一種稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法，利用黑曲霉C112進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，在一定培養(yǎng)條件下，所得β-葡萄糖苷酶酶活力可達(dá)15.496IU/ml。將黑曲霉C112生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶與里氏木霉RUT C30生產(chǎn)的纖維素酶進(jìn)行酶系復(fù)合，制備出高活性復(fù)合纖維素酶，用于處理經(jīng)稀磷酸浸漬蒸汽爆破處理后的木質(zhì)纖維酶解糖化率可達(dá)到80％以上，同步糖化共發(fā)酵乙醇得率達(dá)到83.191％。
CCTCC NO: M 2012129
2012.04.23
【專利說(shuō)明】一種稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工及生物能源【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理 改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶是指能降解纖維素的一類多組分復(fù)合酶系的總稱，主要包括三個(gè)酶組 分：內(nèi)切型-β -葡聚糖酶（exd〇-l，4_0 -D_glucanase，EG)、外切型-β -葡聚糖酶（exo-1， 4-3_D-glucanase，CHB)和β-葡萄糖苷酶（0_glucosidase，BG)。纖維素酶的作用機(jī)理 是EG先降解纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)形成新的游離末端；然后由CHB作用于纖維素線狀 分子非還原性末端水解β-1，4-糖苷鍵形成纖維二糖；最后由BG水解纖維二糖為2個(gè)葡萄 糖。
[0003] 在纖維素的酶解糖化過(guò)程中，若BG型酶不能有效的酶解纖維二糖，將會(huì)對(duì)EG酶和 CHB酶產(chǎn)生很強(qiáng)的反饋抑制作用，最終限制纖維素的酶解糖化率。為提高纖維素酶的酶解 糖化率，十分有必要通過(guò)人工措施制備具有高活性EG、CHB和BG型纖維素酶的復(fù)合纖維素 酶。目前公認(rèn)的能產(chǎn)生高活性EG和CHB型纖維素酶的菌種為里氏木霉，而該菌種所產(chǎn)的BG 型纖維素酶活性較低。目前能產(chǎn)生高活性BG型纖維素酶的菌種為黑曲霉。將黑曲霉生產(chǎn) 的β-葡聚糖苷酶與里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶復(fù)合制備出高活性復(fù)合纖維素酶，優(yōu)化酶系 配比，提高木質(zhì)纖維素的酶解得率，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0004] 此外，木質(zhì)纖維原料是自然界最豐富的生物質(zhì)原料，主要由纖維素、半纖維素和木 質(zhì)素構(gòu)成，分別占干重的38 % -50 %，23 % -32 %，15 % -25 %。纖維素的結(jié)晶區(qū)、高聚合度、 表面空隙結(jié)構(gòu)以及纖維素、半纖維素與木質(zhì)素相互粘合形成緊密的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，均使木質(zhì)纖 維難以生物降解。因此，運(yùn)用高效的預(yù)處理技術(shù)破壞木質(zhì)纖維原料的天然結(jié)構(gòu)，解除木質(zhì)素 的包裹作用和降低纖維素與半纖維素的聚合度是高效水解的前提。本發(fā)明試圖將稀磷酸結(jié) 合蒸汽爆破預(yù)處理木質(zhì)纖維，再結(jié)合制備的高活性復(fù)合纖維素酶進(jìn)行發(fā)酵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種采用高活性復(fù)合纖維素酶處理稀磷酸結(jié)合蒸汽爆破 預(yù)處理木質(zhì)纖維進(jìn)行發(fā)酵的方法。該方法能夠明顯改善酶解效果。
[0006] -種稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法，稀酸充分浸漬木質(zhì) 纖維原料后結(jié)合蒸汽爆破，然后將爆破物脫毒，最后采用高活性復(fù)合纖維素酶進(jìn)行酶解 發(fā)酵；酶解所用的高活性復(fù)合纖維素酶的制備方法如下：分別將保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2012129的黑曲霉C112生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶與保藏編號(hào)為ATCC 56765的里氏木霉 RUT C30生產(chǎn)的纖維素酶濃縮提純，并將濃縮后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/濾紙 酶活比值為1.048?2.685 ;黑曲霉Cl 12通過(guò)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基得到高活力的 β -葡萄糖苷酶，培養(yǎng)基配方為：玉米芯25?30g/L，稻草粉20?30g/L，蛋白胨5?6g/ L，（NH4)2SO4IO ?13g/L，KH2P046 ?8g/L，CaCl2 · 2H20 0· 5 ?I. Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 5 ? I. Og/L，吐溫-801?2ml/L，Mandels微量元素濃縮液0. 5?lml/L，lmol/L朽1檬酸緩沖液 100?150ml/L，加水配制成1L。
[0007] 上述方法優(yōu)選將濃縮后的酶液混合使得β -葡萄糖苷酶活/濾紙酶活比值為 1.536 ;黑曲霉C112通過(guò)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培養(yǎng)基 配方為：玉米芯 25g/L，稻草粉 30g/L，蛋白胨 5g/L，（NH4) 2S0410g/L，KH2P046g/L，CaCl 2 ·2Η20 0· 9g/L，MgSO4 · 7Η20 0· 9g/L，吐溫-801ml/L，Mandels 微量元素濃縮液 lml/L，lmol/L 檸檬 酸緩沖液l〇〇ml/L，加水配制成1L。
[0008] 上述方法中黑曲霉C112的產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的培養(yǎng)過(guò)程如下：將黑曲霉菌C112 的種子培養(yǎng)液，以體積百分比5-8 %的接種量接種于裝有40-60ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml搖瓶 中，26-28°C，180-220r/min條件下培養(yǎng)4-6天，離心，取上清液得到粗酶液。
[0009] 上述方法中黑曲霉C112的種子培養(yǎng)：從保存的黑曲霉C112 土豆固體平板培養(yǎng)基 中挑取孢子，接種于裝有40-60ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，26-28°C，180-220r/min條件 下培養(yǎng)2?3天作為接種物；黑曲霉Cl 12種子培養(yǎng)基：馬鈴薯250?300g/L，葡萄糖15? 25g/L，pH 值 6. 5 ?7. 0。
[0010] 上述方法中黑曲霉Cl 12生產(chǎn)的纖維素酶β-葡萄糖苷酶活為13. 368?15. 496U/ mL，濾紙酶活為0. 183?0. 215IU/mL，經(jīng)超濾濃縮儀濃縮后，β -葡萄糖苷酶活為18. 793? 24. 741U/mL，濾紙酶活為0. 785?0. 932IU/mL ;里氏木霉RUT C30生產(chǎn)的纖維素酶β-葡萄 糖苷酶活為1. 205?I. 652U/mL，濾紙酶活為5. 931?6. 212IU/mL ;經(jīng)超濾濃縮儀濃縮后， β -葡萄糖苷酶活為9. 379?12. 662U/mL，濾紙酶活為43. 335?48. 912IU/mL。
[0011] Mandels 微量元素濃縮液配方為：FeSO4 · 7H20 5g/L，MnSO4 · H2O L 6g/L， ZnSO4 · 7H20 I. 4g/L，CoCl2 · 6H20 3. 7g/L，加水配制成 IL ;
[0012] lmol/L 檸檬酸緩沖液的配方為：檸檬酸（C6H8O7 · H2O) 210g，H2O 750ml，加 NaOH 78g，冷卻后測(cè)pH為4. 2,加水至1000ml，pH 4. 5。
[0013] 上述方法中所述的稀酸為質(zhì)量濃度范圍為0.05% -5%的稀磷酸（優(yōu)選 0. 05% -2% );木質(zhì)纖維原料與稀磷酸固液質(zhì)量比為1:1-1:10的范圍浸漬，浸漬時(shí)間為固 液混合均勻后l_24h (優(yōu)選木質(zhì)纖維原料與稀磷酸固液質(zhì)量比為1:2-1:5的范圍浸漬，浸 漬時(shí)間為固液混合均勻后l_12h);蒸汽爆破壓強(qiáng)為0. 5-3Mpa，保壓時(shí)間為：60-240s (優(yōu)選 蒸汽爆破壓強(qiáng)為0. 5-2. 5Mpa，保壓時(shí)間為90-220S，進(jìn)一步優(yōu)選蒸汽爆破壓強(qiáng)為2Mpa，保壓 時(shí)間為180s。）。此外，爆發(fā)速度：0.00875S。蒸汽爆破后采用氨水中和脫毒，具體的工藝 為：先加入檸檬酸緩沖液后，再用氨水調(diào)節(jié)pH至4. 5-6. 0。優(yōu)選0. 05mol/L，pH4. 8的檸檬 酸緩沖液結(jié)合l_2mol/L氨水中和脫毒。氨水與浸漬磷酸發(fā)生酸堿中和反應(yīng)易生成磷酸氫 銨，利于后續(xù)發(fā)酵。同時(shí)，可達(dá)到中和脫毒，調(diào)節(jié)，穩(wěn)定PH的目的。
[0014] 收集含水率為82±3%的爆破物，按絕對(duì)干重的爆破物與容器總裝載量體積比為 0. 05:1-0. 2:1加入，再加入占容器裝載量體積百分比15-30%的0. 05mol/L檸檬酸緩沖液， 總裝載量占容器體積的2/5-4/5,余量為水，然后加入氨水調(diào)節(jié)pH值至5. 5±0. 5,以濾紙酶 活FPU為15-30IU/g底物加入所述的高活性復(fù)合纖維素酶，50±5°C下酶解24-96h。
[0015] 收集含水率82 ± 3 %的爆破物，按絕對(duì)干重的爆破物與容器總裝載量體積比為 0.05:1-0. 2:1加入2. 5-1000L發(fā)酵罐中，再加入占發(fā)酵罐裝載量體積百分比15-30 %的 0. 05mol/L的檸檬酸緩沖液，總裝載量占容器體積的2/5-4/5,余量為水，再用l-2mol/L 氨水中和脫毒調(diào)節(jié) pH 值至 5· 5±0· 5,加入 KH2PO4O. 25-lg/L，CaCl2 · H2O 0· 0· 2-0. 8g/L， MgSO4 ·7Η20 0. 2-0. 8g/L，以濾紙酶活FPU為15-30IU/g底物加入所述的高活性復(fù)合纖維素 酶，50±5°C下酶解4-12h后，降溫至37±3°C，加入發(fā)酵菌種混合酶解發(fā)酵24-96h。
[0016] 所述的發(fā)酵菌種優(yōu)選為釀酒酵母和大腸桿菌K011，添加的細(xì)胞干重初始濃度分別 優(yōu)選為lg/L和0· 33g/L。
[0017] 上述方法中木質(zhì)纖維原料包括楊樹(shù)、桉樹(shù)、柳樹(shù)在內(nèi)的速生植物，或者秸桿、刨花、 木屑。
[0018] 上述方法中木質(zhì)纖維原料粉碎成長(zhǎng)寬3-5cm，厚< 5mm的片狀，或直徑長(zhǎng) 2-15mm的粒狀。
[0019] 本發(fā)明通過(guò)大量探索試驗(yàn)獲得利用黑曲霉產(chǎn)高活性β -葡聚糖苷酶的培養(yǎng)基，將 黑曲霉生產(chǎn)的β-葡聚糖苷酶與里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶復(fù)合制備出高活性復(fù)合纖維素 酶，優(yōu)化酶系配比，大大提高木質(zhì)纖維素的酶解得率，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明還采用 稀磷酸與蒸汽爆破結(jié)合的方式來(lái)處理木質(zhì)纖維原料，經(jīng)過(guò)氨水中和脫毒后進(jìn)行酶解發(fā)酵。 稀磷酸結(jié)合汽爆可明顯降低爆破壓強(qiáng)和縮短保壓時(shí)間，同時(shí)減少后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷元素 的添加量。氨水中和脫毒相比于NaOH和Ca (OH) 2來(lái)說(shuō)比較溫和，這樣可以降低對(duì)設(shè)備的要 求和減少后續(xù)處理工藝，同時(shí)稀磷酸浸漬中的磷元素和氨水中的NH 4+生成磷酸氫銨對(duì)發(fā)酵 具有促進(jìn)作用?？傊?，通過(guò)對(duì)預(yù)浸漬工藝，爆破條件和中和脫毒工藝的探索，達(dá)到了減少能 耗，縮短生產(chǎn)周期，改善酶解效果，提高乙醇得率，降低成本的效果。
[0020] 本發(fā)明的黑曲霉C112Aspergillus niger C112,2012年4月23日保藏于《中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心》，地址為：中國(guó)·武漢·武漢大學(xué)，其保藏號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2012129。
[0021] 本發(fā)明所用里氏木霉RUT C30 (Trichoderma reesei RUT C30)，購(gòu)自美國(guó)模式菌種 收集中心（ATCC)，編號(hào)：ATCC 56765,其產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)方法，見(jiàn)參考文獻(xiàn)3。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明單一碳源對(duì)黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響；
[0023] 圖2為本發(fā)明單一氮源對(duì)黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響；
[0024] 圖3為本發(fā)明黑曲霉C112搖瓶產(chǎn)β -葡萄糖苷酶活隨時(shí)間的變化曲線；
[0025] 圖4為本發(fā)明β -葡萄糖苷酶/濾紙酶比值對(duì)還原糖的影響；
[0026] 圖5為本發(fā)明稀磷酸浸漬木質(zhì)纖維照片；
[0027] 圖6為本發(fā)明稀磷酸結(jié)合蒸汽爆破（爆破壓強(qiáng)：2Mpa)預(yù)處理木質(zhì)纖維照片；
[0028] 圖7為本發(fā)明稀磷酸結(jié)合蒸汽爆破（爆破壓強(qiáng)：3Mpa)預(yù)處理木質(zhì)纖維照片。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0030] 實(shí)施例1 :本發(fā)明提供了單因素和正交試驗(yàn)對(duì)黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶工藝 的優(yōu)化過(guò)程，具體如下。
[0031] 黑曲霉C112的種子培養(yǎng)：從實(shí)驗(yàn)室保存的黑曲霉C112 土豆固體平板培養(yǎng)基中挑 取兩環(huán)孢子，接種于裝有50ml 土豆培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，28 °C，200r/min條件下培養(yǎng)2? 2. 5天作為接種物。黑曲霉Cl 12種子培養(yǎng)基：馬鈴薯300g/L，葡萄糖20g/L，pH值6. 80。
[0032] 黑曲霉C112的產(chǎn)酶培養(yǎng)：將活化好的黑曲霉菌液，以6% (v/v)接種量接種于裝 有50ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，28°C，200r/min條件下培養(yǎng)5天。所有搖瓶實(shí)驗(yàn)均為 3個(gè)平行。4000r/min下離心lOmin，取上清液（粗酶液）測(cè)定其β-葡萄糖苷酶活力。
[0033] 用于篩選培養(yǎng)基的最優(yōu)單因素的黑曲霉C112產(chǎn)酶基本培養(yǎng)基：玉米芯30. 7g/ L，麩皮 l〇g/L，酵母粉 5g/L，（NH4) 2S047g/L，KH2P046g/L，CaCl 2 · 2H20 0· 9g/L，MgSO4 · 7H20 0. 9g/L，吐溫-801ml/L，Mandels微量元素濃縮液lml/L，lmol/L朽1檬酸緩沖液100ml/L。
[0034] 其中，Mandels 微量元素濃縮液：FeSO4 ·7Η20 5g/L，MnS04 ·Η20 I. 6g/L，ZnS04 ·7Η20 1. 4 g/L，CoCl2 · 6H20 3. 7g/L ;加水至 1000ml。
[0035] lmol/L 檸檬酸緩沖液：檸檬酸（C6H8O7 · H2O) 210g，H2O 750ml，加 NaOH 78g，冷卻后 測(cè)pH約為4. 2,加水至1000ml，pH約為4. 5。
[0036] 本發(fā)明所采用β_葡萄糖苷酶活力的p-NPG測(cè)定法，見(jiàn)參考文獻(xiàn)1。
[0037] 產(chǎn)酶培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)：保持產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中其他成分不變，分別改變碳源、復(fù) 合碳源、氮源、復(fù)合氮源這四個(gè)因素，篩選出黑曲霉C112產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最優(yōu)單因素。
[0038] 保持產(chǎn)酶培養(yǎng)基中其他成分不變，分別加入1.0%、1.5%、2. 0%的麩皮、玉米芯、 稻草粉、微晶纖維素、麥芽浸粉和乳糖作為碳源，比較不同濃度的單一碳源對(duì)黑曲霉C112 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響（圖1)。結(jié)果表明，玉米芯和稻草粉的產(chǎn)酶效果較好，其中在濃度 為2. 0%時(shí)，玉米芯和稻草粉的β -葡萄糖苷酶活力分別達(dá)到3. 577U/mL和3. 320U/mL。表 明玉米芯和稻草粉對(duì)黑曲霉的誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。
[0039] 選取單一碳源中效果較好的玉米芯與稻草粉，研究不同濃度的復(fù)合碳源對(duì)黑曲霉 Cl 12產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響（表1)。當(dāng)玉米芯為2%，稻草粉為3%時(shí)，β-葡萄糖苷酶 活力最高達(dá)到8. 768U/mL。
[0040] 表1復(fù)合碳源對(duì)黑曲霉Cl 12產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的影響
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 一種稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法，其特征在于，稀酸充分 浸漬木質(zhì)纖維原料后結(jié)合蒸汽爆破，然后將爆破物脫毒，最后采用高活性復(fù)合纖維素酶進(jìn) 行酶解發(fā)酵；酶解所用的高活性復(fù)合纖維素酶的制備方法如下：分別將保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2012129的黑曲霉C112生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶與保藏編號(hào)為ATCC 56765的里氏木 霉RUT C30生產(chǎn)的纖維素酶濃縮提純，并將濃縮后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/濾 紙酶活比值為1.048?2.685 ;黑曲霉C112通過(guò)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基得到高活力的 β -葡萄糖苷酶，培養(yǎng)基配方為：玉米芯25?30g/L，稻草粉20?30g/L，蛋白胨5?6g/ L，（NH4) 2S0410 ?13g/L，KH2P046 ?8g/L，CaCl2 · 2H20 0· 5 ?1. Og/L，MgS04 · 7H20 0· 5 ? 1. Og/L，吐溫-801?2ml/L，Mandels微量元素濃縮液0. 5?lml/L，lmol/L朽1檬酸緩沖液 100?150ml/L，加水配制成1L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法，其特 征在于，濃縮后的酶液混合使得β -葡萄糖苷酶活/濾紙酶活比值為1. 536 ;黑曲霉C112通 過(guò)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培養(yǎng)基配方為：玉米芯25g/ L，稻草粉 30g/L，蛋白胨 5g/L，（NH4)2S0410g/L，KH2P0 46g/L，CaCl2 ·2Η20 0· 9g/L，MgS04 ·7Η20 0. 9g/L，吐溫-801ml/L，Mandels微量元素濃縮液lml/L，lmol/L朽1檬酸緩沖液100ml/L，加 水配制成1L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法， 其特征在于，黑曲霉C112的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)過(guò)程如下：將黑曲霉菌C112的種子 培養(yǎng)液，以體積百分比5-8%的接種量接種于裝有40-60ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml搖瓶中， 26-28°C，180-220r/min條件下培養(yǎng)4-6天，離心，取上清液得到粗酶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法，其特 征在于， 黑曲霉C112的種子培養(yǎng)：從保存的黑曲霉C112 土豆固體平板培養(yǎng)基中挑取孢子，接 種于裝有40-60ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，26-28°C，180-220r/min條件下培養(yǎng)2?3 天作為接種物；黑曲霉C112種子培養(yǎng)基：馬鈴薯250?300g/L，葡萄糖15?25g/L，pH值 6. 5 ?7. 0〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法，其特 征在于， 黑曲霉C112生產(chǎn)的纖維素酶β -葡萄糖苷酶活為13. 368?15. 496U/mL，濾紙酶活為 0. 183?0. 215IU/mL，經(jīng)超濾濃縮儀濃縮后，β -葡萄糖苷酶活為18. 793?24. 741U/mL， 濾紙酶活為0. 785?0. 932IU/mL ;里氏木霉RUT C30生產(chǎn)的纖維素酶β -葡萄糖苷酶活為 1. 205?1. 652U/mL，濾紙酶活為5. 931?6. 212IU/mL ;經(jīng)超濾濃縮儀濃縮后，β -葡萄糖苷 酶活為 9. 379 ?12. 662U/mL，濾紙酶活為 43. 335 ?48. 912IU/mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方 法，其特征在于，Mandels微量元素濃縮液配方為：FeS0 4 · 7H20 5g/L，MnS04 · H20 1. 6g/L， ZnS04 · 7H20 1. 4g/L，CoCl2 · 6H20 3. 7g/L，加水配制成 1L ; lmol/L檸檬酸緩沖液的配方為：檸檬酸（C6H807，H20)210g，H 20 750ml，加 NaOH 78g，冷 卻后測(cè)pH為4· 2,加水至1000ml，pH 4· 5。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法， 其特征在于，所述的稀酸為質(zhì)量濃度范圍為0. 05% -5%的稀磷酸；木質(zhì)纖維原料與稀磷酸 固液質(zhì)量比為1:1-1:10的范圍浸漬，浸漬時(shí)間為固液混合均勻后l_24h ;蒸汽爆破壓強(qiáng)為 0· 5-3Mpa，保壓時(shí)間為：60-240s。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法，其特 征在于，蒸汽爆破后采用氨水中和脫毒，具體的工藝為：先加入檸檬酸緩沖液后，再用氨水 調(diào)節(jié) pH 至 4. 5-6. 0。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法，其 特征在于，收集含水率為82±3%的爆破物，按絕對(duì)干重的爆破物與容器總裝載量體積比為 0. 05:1-0. 2:1加入，再加入占容器裝載量體積百分比15-30 %的0. 05mol/L檸檬酸緩沖液， 總裝載量占容器體積的2/5-4/5,余量為水，然后加入氨水調(diào)節(jié)pH值至5. 5±0. 5,以濾紙酶 活FPU為15-30IU/g底物加入所述的高活性復(fù)合纖維素酶，50±5°C下酶解24-96h。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的稀磷酸結(jié)合汽爆預(yù)處理改進(jìn)木質(zhì)纖維酶解糖化的方法， 其特征在于，收集含水率82±3%的爆破物，按絕對(duì)干重的爆破物與容器總裝載量體積比 為0. 05:1-0. 2:1加入2. 5-1000L發(fā)酵罐中，再加入占發(fā)酵罐裝載量體積百分比15-30% 的0. 05mol/L的檸檬酸緩沖液，總裝載量占容器體積的2/5-4/5,余量為水，再用l-2mol/ L 氨水中和脫毒調(diào)節(jié) pH 值至 5· 5±0· 5,加入 ΚΗ2Ρ040· 25-lg/L，CaCl2 · H20 0· 0· 2-0. 8g/L， MgS04 ·7Η20 0. 2-0. 8g/L，以濾紙酶活FPU為15-30IU/g底物加入所述的高活性復(fù)合纖維素 酶，50±5°C下酶解4-12h后，降溫至37±3°C，加入發(fā)酵菌種混合酶解發(fā)酵24-96h。
【文檔編號(hào)】C12R1/885GK104293861SQ201410457462
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】陳介南, 張 林, 劉娜, 王揮, 詹鵬, 喻傳明 申請(qǐng)人:中南林業(yè)科技大學(xué), 常德聯(lián)合生物能源研究所