一種禽肺病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種禽肺病毒，為SHS/B株，已于2014年3月24日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.9001。本發(fā)明的禽肺病毒用于制備疫苗。本發(fā)明篩選的禽肺病毒具有安全性好，且免疫原性高的特點(diǎn)，用禽肺病毒SHS/B株接種Vero細(xì)胞，收獲細(xì)胞毒液，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。能提高SPF雞的抗體，預(yù)防禽肺病毒引起的腫頭、產(chǎn)蛋率下降等癥狀，此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種禽肺病毒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家禽病源微生物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種禽肺病毒及其在制備疫 苗中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽肺病毒APV(Avian Pneumovirus)屬于副黏病毒科肺病毒屬，其基因組含有8個(gè) 基因，分別為N、P、M、F、M2、SH、G、L。根據(jù)其G蛋白差異和血清學(xué)分析，APV分為A、B、C、D 四個(gè)亞型。其中A型和B型分布最廣，呈世界范圍流行，以色列、巴西、莫斯科、日本、黑龍江 以及大多數(shù)的歐洲國(guó)家等地區(qū)均有報(bào)道。該病毒主要引起雞的腫頭綜合癥，以流鼻涕、打噴 嚏、眶下竇腫脹、頭部腫脹和產(chǎn)蛋率下降等癥狀為主要特征，傳染率、發(fā)病率可高達(dá)100%， 死亡率隨飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生條件而變化，若有混合感染，死亡率可高達(dá)25 %?40 %。該病傳 染性強(qiáng)，傳播迅速，近年來(lái)該病呈現(xiàn)流行并蔓延趨勢(shì)，能引起多種禽類感染發(fā)病并造成嚴(yán)重 的經(jīng)濟(jì)損失，特別是種雞的危害越來(lái)越嚴(yán)重。因此，就需要在國(guó)內(nèi)分離并培育出一株毒力穩(wěn) 定、安全性、免疫原性好的禽肺病毒來(lái)制備疫苗，以預(yù)防該病毒對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的侵襲。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種禽肺病毒及其在制備疫苗中的應(yīng)用；用該病毒制備的疫 苗具有高效、安全性好、保護(hù)率高的優(yōu)點(diǎn)，從而為雞腫頭綜合征防控措施的制定提供可靠的 依據(jù)。
[0004] 本發(fā)明首先提供一種禽肺病毒已于2014年3月24日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9001。
[0005] 上述的禽肺病毒為SHS/B株。
[0006] 本發(fā)明的禽肺病毒用于制備疫苗，制備的疫苗為滅活疫苗。
[0007] 本發(fā)明篩選的禽肺病毒具有安全性好，且免疫原性高的特點(diǎn)，用禽肺病毒SHS/B 株接種Vero細(xì)胞，收獲細(xì)胞毒液，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。能提高 SPF雞的抗體，預(yù)防禽肺病毒引起的腫頭、產(chǎn)蛋率下降等癥狀，此疫苗具有高效、安全性好的 優(yōu)點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0008] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0009] 一、禽肺病毒的分離
[0010] 2010年在山東省多個(gè)種雞場(chǎng)出現(xiàn)了腫頭綜合癥的癥狀，而發(fā)病雞群之前已經(jīng)注射 了已有的禽肺病毒疫苗，推測(cè)感染的病毒發(fā)生了變異；因此從發(fā)病個(gè)體中進(jìn)行禽肺病毒的 篩選。
[0011] 取發(fā)病雞的鼻甲骨、粘液，加入生理鹽水，3000r/min離心lOmin，取上清液，用 220nm的濾器過(guò)濾。將病料上清接種已培養(yǎng)纖毛擺動(dòng)活潑的TOC上，然后吸取上清加到另一 已培養(yǎng)24h的T0C上，以此傳代。當(dāng)出現(xiàn)纖毛停滯時(shí)，對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行RT-PCR鑒定。對(duì)陽(yáng) 性的T0C上清接種到Vero細(xì)胞上，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h觀察細(xì)胞病變，直到 96h，凍融一次，取上清用Vero細(xì)胞傳代。將出現(xiàn)細(xì)胞病變的上清液進(jìn)行空斑純化，純化后 的病毒傳代后測(cè)定病毒含量。
[0012] 二、篩選的禽肺病毒的培育及鑒定
[0013] 1.培育確定篩選的禽肺病毒為病毒SHS/B株，經(jīng)PCR檢測(cè)并測(cè)序?yàn)锽亞型，經(jīng) 氣管環(huán)培養(yǎng)2代后，出現(xiàn)明顯的氣管纖毛擺動(dòng)停止，經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)馴化，病毒含量達(dá) 10 5_°TCID5(l/0. lml以上。收獲的病毒液經(jīng)純化后進(jìn)行了病毒含量、免疫原性、特異性及純凈 性等方面的病毒特性的分析檢測(cè)，結(jié)果表明該毒株病毒含量為l〇 5 5TCID5(l/0. lml以上，最小 免疫劑量為〇. lml，該病毒僅與禽肺病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，無(wú)細(xì)菌、支原體及外源病毒污染， 適合作為制苗用毒株，已于2014年3月24日保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 9001〇
[0014] 2.鑒定
[0015] 2. 1引物設(shè)計(jì)參照已發(fā)表的B型APV F基因片段中核苷酸保守序列，采用Primer 5. 0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)以下1對(duì)引物：
[0016] F1:5; -ATTAGGCAATGGCGTTCGCA-3;；
[0017] F〗。' -CTCCACCTCTGATGCAACAT-3，。
[0018] 2.2鑒定結(jié)果對(duì)于本發(fā)明篩選的毒株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，測(cè)序后進(jìn)行blast分析， 發(fā)現(xiàn)保藏編號(hào)為CGMCC No. 9001的禽肺病毒的APV F基因與已報(bào)道的禽肺病毒的相對(duì)應(yīng)的 序列存在至少3-5個(gè)氨基酸的差異，推測(cè)上述的差異正是導(dǎo)致已有的禽肺病毒疫苗免疫效 果不佳的原因所在。
[0019] 該毒株作100倍稀釋后，與等量禽肺病毒病抗血清中和，病毒均能被高免血清特 異性中和；而與等量雞新城疫病毒、禽流感病毒抗血清中和組，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變， 可見該病毒特異性好。該病毒經(jīng)翅靜脈途徑攻擊后，病毒分離率為9/10以上，病毒分離物 測(cè)序結(jié)果表明為禽肺病毒。該毒株制備的疫苗免疫SPF雞后,能保護(hù)雞免疫4個(gè)月內(nèi)免受 禽肺病毒的攻擊。
[0020] 2.3毒種保存由表內(nèi)結(jié)果可見，本發(fā)明分離毒濕毒在_70°C保存36個(gè)月病毒含 量仍較穩(wěn)定。（參見表1)
[0021] 表1 :保存不同時(shí)間病毒含量測(cè)定
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種禽肺病毒，其特征在于，所述的禽肺病毒于2014年3月24日保藏于北京市朝陽(yáng) 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9001。
2. 如權(quán)利要求1所述的禽肺病毒，其特征在于，所述禽肺病毒為SHS/B株。
3. 權(quán)利要求1所述的禽肺病毒在制備疫苗中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疫苗為滅活疫苗。
5. 權(quán)利要求1所述的禽肺病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)方法是將禽肺病 毒接種Vero細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK104195114SQ201410458174
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】杜元釗, 范根成, 宮曉, 楚電峰, 郭偉偉, 徐保娟, 朱艷梅, 鄒敏 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司