調(diào)控玉米籽粒長度主效qtl的分子標記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及作物分子育種領(lǐng)域，具體公開了一種調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記及其應(yīng)用。調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記，由InDell4和umcl269兩對引物組成。一種輔助選擇長籽粒玉米的方法，包括：提取待測玉米的基因組DNA，用上述引物InDell4和umcl269進行PCR擴增，如果得到長度為236bp和350bp的擴增產(chǎn)物，則待測玉米為候選長籽粒玉米，將所述的候選長籽粒玉米應(yīng)用于育種。通過本發(fā)明的分子標記進行輔助選擇長籽粒玉米，只需檢測分子標記的特征擴增條帶，即可預(yù)測籽粒的長短，其鑒定方法簡單，選擇效率高。
【專利說明】調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及作物分子育種領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子 標記及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是世界上重要的糧飼作物，在我國已經(jīng)成為第二大農(nóng)作物。隨著人口的急劇 增加和耕地面積的不斷減少，玉米等糧食作物需要大幅提高產(chǎn)量來滿足人類的需求。玉米 單產(chǎn)的提高則是解決耕地減少帶來的糧食總量降低問題的主要技術(shù)手段。在玉米育種中， 單產(chǎn)的提高除了依賴種植密度的增加外，籽粒重量也是影響產(chǎn)量的重要因素。
[0003] 產(chǎn)量性狀是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。籽粒性狀作為影響產(chǎn)量的直接性狀， 其大小可以分解為長、寬、厚。在玉米穗長及穗軸粗等穗部性狀沒有變化的情況下，玉米籽 粒越長，則玉米籽粒越大，單株籽粒產(chǎn)量越高。相關(guān)研究也證實相比于其它穗部性狀，玉米 籽粒長度與單株產(chǎn)量的相關(guān)性最高。目前，國內(nèi)的玉米主推高產(chǎn)品種先玉335,鄭單958等 均具有長籽粒的特性。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，尤其是分子標記的廣泛應(yīng)用，可以對數(shù) 量性狀相關(guān)基因位點進行分析。有關(guān)玉米籽粒相關(guān)性狀的QTL定位研究也引起了關(guān)注。由 于受定位群體類型（多為F2:3家系）、所用遺傳連鎖圖譜精度（多為?200SSR標記）以及 籽粒長度（深度）的評價方法等方面的限制，對籽粒長度的QTL分析并無一致結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記及其應(yīng)用。
[0005] 針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種調(diào)控玉米籽粒長度主效 QTL的分子標記，由InDelH和umcl269兩對引物組成，所述引物InDelH的序列為：
[0006] Forward: 5 ' -AACATGCACGCTACTTGTGC-3 '
[0007] Reverse:5 ' -TTGTACGCATCTGTTTGTGCT-3 '
[0008] 所述引物umcl269的序列為：
[0009] Forward: 5 ' -TATATTAGAGGCACCTCCCTCCGT-3 '
[0010] Reverse: 5，-AGCTGCTTCAGCGACTTTGG-3 '
[0011] 一種輔助選擇長籽粒玉米的方法，包括如下步驟：提取待測玉米的基因組DNA，用 權(quán)力要求1所述引物InDelH和umcl269進行PCR擴增，如果得到長度為236bp和350bp 的擴增產(chǎn)物，則待測玉米為候選長籽粒玉米。
[0012] 調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記在玉米育種中的應(yīng)用，其特征在于：用權(quán) 力要求2所述的方法鑒定出候選長籽粒玉米，將所述的候選長籽粒玉米應(yīng)用于育種。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：
[0014] 本發(fā)明通過QTL分析，發(fā)現(xiàn)在玉米第一染色體I. Olbin上存在一個與玉米籽粒長 度相關(guān)的QTL，該QTL位于分子標記InDelH和umcl269之間，對表型的貢獻率為21. 6%。 分析表明利用這兩個分子標記可以對玉米籽粒長度進行預(yù)測。
[0015] 通過本發(fā)明公布的分子標記進行分子標記輔助選擇，只需檢測分子標記的特征擴 增條帶，即可預(yù)測籽粒的長短，鑒定方法簡單，選擇效率高。在玉米生育早期鑒定出長籽粒 的玉米單株，淘汰其它單株，選擇目標明確，且不受環(huán)境的影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL在第一染色體上的位置示意圖。

【具體實施方式】
[0017] 下述實施例中實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)實驗方法。下述實施例中所述的 實驗試劑及耗材如無特殊說明，均來自常規(guī)生化試劑公司。
[0018] 本實施例中，獲得調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL分子標記的詳細步驟如下：
[0019] (1)玉米三重測交（tripletestcross，TTC)群體的構(gòu)建及籽粒長度的測量 [0020] 利用82份不同基因型的高遺傳交換率IBM重組自交系群體分別與其親本B73、 皿〇17及？1雜交，獲得1'(：出73)、1'(^〇17)及1'(：的）三重測交群體。將82份不同基因型18皿 群體、1'(：?73)、1'(：(1〇17)及1'(：$1)三重測交群體按照隨機分組的方式種植于試驗基地。每 個基因型材料按照單行種植，株距30cm，行距60cm，正常田間管理。出苗后，采集IBM群體 的葉片組織提取DNA。
[0021] 待籽粒生理成熟后，收獲IBM重組自交系及TTC群體的成熟穗。每行隨機收獲三 株，單穗中間部分脫粒，將三個單穗脫下來的籽粒混合隨機選取30個籽粒，利用可以進行 高精度測量的SmartGrain軟件分析玉米籽粒長度，取平均值作為該基因型籽粒長度。
[0022] 利用SmartGrain軟件進行籽粒長度測量的過程如下：首先，將30個玉米籽粒與一 個長度標尺放在黑色的背景下，利用佳能單反數(shù)碼相機進行拍照；其次，利用SmartGrain 軟件打開電子照片，選擇通過顏色對比自動識別玉米籽粒的輪廓，并對玉米籽粒的長度進 行界定；再次，對籽粒長度識別不準確的圖像進行手動調(diào)整；最后，調(diào)整完成后對長度標尺 的實際長度進行設(shè)定，自動計算出玉米籽粒長度。
[0023] 根據(jù)TTC群體的遺傳交配設(shè)計，將82個TC(B73)、TC(M〇17)、TC(F1)的籽粒長度數(shù) 據(jù)分別表示為L n、L2i和L3i(i = 1，...，82)，對于每一個IBM個體計算和式Z1= (Ln+L2i)/2(i =1，"·，82)，用于檢測加性QTL。
[0024] (2) InDel (Insertion/Deletion)標記的開發(fā)和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建
[0025] 利用B73全基因組序列（第三版）和M〇17二代序列，M〇17二代原始序列經(jīng)過Q20 標準過濾后用BWA軟件處理并利用SAMtool對結(jié)果進行整理。在分析過程中刪除可在B73 基因組上對應(yīng)多個位點的M 〇17二代原始序列。利用eprimer3設(shè)計引物，將這些引物在玉 米自交系873、1〇17基因組之間進行？0?擴增，通過2%的瓊脂糖凝膠篩選出在873、11 〇17 基因組間擴增條帶清晰、無非特異性擴增的共顯性InDel標記。
[0026] 提取IBM群體的DNA，利用篩選的多態(tài)性InDel標記進行PCR擴增，通過2%的瓊 脂糖凝膠電泳獲得IBM群體的InDel標記基因型。結(jié)合IBM群體的公共標記基因型，利用 MSTMap軟件對這些分子標記進行分群、排序并計算遺傳距離（Kosambi)。經(jīng)過分析，構(gòu)建的 遺傳圖譜共有744個分子標記，覆蓋了玉米的10個染色體，總遺傳距離達到了 4263. lcM，分 子標記間平均遺傳距離為5. 7cM。
[0027] (3) QTL 分析
[0028] 利用 WinQTLcart2. 5 對 Z1 進行復(fù)合區(qū)間作圖（Composite IntervalMapping, CIM) 分析籽粒長度QTL的遺傳位置及遺傳效應(yīng)。以0. 5cM的步移掃描全基因組，QTL的顯著水平 設(shè)定為〇. 05,抽樣1000次迭代值模擬確定QTL的置信區(qū)間（LOD)。當LOD值大于3. 0時， 認為該區(qū)間存在一個QTL。復(fù)合區(qū)間作圖分析表明，如圖1所示，在玉米第一染色體I. Olbin 上存在一個調(diào)控玉米籽粒長度的主效QTL，介于分子標記InDelH和umcl269之間。該QTL 對表型的貢獻率為21. 6%，命名為qKLl，該QTL增加粒長的等位基因來自親本M〇17,可用 于對玉米籽粒長度的預(yù)測。
[0029] 上述調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記，由InDelH和umcl269兩對引物組 成，其中引物InDelH的序列為：
[0030] Forward: 5 ' -AACATGCACGCTACTTGTGC-3 '
[0031] Reverse:5 ' -TTGTACGCATCTGTTTGTGCT-3 '
[0032] 所述引物umcl269的序列為：
[0033] Forward: 5 ' -TATATTAGAGGCACCTCCCTCCGT-3 '
[0034] Reverse:5，-AGCTGCTTCAGCGACTTTGG-3 '
[0035] 利用上述調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記輔助選擇長籽粒玉米的方法包 括：提取待測玉米的基因組DNA，用引物InDelH和umcl269進行PCR擴增，如果得到長度 為236bp和350bp的擴增產(chǎn)物，則待測玉米為候選長籽粒玉米。上述鑒定出的候選長籽粒 玉米應(yīng)用于育種，在玉米生育早期鑒定出長籽粒的玉米單株，淘汰其它單株，在玉米種植過 程中，可以在有限的耕地資源上顯著提高玉米的產(chǎn)量。
【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記，其特征在于：由InDel 14和umcl269兩 對引物組成，所述引物InDelH的序列為： Forward:5 ' -AACATGCACGCTACTTGTGC-3 ' Reverse:5 ' -TTGTACGCATCTGTTTGTGCT-3 ' 所述引物umcl269的序列為： Forward:5 ' -TATATTAGAGGCACCTCCCTCCGT-3 ' Reverse:5 ' -AGCTGCTTCAGCGACTTTGG-3 '
2. -種輔助選擇長籽粒玉米的方法，包括如下步驟：提取待測玉米的基因組DNA，用權(quán) 力要求1所述引物InDelH和umcl269進行PCR擴增，如果得到長度為236bp和350bp的 擴增產(chǎn)物，則待測玉米為候選長籽粒玉米。
3. 如權(quán)利要求1所述調(diào)控玉米籽粒長度主效QTL的分子標記在玉米育種中的應(yīng)用，其 特征在于：用權(quán)力要求2所述的方法鑒定出候選長籽粒玉米，將所述的候選長籽粒玉米應(yīng) 用于育種。
【文檔編號】C12N15/113GK104212801SQ201410462801
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】張體付, 趙涵 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院