一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法。該煙草角斑病菌的分子鑒定引物如序列表SEQIDNO:1至SEQIDNO:2所示，其中，序列SEQIDNO:1為鑒定煙草角斑病菌的上游引物，序列SEQIDNO:2為鑒定煙草角斑病菌的下游引物。本發(fā)明所述煙草角斑病菌分子鑒定引物可以特異性鑒定煙草角斑病病菌。此外，本發(fā)明還提供了可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高的煙草角斑病菌快速分子鑒定的方法。
【專利說明】一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法，屬于植物病菌檢測(cè)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。煙草角斑?。≒seudomonas syringae pv.angulata)是煙草主要的細(xì)菌性病害，在我國北方煙區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，每年均造成一定程度 的危害和經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 傳統(tǒng)細(xì)菌的分類鑒定主要是基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定、生理生化特性等，工作 繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)，鑒定時(shí)還易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾，而且不能直接從植物組織中檢 測(cè)出病原菌，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測(cè)要求，很容易錯(cuò)過病害防治的最 佳時(shí)期，而免疫血清學(xué)鑒定方法特異性較差，常常受到抗血清質(zhì)量的影響，容易造成假陽 性，因此這些方法的應(yīng)用均受到一定的限制。目前，我國官方機(jī)構(gòu)進(jìn)行細(xì)菌鑒定過程中主要 采用傳統(tǒng)的分類學(xué)鑒定以及生物學(xué)鑒定（16S rRNA序列測(cè)定分析）相結(jié)合的方式，鑒定時(shí) 間至少需要1個(gè)月以上，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中所面臨的需要及時(shí)快速鑒定的病原菌，這些 方法存在明顯的不足。隨著生物技術(shù)在病害鑒定方面開發(fā)應(yīng)用及病菌DNA數(shù)據(jù)在基因庫中 的不斷積累，使分子生物學(xué)方法鑒定細(xì)菌種類技術(shù)日趨完善和成熟。建立細(xì)菌的PCR特異 鑒定引物，利用細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)及PCR技術(shù)，可以在（1-2) d內(nèi)對(duì)初期侵染的細(xì)菌進(jìn)行鑒 定，從而指導(dǎo)煙農(nóng)及時(shí)準(zhǔn)確用藥，對(duì)保障我國煙葉生產(chǎn)具有重要的意義。
[0004] 對(duì)于煙草角斑病的分子鑒定方法，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)的蔣世君等2010年申請(qǐng)了中國 專利CN 101206193"快速檢測(cè)和鑒定煙草野火病菌和角斑病菌的方法"，該方法涉及的角斑 病菌的PCR鑒定引物設(shè)計(jì)于hrpZ基因，且同時(shí)擴(kuò)增出煙草野火病菌，也就是說不能有效區(qū) 分野火病和角斑病或者其它丁香假單孢菌。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中煙草角斑病菌的生物學(xué)檢測(cè)方法特異性差、靈敏 度低、周期長(zhǎng)、血清學(xué)鑒定方法成本高并易造成假陽性等問題，提供煙草角斑病菌特異分子 鑒定引物以及可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高的煙草角斑病菌快速分子鑒定的方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 基于煙草角斑病的AvrPphE基因區(qū)域設(shè)計(jì)合成了煙草角斑病菌特異的PCR鑒定引 物，該引物可以特異鑒別煙草角斑病菌，煙草野火病菌、其它的丁香假單孢菌及煙草葉面分 離的其它細(xì)菌分離物均擴(kuò)增不出特異的條帶。
[0008] 具體地，一組煙草角斑病菌的分子鑒定引物，如下：

【權(quán)利要求】
1. 一組煙草角斑病菌的分子鑒定引物，其特征在于，該引物如序列表SEQ ID NO :1至 SEQ ID NO :2所示，其中，序列SEQ ID NO: 1為鑒定煙草角斑病菌的上游引物，序列SEQ ID NO :2為鑒定煙草角斑病菌的下游引物。
2. -種煙草角斑病菌的鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 煙草角斑病菌分離培養(yǎng)； (2) PCR擴(kuò)增；其中，PCR擴(kuò)增時(shí)的引物為序列SEQ ID NO :1所示的用于鑒定煙草角斑 病菌的上游引物，序列SEQ ID NO :2所示的用于鑒定煙草角斑病菌的下游引物； (3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離及結(jié)果判別。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，煙草角斑病菌分離培養(yǎng)的具體步驟 為：用滅菌的剪刀將煙草角斑病疑似病葉病斑剪下，消毒后置于LB固體培養(yǎng)基中25°C培養(yǎng) 2-3天，收集病斑周圍長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落于無菌的LB液體培養(yǎng)基中，混勻后，吸取菌液涂LB固 體平板，25°C培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)，用于PCR檢測(cè)，或者直 接用滅菌牙簽蘸取單菌落用于PCR檢測(cè)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離及結(jié)果判別的具體 步驟為：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖電泳分離，于紫外分析儀中根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判 定結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104212896SQ201410445480
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】萬秀清, 喬嬋, 李若, 李麗杰, 王春軍, 元野, 賀國強(qiáng), 顏培強(qiáng), 李尊強(qiáng), 郭思達(dá), 孫宏偉, 焦玉生, 李恒全, 邱恩建, 劉德育, 陳榮平, 黃磊, 張海霞, 劉偉, 魏繼承 申請(qǐng)人:中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學(xué)研究所