一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法制備的禽流感疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法制備的禽流感疫苗。本發(fā)明主要利用雞胚無限稀釋法對(duì)流感病毒進(jìn)行純化，提高了病毒的增殖能力和毒液滴度，制備的病毒含量可以高達(dá)IO^^EIDjo/O.lmL?lCT9.5EID50/0.lmL;培養(yǎng)流感病毒時(shí)稀釋倍數(shù)有所提高，提高了病毒的增殖活力，并且節(jié)約了病毒培養(yǎng)時(shí)間；以本發(fā)明方法培養(yǎng)的流感病毒無需濃縮，無需濃縮或稀釋后制備成品疫苗，簡(jiǎn)化了后續(xù)疫苗生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本；利用本發(fā)明制備的流感病毒滅活疫苗，免疫雞群后能夠較快的產(chǎn)生抗體，并且抗體持續(xù)期長(zhǎng)，疫苗的保護(hù)率有所提高。
【專利說明】一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法制備的禽流感疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法 制備的禽流感疫苗。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（Avian Influenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一種禽類烈性傳 染病，被國(guó)際獸疫局定為I類傳染病。根據(jù)毒株致病性的不同，禽流感可分為高致病性禽流 感和低致病性禽流感兩大類。H9亞型禽流感屬于低致病性禽流感，產(chǎn)蛋家禽感染后，可引 起產(chǎn)蛋率下降，軟殼蛋、無殼蛋增多，嚴(yán)重的將會(huì)停止產(chǎn)蛋。種禽感染后，除上述癥狀外，還 表現(xiàn)出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雛禽出殼困難，出殼后的雛禽弱雛增多。 雛禽在一周內(nèi)死亡率較高，且易感染大腸桿菌，治療較困難。H9亞型禽流感混合感染其他病 原時(shí)，可導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率的大幅度提高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。
[0003] 疫苗接種是預(yù)防和控制流感病毒流行的最有效手段。目前，控制禽流感病毒發(fā)病 的主要手段是接種滅活全病毒疫苗，其生產(chǎn)主要依靠雞胚法實(shí)現(xiàn)。為了提高滅活疫苗的免 疫原性，必須提高疫苗制備時(shí)抗原的含量，故如何提高病毒滴度成為關(guān)鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)在，提高 流感病毒含量的方法主要通過濃縮的方法實(shí)現(xiàn)，這樣將提高疫苗制備的成本，使疫苗制備 過程復(fù)雜化，并且增加了病毒液的損失和污染風(fēng)險(xiǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法 制備的禽流感疫苗，旨在節(jié)約疫苗制備成本，提升生產(chǎn)效率。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] 一種禽流感病毒增殖方法，包括以下步驟：
[0007] 1)對(duì)禽流感病毒進(jìn)行復(fù)蘇處理；
[0008] 2)將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行梯度稀釋，以各稀釋度病毒液接種雞胚， 再取全部受感染雞胚尿囊液中其HA效價(jià)排名處于前10%或前20%的尿囊液作為種子批；
[0009] 3)將步驟2)得到的種子批分別接種雞胚并傳代6?10代，將各代次受感染雞胚 尿囊液中EID 5tl指標(biāo)彡1(T9_°EID5(i/0. ImL的種子批作為基礎(chǔ)種子批；
[0010] 4)將步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批接種雞胚，增殖禽流感病毒。
[0011] 優(yōu)選的，步驟1)所述的復(fù)蘇處理包括以下流程：取出凍存的禽流感病毒，進(jìn)行 KT3?KT 4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，36. 5?37. 5°C培養(yǎng)，收獲24?96h死亡胚和96h 活胚尿囊液，傳2?3代，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液即為復(fù)蘇處理完畢的病 毒液。
[0012] 優(yōu)選的，步驟2)具體包括以下流程：將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行10倍 系列稀釋，分別取稀釋度為10'10'10'Kr'KT 11的病毒液接種雞胚，每個(gè)稀釋度接種 若干雞胚，接種量為0. 08?0. 12mL，36. 5?37. 5°C孵育，分別收集接種后24-96h死亡胚和 96h未死雞胚尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)并以HA效價(jià)> (1:256)認(rèn)定為雞胚已感染病毒，在已感 染病毒的雞胚尿囊液中選取由最大稀釋倍數(shù)病毒液接種雞胚得到的尿囊液1?2例作為后 續(xù)傳代用病毒液，以此重復(fù)上述稀釋、篩選步驟3?5代，每代、每例尿囊液分別保存，將其 中HA效價(jià)排名處于前10%或前20%的尿囊液作為種子批；
[0013] 優(yōu)選的，步驟3)具體包括以下流程：將步驟2)得到的種子批進(jìn)行KT3?KT 4稀 釋，接種10日齡SPF雞胚，36. 5?37. 5°C培養(yǎng)，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再 傳6?10代，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液從中篩選病毒含量彡l〇- 9_°EID5Q/0. ImL 的尿囊液作為基礎(chǔ)種子批。
[0014] 優(yōu)選的，步驟4)具體包括以下流程：將步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批進(jìn)行KT3-KT 6稀 釋，接種雞胚，收獲24?96h雞胚尿囊液即為病毒液；進(jìn)一步的，可以優(yōu)選為以下流程：將 步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批進(jìn)行KT 4-KT5稀釋，接種雞胚，收獲65?75h雞胚尿囊液即為病 毒液。
[0015] 優(yōu)選的，步驟1)所述的禽流感病毒為H9亞型禽流感病毒。
[0016] 優(yōu)選的，步驟1)所述的禽流感病毒含量為l〇-8_°EID5Q/0. ImL?l〇-8 5EID5Q/0. lmL。
[0017] 優(yōu)選的，步驟1)所述的禽流感病毒含量為1(T8_3EID 5tlA). lmL。
[0018] 此外，本發(fā)明還提供了利用上述禽流感病毒增殖方法進(jìn)一步制備的禽流感疫苗， 該疫苗由以下方法制備：
[0019] 1)病毒的滅活：將利用上述禽流感病毒增殖方法制備的禽流感病毒液用甲醛滅 活，甲醛終濃度為1%。，20°C滅活20小時(shí)得到滅活毒液；
[0020] 2)水相的制備：水相的制備：將滅活毒液以3500r/min離心20min，經(jīng)8層紗布過 濾，將過濾后的滅活毒液與吐溫80以（22?26) : 1的比例混勻，即得到疫苗水相；
[0021] 3)油相的制備：取白油佐劑95份、司班805份、硬脂酸鋁2份混勻，即得到疫苗油 相；
[0022] 4)疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，以12000r/min轉(zhuǎn)速剪切 2-5min，即得到禽流感疫苗。
[0023] 優(yōu)選的，所述白油佐劑型號(hào)為Marc〇152。
[0024] 本發(fā)明技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明主要利用雞胚無限稀釋法對(duì)流感病毒進(jìn)行 純化，提高了病毒的增殖能力和毒液滴度，制備的病毒含量可以高達(dá)KT 91EID5ciA). ImL? KT9 5EID5tlA). ImL ;培養(yǎng)流感病毒時(shí)稀釋倍數(shù)有所提高，提高了病毒的增殖活力，并且節(jié)約 了病毒培養(yǎng)時(shí)間；以本發(fā)明方法培養(yǎng)的流感病毒無需濃縮，無需濃縮或稀釋后制備成品疫 苗，簡(jiǎn)化了后續(xù)疫苗生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本；利用本發(fā)明制備的流感病毒滅活疫苗，免疫 雞群后能夠較快的產(chǎn)生抗體，并且抗體持續(xù)期長(zhǎng)，疫苗的保護(hù)率有所提高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例2制備的疫苗接種后產(chǎn)生的抗體水平對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1
[0027] -種禽流感病毒增殖方法，包括以下步驟：
[0028] 1)取出凍存的禽流感病毒，進(jìn)行KT3稀釋，接種10日齡SPF雞胚，37°C培養(yǎng)，收獲 24-96h雞胚尿囊液，傳3代，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液即為復(fù)蘇處理完畢的 病毒液。
[0029] 2)將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取稀釋度為10' 10' 10' KT' 10_n的病毒液接種雞胚，每個(gè)稀釋度接5枚雞胚，接種量為0. lmL，36. 5? 37. 5°C孵育，分別收集接種后24-96h死亡胚和96h未死雞胚尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)并以HA效 價(jià)> (1:256)認(rèn)定為雞胚已感染病毒，在已感染病毒的雞胚尿囊液中選取由最大稀釋倍數(shù) 病毒液接種雞胚得到的尿囊液2例作為后續(xù)傳代用病毒液，以此重復(fù)上述稀釋、篩選步驟5 代，每代、每例尿囊液分別保存，將其中HA效價(jià)排名處于前10%的尿囊液作為種子批；
[0030] 3)將步驟2)得到的種子批進(jìn)行KT3?KT4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，37°C培 養(yǎng)，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再傳8代，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿 囊液從中篩選病毒含量> l〇_9_°EID5(l/0. ImL的尿囊液作為基礎(chǔ)種子批，在傳代過程中發(fā)現(xiàn)， 隨代次的變化其尿囊液中病毒含量的變化為Pl =KT8 9EID5tlA). lmL，P2 :l〇-91EID5Q/0. lmL， P3 : KT9.3EID50A). lmL，P4 : KT9.5EID50A). lmL，P5 :1(T9.3EID50A). lmL，P6 : KT9.3EID50A). lmL， P7 : KT8. 7EID5(i/0. lmL，P8 : KT8. 3EID5(i/0. lmL。
[0031] 4)分別將基礎(chǔ)種子批進(jìn)行10'10'10'KT6稀釋并分別接種雞胚，并考察各稀釋 倍數(shù)的種子批接種雞胚后24-96h收獲雞胚尿囊液時(shí)的病毒含量。結(jié)果證明將毒種進(jìn)行KT 4 稀釋、接種后70h收獲得到的尿囊液病毒含量最高，達(dá)到I(T9 5EID5tlA). lmL。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 一種禽流感病毒增殖方法，包括以下步驟：
[0034] 1)取出凍存的禽流感病毒，進(jìn)行10_4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，36. 5°C培養(yǎng)，收 獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，傳2代，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液即 為復(fù)蘇處理完畢的病毒液。
[0035] 2)將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取稀釋度為10' 10' 10' KT' 10_n的病毒液接種雞胚，每個(gè)稀釋度接10枚雞胚，接種量為0. 08mL，36. 5°C 孵育，分別收集接種后24-96h死亡胚和96h未死雞胚尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)并以HA效價(jià) > (1:256)認(rèn)定為雞胚已感染病毒，在已感染病毒的雞胚尿囊液中選取由最大稀釋倍數(shù)病 毒液接種雞胚得到的尿囊液1例作為后續(xù)傳代用病毒液，以此重復(fù)上述稀釋、篩選步驟4 代，每代、每例尿囊液分別保存，將其中HA效價(jià)排名處于前20%的尿囊液作為種子批；
[0036] 3)將步驟2)得到的種子批進(jìn)行KT3?KT4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，37. 5°C 培養(yǎng)，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再傳10代，收獲24?96h死亡胚和96h活 胚尿囊液從中篩選病毒含量> l〇_9_°EID5(l/0. ImL的尿囊液作為基礎(chǔ)種子批。
[0037] 4)將基礎(chǔ)種子批進(jìn)行KT5稀釋而后接種雞胚，接種后65h收獲被接種雞胚的尿囊 液，即得到禽流感病毒。
[0038] 實(shí)施例3
[0039] 一種禽流感病毒增殖方法，包括以下步驟：
[0040] 1)取出凍存的禽流感病毒，進(jìn)行KT4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，37. 5°C培養(yǎng)，收 獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，傳3代，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液即 為復(fù)蘇處理完畢的病毒液。
[0041] 2)將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取稀釋度為10' 10' 10' KT' 10_n的病毒液接種雞胚，每個(gè)稀釋度接15枚雞胚，接種量為0. 12mL，37. 5°C 孵育，分別收集接種后24-96h死亡胚和96h未死雞胚尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)并以HA效價(jià) > (1:256)認(rèn)定為雞胚已感染病毒，在已感染病毒的雞胚尿囊液中選取由最大稀釋倍數(shù)病 毒液接種雞胚得到的尿囊液1例作為后續(xù)傳代用病毒液，以此重復(fù)上述稀釋、篩選步驟3 代，每代、每例尿囊液分別保存，將其中HA效價(jià)排名處于前20%的尿囊液作為種子批；
[0042] 3)將步驟2)得到的種子批進(jìn)行KT3?KT4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，36. 5°C 培養(yǎng)，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再傳6代，收獲24?96h死亡胚和96h活 胚尿囊液從中篩選病毒含量> l〇_9_°EID5(l/0. ImL的尿囊液作為基礎(chǔ)種子批。
[0043] 4)將基礎(chǔ)種子批進(jìn)行KT4 5稀釋而后接種雞胚，接種后75h收獲被接種雞胚的尿 囊液，即得到禽流感病毒。
[0044] 實(shí)施例4
[0045] 取實(shí)施例1制備的禽流感病毒進(jìn)行如下工藝，以制備禽流感疫苗：
[0046] 4. 1病毒的滅活
[0047] 將上述的病毒液進(jìn)行滅活，甲醛終濃度為1%。，20°C滅活20小時(shí)。滅活檢驗(yàn)證明毒 液滅活完全。
[0048] 4. 2疫苗的制備
[0049] 水相的制備：將滅活的毒液以3500r/min離心20min，經(jīng)8層紗布過濾。取96份 滅活的毒液，4份吐溫80混勻。該水相包括4種毒液，即克隆法獲得的高滴度毒液（病毒含 量為1(T9_ 3EID5tlA). ImL)、克隆法獲得毒液的稀釋液（病毒含量為1(T8_ 3EID5tlA). ImL) HSy 株禽流感病毒繁殖毒液（病毒含量為1(T8_3EID5(i/0. lmL)、Sy株禽流感病毒濃縮毒液（病毒 含量為 ΚΓ9· 3EID5tlA). ImL)。
[0050] 油相的制備：進(jìn)口白油95份，司班805份，硬脂酸鋁2份。
[0051] 疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，12000r/min剪切2-5min即可。
[0052] 4. 3疫苗的質(zhì)量檢測(cè)
[0053] 疫苗的劑型、穩(wěn)定性和粘度檢測(cè)均證明制備的疫苗合格。
[0054] 4. 4疫苗的安全性檢驗(yàn)
[0055] 取上述制得的4種疫苗進(jìn)行如下檢驗(yàn)：
[0056] 將疫苗分別進(jìn)行1次超劑量（ImL)和單劑量重復(fù)接種（0. 3mLX2)的安全試驗(yàn)。觀 察14天，試驗(yàn)雞均無任何局部和全身不良反應(yīng)，疫苗安全性良好。
[0057] 4. 5疫苗的效力檢驗(yàn)
[0058] 4. 5. 1血清學(xué)方法
[0059] 取3-4周齡SPF雞接種疫苗，第1組注射原始Sy株禽流感病毒繁殖毒液制備的疫 苗，第2組注射克隆法獲得毒液的稀釋液制備的疫苗，第3組注射克隆法獲得的高滴度毒液 制備的疫苗，第4組注射Sy株禽流感病毒濃縮毒液制備的疫苗，第5組注射磷酸鹽緩沖液 作為對(duì)照，同樣條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)條件見表1，免疫后每周采集血清，直至免疫后第8周，按 照《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定的血凝抑制試驗(yàn)（HI)方法對(duì)特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。
[0060] 表1不同組疫苗免疫劑量及分組
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種禽流感病毒增殖方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 對(duì)禽流感病毒進(jìn)行復(fù)蘇處理； 2) 將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行梯度稀釋，以各稀釋度病毒液接種雞胚，再取 全部受感染雞胚尿囊液中其HA效價(jià)排名處于前10%或前20%的尿囊液作為種子批； 3) 將步驟2)得到的種子批分別接種雞胚并傳代6?10代，將各代次受感染雞胚尿囊 液中EID5tl指標(biāo)彡1(T 9_°EID5(i/0. ImL的種子批作為基礎(chǔ)種子批； 4) 將步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批接種雞胚，增殖禽流感病毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒增殖方法，其特征在于步驟1)所述的復(fù)蘇 處理包括以下流程：取出凍存的禽流感病毒，進(jìn)行1〇_ 3?1〇_4稀釋，接種10日齡SPF雞胚， 36. 5?37. 5°C培養(yǎng)，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，傳2?3代，收獲24?96h 死亡胚和96h活胚尿囊液即為復(fù)蘇處理完畢的病毒液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒增殖方法，其特征在于步驟2)具體包括以 下流程：將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取稀釋度為1〇_ 7、1〇_8、 10_9、ΙΟ-1'10- 11的病毒液接種雞胚，每個(gè)稀釋度接種若干雞胚，接種量為0· 08?0· 12mL， 36. 5?37. 5°C孵育，分別收集接種后24-96h死亡胚和96h未死雞胚尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)并 以HA效價(jià)> (1:256)認(rèn)定為雞胚已感染病毒，在已感染病毒的雞胚尿囊液中選取由最大稀 釋倍數(shù)病毒液接種雞胚得到的尿囊液1?2例作為后續(xù)傳代用病毒液，以此重復(fù)上述稀釋、 篩選步驟3?5代，每代、每例尿囊液分別保存，將其中HA效價(jià)排名處于前10%或前20% 的尿囊液作為種子批。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒增殖方法，其特征在于步驟3)具體包括以下 流程：將步驟2)得到的種子批進(jìn)行KT3?KT 4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，36. 5?37. 5°C 培養(yǎng)，收獲24?96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再傳6?10代，收獲24?96h死亡胚和 96h活胚尿囊液從中篩選病毒含量> 1(T9_°EID5(i/0. ImL的尿囊液作為基礎(chǔ)種子批。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒增殖方法，其特征在于步驟4)具體包括以下 流程：將步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批進(jìn)行KT 3-KT6稀釋，接種雞胚，收獲24?96h雞胚尿囊 液即為病毒液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒增殖方法，其特征在于步驟1)所述的禽流感 病毒為H9亞型禽流感病毒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒增殖方法，其特征在于步驟1)所述的禽流感 病毒含量為 1(T8_〇EID5(i/0. ImL ?ΚΓ8· 5EID5tlA). lmL。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種禽流感病毒增殖方法，其特征在于步驟4)具體包括以下 流程：將步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批進(jìn)行KT 4-KT5稀釋，接種雞胚，收獲65?75h雞胚尿囊 液即為病毒液。
9. 一種禽流感疫苗，其特征在于由以下方法制備： 1) 病毒的滅活：將利用權(quán)利要求1方法制備的禽流感病毒液用甲醛滅活，甲醛終濃度 為1%〇,20°C滅活20小時(shí)得到滅活毒液； 2) 水相的制備：水相的制備：將滅活毒液以3500r/min離心20min，經(jīng)8層紗布過濾，將 過濾后的滅活毒液與吐溫80以（22?26) : 1的比例混勻，即得到疫苗水相； 3) 油相的制備：取白油佐劑95份、司班80 5份、硬脂酸鋁2份混勻，即得到疫苗油相； 4)疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，以12000r/min轉(zhuǎn)速剪切2-5min， 即得到禽流感疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種禽流感疫苗，其特征在于所述白油佐劑型號(hào)為 Marcol52〇
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK104212771SQ201410449666
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】張立霞, 李亞杰, 郁宏偉, 劉濤, 楊保收, 盛長(zhǎng)忠, 梁武 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司