此外Loxp序 列的引入可以實(shí)現(xiàn)之后不同基因在打靶位置高效替換。本發(fā)明后續(xù)主要應(yīng)用小鼠胚胎干細(xì) 胞的核糖體基因區(qū)打靶，再最終建立核糖體基因區(qū)打靶的小鼠模型，為驗(yàn)證以核糖體基因 區(qū)基因打靶的有效性、生物安全性提供基礎(chǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1AR1，AR2PCR凝膠電泳結(jié)果圖；
[0027] 圖2為pMr酶切鑒定結(jié)果圖；
[0028] 圖3為pMrn酶切鑒定結(jié)果；
[0029] 圖4為pMrn測(cè)序鑒定圖；
[0030] 圖5為核轉(zhuǎn)獲得高效的轉(zhuǎn)染率及藥物篩選后的抗性mESCs克隆結(jié)果圖；
[0031] 圖6為Southern Blot鑒定定點(diǎn)整合克隆以及所獲得的定點(diǎn)整合克隆數(shù)分析圖；
[0032] 圖7為定點(diǎn)整合克隆堿性磷酸酶呈陽(yáng)性且核型正常的結(jié)果圖； 圖8為實(shí)施例1中2. 1第一次PCR循環(huán)條件； 圖9為實(shí)施例1中2. 1第二次PCR循環(huán)條件； 圖10為實(shí)施例1中3. 1的PCR循環(huán)條件； 圖11為實(shí)施例1中4. 3的PCR循環(huán)條件。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 1小鼠胚胎干細(xì)胞全基因組DNA的抽提
[0035] (1)小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)3天，保證其未分化。
[0036] (2)棄去培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基，加5ml DPBS洗滌2次。
[0037] (3)棄盡 DPBS,加 1ml 0.05% trypsin/EDTA 37°C培養(yǎng)箱消化 2-3min。
[0038] (4) 3min后加5ml培養(yǎng)基終止消化，用大tip把細(xì)胞吹洗下來(lái)，并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml離心管。
[0039] (5) 1000rpm，室溫離心5min，收集細(xì)胞。
[0040] (6)棄培養(yǎng)基后加3ml DPBS洗一次，lOOOrpm，室溫離心5min。
[0041] (7)小心倒掉DPBS，加入含有200ug/ml RNA酶的0· 5ml lx細(xì)胞裂解液，劇烈振蕩 重懸細(xì)胞
[0042] (8)每管加入20%的SDS 35ul，上下顛倒混勻，直至出現(xiàn)黏稠透明裝。
[0043] (9)加入終濃度200ug/ml蛋白酶K并且顛倒混勻，于恒溫床上lOOrpm，37°C消化 6小時(shí)以上（過(guò)夜）
[0044] (10)將溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入相同體積飽和酚，輕輕搖勻，直至乳濁液形成，然 后 13000rpm，4 度離心 lOmin.
[0045] (11)將上層水相轉(zhuǎn)移至另一新的EP管中，加入相同體積的酚和氯仿（酚：氯仿= 1:1)搖勻后，13000rpm，4 度離心 lOmin。
[0046] (12)將上層液移至另一 EP管，加2倍體積預(yù)冷的乙醇，顛倒混勻，有少量的絮狀 DNA沉淀.
[0047] (13)4 度 13000rpm 離心 lOmin,收集 DNA 沉淀。
[0048] (14)棄上清，加入500ul 70%乙醇洗0嫩一遍。
[0049] (15) 13000rpm 4 度離心 5min。
[0050] (16)棄上清，點(diǎn)離，用小tip吸盡殘留的清洗液，室溫下干燥，加入20ul ddH20，充 分溶解。
[0051] (17)取 2ul 測(cè) 0D 值，并稀釋成 100ng/ul。
[0052] 2同源臂（pMr)載體的構(gòu)建
[0053] 小鼠 rDNA區(qū)靶向載體（pMrn，pMr-GFP)同源臂總長(zhǎng)度有4269sbp，為減少突變的可 能性，我們?cè)O(shè)計(jì)了利用BamH I和T-vector載體上Not I酶切位點(diǎn)分別把同源臂分成兩段 (AR1、AR2)，然后利用酶切位點(diǎn)將它們拼接成pMr同源臂載體，所有PCR過(guò)程均用phusion 高保真酶來(lái)擴(kuò)增。
[0054] 2. 1 PCR擴(kuò)增小鼠 rDNA區(qū)同源序列AR1、AR2
[0055] 以上述抽的小鼠 gDNA為模板，利用下列引物擴(kuò)增同源臂AR1
[0056] 由于rDNA區(qū)同源序列要求較高的保真性，擴(kuò)增利用了 NEB公司的高保真DNA聚合 酶-Phusion酶，擴(kuò)征片段2428bp
[0057] 其PCR擴(kuò)增體系為：
[0058] SxPhusion HF Buffer 4ui Mouse gDNA (lOOn^til) 2ul Primer F ( lOuM ) ( SEQ ID ().5ul N0.5) Primer R ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ul N0.6)
[0059] dNTP(IOmM) 0.5 ul DMSO O.611I Phusion 0,2ui ddH^O 】1.7ui total 20ul
[0060] PCR循環(huán)條件如圖8所示。
[0061]
[0062] 以上述抽的小鼠 gDNA為模板，利用下列引物擴(kuò)增同源臂AR2 ;
[0063] 由于rDNA區(qū)同源序列要求較高的保真性，擴(kuò)增利用了 NEB公司的高保真DNA聚合 酶--Phusion酶，擴(kuò)增片段為2321bp。
[0064] 其PCR擴(kuò)增體系為：
[0065] SxPhusion HF Buffer 4ul Mouse gDNA (1 OOng/ut) 2ui Primer F ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ul N0.7) Primer R ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ui NO.8) dNTP(lOmM) 0.5ul DMSO 0/ml Phasion 0,2ul ddH20 11.7ul total 20ul
[0066] PCR循環(huán)條件如圖9所示。
[0067]
[0068] 2. 2 PCR產(chǎn)物的純化
[0069] 2· 2· 1膠純化PCR產(chǎn)物
[0070] 實(shí)驗(yàn)采用試劑盒對(duì)膠中的目的片段進(jìn)行回收（我室通常使用QIAGEN GEL extraction Kit)：
[0071 ] 1)制備0. 8 %的瓊脂糖凝膠
[0072] 2)用0. 5 X TBE緩沖液中電泳上述的PCR產(chǎn)物；
[0073] 3)電泳結(jié)束后，取出凝膠在加有溴化乙錠（EB)染液中染色10?15min ;
[0074] 4)在長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈照射下進(jìn)行切膠回收目的條帶，切膠時(shí)在保證條帶完整的前 下，并且盡可能地減少瓊脂糖的體積；
[0075] 5)稱(chēng)量切膠的質(zhì)量，加入相當(dāng)于膠質(zhì)量3倍體積的buffer QG(lOOmg-lOOul)， 50°C水浴箱10min，每隔3min上下顛倒直至凝膠全部溶解。
[0076] 6)加1倍體積的異丙醇，混勻后，把液體移至純化柱，室溫13000rpm離心lmin。
[0077] 7)棄上清，加 500ul buffer QG，13000rpm 離心 lmin。
[0078] 8)棄上清，加 750ul buffer PE，13000rpm 離心 lmin。
[0079] 9)棄上清，13000rpm重新離心2min，保證無(wú)乙醇?xì)埩簟?br> [0080] 10)將柱子轉(zhuǎn)移至一新的EP管中，將15ul的滅菌水加于柱膜正中，溶解DNA2min， 室溫 13000rpm 離心 lmin，
[0081] 11)測(cè)量 0D 值。
[0082] 2. 2. 2 PCR 產(chǎn)物加 A 尾：
[0083] Phusion酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物其末端是平端，所以在T連之前需先在其3'端加 A 尾
[0084] 其體系如下：
[0085] 膠純化產(chǎn)物 12ui dNTP(lOmM) 2ui 4χ Buffer 5 ui LATaq 1 ul Total 20 72°C 30ηι?η,37Γ 30mm,
[0086] 2. 2. 3酒精純化加 A尾產(chǎn)物
[0087] 1)加入三倍體積的事先預(yù)冷的無(wú)水乙醇，放置_20°C 10min。
[0088] 2) 4°C 13000rpm 離心 10min，小心棄置懸液。
[0089] 3)力口 100ul 預(yù)冷的 75% 乙醇，放置-20°C 10min。
[0090] 4)4°C 13000rpm 離心 lOmin,小心棄置懸液。
[0091] 5)4°C 13000rpm離心lmin,用小槍吸盡上清液然后室溫干燥。
[0092] 6)加入5ul滅菌水溶解DNA。
[0093] 2. 3 PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化以及鑒定
[0094] 2. 3. 1 PCR 產(chǎn)物連接
[0095] PCR產(chǎn)物連接到T-vector上然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，抽提質(zhì)粒酶切鑒定測(cè)序等步驟。
[0096] 連接體系
[0097] 2xbulTer 5ul DNA (ARL AR2) 3ml T4連接W lul T-vector lul Total lOul 16度水浴過(guò)夜
[0098] 2.3.2大量感受態(tài)的制備以及凍存。
[0099] 1)從JM109菌種懸液劃線(xiàn)的培養(yǎng)皿中挑取一個(gè)單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，于37 °C， 280rpm，搖振培養(yǎng)約8個(gè)小時(shí)。
[0100] 2)把上述搖振的菌液接種于500ml的LB培養(yǎng)液中，37°C，280rpm搖振培養(yǎng)2個(gè)小 時(shí)。
[0101] 3)把上述搖振的菌液分裝成10管50ml菌液，然后4°C，3000rpm離心lOmin。
[0102] 4)棄去上清液，用3ml的0· lmol/L CaC12，10%甘油重懸，冰置12小時(shí)，然后按照 每管100ul分裝，凍存在-70°C。
[0103] 2. 2. 2. 3. 3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0104] 1)取上述_70°C凍存的JM109感受態(tài)細(xì)胞置冰上溶解。
[0105] 2)取5ul連接產(chǎn)物或lul質(zhì)粒（50-100ng)加到100ul感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻， 冰置30min。
[0106] 3)42°〇水浴9〇8，并迅速放到冰上2!1^11。
[0107] 4)加200ul液體LB，于搖床上37°C、180rpm搖振培養(yǎng)45min。
[0108] 5)4500rpm離心5min，倒掉上清，留100ul菌液，吹打混勻，在超凈工作臺(tái)鋪皿。
[0109] 6)37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12_16h。
[0110] 7)出現(xiàn)克隆后，挑取小的邊緣不規(guī)整的克隆于含有氨芐青霉素抗性L(fǎng)B擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0111] 2. 3. 4質(zhì)粒的小量制備
[0112] 質(zhì)粒DNA小量制備用的是OMEGA公司的Plasmid mini kit I抽提，具體抽提按照 試劑盒protocol操作。
[0113] 1)將 1. 5ml 菌液加到 EP 管中，13000rpm 離心 lmin。
[0114] 2)倒掉上清，加250ul的Solution I溶液，劇烈振蕩，使細(xì)菌重懸于其中（確保細(xì) 菌全部重懸）。
[0115] 3)加入250ul Solution II溶液（注意觀(guān)察Solution II是否有絮狀沉淀，若有 37°C水浴至絮狀沉淀溶解），輕輕顛倒4-5次混勻（避免劇烈的振蕩，以防染色體DNA斷裂， 質(zhì)粒溶度過(guò)低），室溫孵育2-3min。
[0116] 4)加入350ul預(yù)冷的Solution III溶液，混勻，可見(jiàn)白色絮狀沉淀生成，室溫下 13000rpm 離心 10min。
[0117] 5)平衡 HiBind Miniprep Column I 柱子：往柱子加入 200ul GPS buffer，室溫靜 置 2_5min，室溫下 13000rpm 離心 10min。
[0118] 6)小心地將上清轉(zhuǎn)移到步驟（5)平衡好的柱子，13000rpm、室溫離心lmin。
[0119] 7)棄去收集管的廢液，再加入 500ul 的Buffer HB來(lái)洗HiBind Miniprep Column, 13000rpm、室溫離心lmin(這步主要是將殘余的蛋白質(zhì)除去干凈）
[0120] 8)棄去收集管的廢液，再加入750ul的DNA Wash Buffer來(lái)洗HiBind Minipr印 Column，13000rpm、室溫離心 lmin
[0121] 9)棄去收集管的廢液，再13000rpm、室溫離心2min以除凈殘留的乙醇（不要省略 這一步，對(duì)能否提出質(zhì)粒這步很重要。）
[0122] 10)把收集柱子放置于新的1.5ml EP管用于收集質(zhì)粒DNA。加入20ul ddH20與 柱子中間，室溫放置2min溶解DNA。
[0123] 11) 13000rpm、室溫離心2min，離心液即所抽提的質(zhì)粒DNA。再測(cè)量0D值。
[0124] 2. 3. 5質(zhì)粒的酶切鑒定：
[0125] 先用1 %的瓊脂糖膠跑個(gè)質(zhì)粒電泳，觀(guān)察電泳條帶，把疑似有插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行 酶切鑒定。
[0126] 所用限制性?xún)?nèi)切酶均為NEB公司的酶，酶切體系如下：
[0127] lO^Buffer 2 Plasmid 5 ill Not I 0.5 ul BaniH I §,5ul iOOxBSA 0,2ul ddH：〇 11,8 ul Total 20 ul
[0128] 7°C反應(yīng)2_3h，取10ul點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0129] 2. 3. 6同源臂的連接
[0130] 把酶切鑒定是陽(yáng)性的質(zhì)粒送到博尚公司測(cè)序。然后把經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定沒(méi)有突變的 AR1，AR2經(jīng)過(guò)Not I、BamH I酶切，膠純化以及連接構(gòu)造 pMr同源臂空載體。酶切體系、膠 純化步驟如上述相同。
[0131] 1)T-AR1質(zhì)粒大小為5428bp，用Not I和BamH I酶切，可以得到2096bp和3332bp 片段的兩條片段，其中2096bp片段是目的片段，稱(chēng)為片段1。
[0132] 2)T-AR2質(zhì)粒大小為5421bp，用Not I和BamH I酶切，可以得到147bp和5273bp 片段的兩條片段，其中5274bp片段是目的片段，稱(chēng)為片段2。
[0133] 3)用膠純化回收片段1、片段2,并測(cè)0D值，記下其濃度。
[0134] 4)用以下體系把片段1、片段2連接。
[0135] 10^T4 Ligasc BulTcr 2ul
[0136] Μ'段 2 100 ng j',段 I variaWc (片段丨；片段2摩爾數(shù)比 ….…、 i ul 3:1-10:1) T4 DNA Ligase(5U/ul) To 20 ul ddH20 2〇 Ul Total volume
[0137] 16度水浴過(guò)夜。轉(zhuǎn)化以及pMr載體質(zhì)粒小量制備跟上述相同。
[0138] 2. 3. 7 pMr載體酶切鑒定
[0139] 取所制備的載體用Not I和EcoR I酶切，酶切體系跟上述相同。可以得到兩個(gè)片 段，片段大小分別為3108bp，4232bp。
[0140] 3 pMrn載體的構(gòu)建
[0141] 3. 1 Τ-Neo 載體構(gòu)建
[0142] PCR擴(kuò)增Neo基因，其中包括腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列 (EMCV-IRES)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因開(kāi)放閱讀框和SV40polyA序列，簡(jiǎn)稱(chēng)Neo。并且在擴(kuò)增 中利用上游引物依次加入了 EcoR I位點(diǎn)、野生型ΙοχΡ位點(diǎn)，下游引物依次加入了 EcoR I 位點(diǎn)、突變型l〇xP2272位點(diǎn)。
[0143] 在擴(kuò)增之前由于上游引物和下游引物loxp之間的回文序列互補(bǔ)，不易擴(kuò)增，所以 得對(duì)上下游引物預(yù)處理。99攝氏度5min后馬上放置冰上3min。然后再按照以下體系擴(kuò)增。 擴(kuò)增利用了 NEB公司的Phusion酶，擴(kuò)增出1904bp片段。其PCR擴(kuò)增體系為：
[0144] 5X Phusion HF Buffer 4ul pHrNco (lOOng/ul) 2ui Primer F (lOuM ) (SEQ ID NO.9) ().5ul Primer R (lOuM) (SEQIDNO.10) 〇.5ul dKTP( H)mM) 0.5ul Phusion D.2ul dd H20 12,3ul total 20ul
[0145] PCR循環(huán)條件如圖10所示。
[0146]
[0147] 3.2pMrn 構(gòu)建完成
[0148] 1)將上述T-Neo用Ecorl酶切，然后在經(jīng)過(guò)膠回收分別得到Neo基因。
[0149] 2)用EcoR I單酶切pMr，得到線(xiàn)性化pMr片段，為防止自連，對(duì)其骨架去磷酸化處 理。其體系為：
[0150] 1〇χ AP Buffer 2ul 線(xiàn)件.DMA l?ul ΠΑΡ lul Total 20 ul 37Γ 30min
[0151] 3)然后再膠純化處理得到骨架去磷酸化的pMr線(xiàn)性化載體。
[0152] 4)分別將Neo和pMr連接，構(gòu)建成pMrn載體。
[0153] 中間過(guò)程涉及到的膠純化、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提以及鑒定過(guò)程同前述。
[0154] 小結(jié)：
[0155] pMrn載體構(gòu)建結(jié)果：
[0156] 抽提小鼠胚胎干細(xì)胞gDNA，并以此作為模板，通過(guò)調(diào)整PCR體系以及溫度條件，擴(kuò) 增AR1，AR2,結(jié)果顯示均能特異性擴(kuò)增出片段。再按設(shè)計(jì)的流程相互連接，最終將4370bp的 HS連接至T載體上，構(gòu)建成pMr。通過(guò)Not I和Nhe I對(duì)pMr進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示酶切 后的條帶符合預(yù)期大小，表明載體構(gòu)建成功。最后通過(guò)EcoR I將EMCV - IRES連接至pMr 中，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定表明最終構(gòu)建成pMrn載體（圖1、2、3和4)。
[0157] 4 pMrn載體介導(dǎo)在小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)的基因打靶
[0158] 4. 1細(xì)胞準(zhǔn)備
[0159] (1)在細(xì)胞傳代培養(yǎng)中，把細(xì)胞接種在預(yù)先包被的matri膠中，每天換液觀(guān)察細(xì)胞 生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0160] (2)待培養(yǎng)3d左右，加入1ml 0· 05% trypsin/EDTA，放置于培養(yǎng)箱消化3-5min。
[0161] (3)用大槍吹打細(xì)胞，把mESCs細(xì)胞吹打成單細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移置15ml離心管，混勻， 取100ul細(xì)胞懸液用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取2xl0 7個(gè)細(xì)胞，以lOOOrpm離心5min。
[0162] (4)棄上清，再加入5ml D-PBS重懸細(xì)胞，以lOOOrpm離心5min。
[0163] (5)棄盡上清，用中槍小心的把上清吸干凈，然后再加入800ul D-PBS重懸細(xì)胞， 并在冰上孵育10min，然后加20ug事先處理過(guò)的線(xiàn)性化打靶載體與之混勻。
[0164] (6)用移液槍把步驟（5)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移置電轉(zhuǎn)杯中。
[0165] (7)把電轉(zhuǎn)杯置于電轉(zhuǎn)儀中，以500V，250uF用電穿孔方法打靶小鼠胚胎干細(xì)胞， 使其利用同源重組方式定點(diǎn)整合到小鼠 rDNA區(qū)。
[0166] (8)將電轉(zhuǎn)的細(xì)胞馬上置于冰上孵育10min。
[0167] (9)把經(jīng)電轉(zhuǎn)并且孵育的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到事先準(zhǔn)備好的MEF飼養(yǎng)層培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，6h 后換液，去除死細(xì)胞。
[0168] 4.2細(xì)胞篩選
[0169] (1)電轉(zhuǎn)的mESCs細(xì)胞，第二天換液用加有50ug/ml G418篩選，其他培養(yǎng)跟正常小 鼠胚胎干細(xì)胞一樣。
[0170] (2)培養(yǎng)5-6天后可以看到有小克隆形成繼續(xù)篩選培養(yǎng)，每天觀(guān)察期狀態(tài)，并且拍 照記下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)
[0171] 4. 3定點(diǎn)PCR鑒定及Southern鑒定
[0172] 4. 3. 1 PCR鑒定定點(diǎn)整合克隆
[0173] 以抽提的細(xì)胞克隆gDNA為模板，用定點(diǎn)整合引物screen-rc/screen-dn進(jìn)行擴(kuò) 增，若為定點(diǎn)整合陽(yáng)性，則擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物片段為1. 4kb。
[0174] PCR反應(yīng)體系為：
[0175] 2x〇C Buffer I: ΙΟ.ΟμΙ dNTP: 1 ,ΟμΙ LA-Taq DNA polymerase: 0.2μ 1 scrccn-rc: 1,0 μ 1 sc rccn-dn: 1 .0 μ 1 gDNA: 2.0μΙ
[0176] ddH2〇： 4,8μΙ Total: 20,0μ1
[0177] PCR循環(huán)條件如圖11所示。
[0178]
[0179] 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ 1 PCR產(chǎn)物以0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
[0180] 4. 3. 2 Southern blot 鑒定（參照 DIG HIGH PRME DNA LABELING試劑盒，Roche)
[0181] 小結(jié)：
[0182] pMrn打靶小鼠胚胎干細(xì)胞rDNA區(qū)的驗(yàn)證：
[0183] 采用電轉(zhuǎn)或核轉(zhuǎn)的方式將pMrn導(dǎo)入到mESCs中，經(jīng)G418藥物篩選出抗性的mESCs 克?。▓D5)。再通過(guò)定點(diǎn)整合PCR以及Southern Blot鑒定，能檢測(cè)到與整合基因組rDNA 后一致的片段大?。▓D6)。經(jīng)打靶后的mESCs仍然保持細(xì)胞核型正常，且多能性標(biāo)志物堿 性磷酸酶成強(qiáng)陽(yáng)性，初步表明小鼠 rDNA區(qū)基因打靶的安全性（圖7)。
【權(quán)利要求】
1. 一種小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體，其特征在于，所述打靶載體中含有如SEQ ID NO. 1 所示的同源臂序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的打靶載體，其特征在于，所述打靶載體的空載體為T(mén)載體，pEGFP 載體或pcDNA3. 1載體。
3. 如權(quán)利要求2所述的打靶載體，其特征在于，所述打靶載體的序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
4. 如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述打靶載體的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下 步驟： (1) 以小鼠胚胎干細(xì)胞的gDNA作為模板，將SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列擴(kuò)增為AR1 和AR2兩段序列，AR1序列如SEQ ID NO. 3所示；AR2序列如SEQ ID NO. 4所示； (2) 將AR1序列連接至打靶載體的空載體，得載體AR1 ;將AR2序列連接至打靶載體的 空載體，得載體AR2 ; (3) 待載體AR1和載體AR2測(cè)序正確后，通過(guò)Not I和BamH I將AR1序列從載體AR1 上酶切下來(lái)；通過(guò)Not I和BamH I將AR2序列從載體AR2上酶切下來(lái)；將酶切下來(lái)的AR1 和AR2連接，構(gòu)建成含有SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的載體pMr ; (4) 在載體pMr中SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的EcoR I酶切位點(diǎn)出連入正選擇篩選 基因 Neo,構(gòu)建成小鼠核糖體基因區(qū)打靶載體pMrn。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104232684SQ201410442448
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】梁德生, 李卓, 鄔玲仟 申請(qǐng)人:中南大學(xué), 湖南家輝生物技術(shù)有限公司家輝遺傳專(zhuān)科醫(yī)院