檢測(cè)腫瘤的試劑盒及其專用識(shí)別n-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)腫瘤的試劑盒。其包含檢測(cè)腫瘤的物質(zhì)，該檢測(cè)腫瘤的物質(zhì)是可與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)。本發(fā)明的檢測(cè)腫瘤的物質(zhì)對(duì)很多腫瘤的檢出率都在90％以上，腫瘤特異性在95％以上。這必將大大提高腫瘤的早期診斷率。本發(fā)明適于在正常人群中做腫瘤早期普查。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)腫瘤的試劑盒及其專用識(shí)別N-乙酰氨基葡萄糖的物 質(zhì)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)腫瘤的試劑盒及其專用識(shí)別N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)。

【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)80年代，專家利用雜交瘤技術(shù)獲得了能識(shí)別腫瘤特異性大分子糖蛋白 抗原（carbohydrate antigen, CA)，并研制了單克隆抗體識(shí)別系統(tǒng)。發(fā)展至今在目前腫瘤 體外早期診斷試劑領(lǐng)域，存在競(jìng)爭(zhēng)性分析和非競(jìng)爭(zhēng)性?shī)A心分析兩種分析方法。從實(shí)驗(yàn)室檢 測(cè)的角度，腫瘤標(biāo)志物分為血清/血漿腫瘤標(biāo)志物與組織細(xì)胞腫瘤標(biāo)志。血清/血漿腫瘤 標(biāo)志物大致分為三類：1)胚胎抗原。胚胎期表達(dá)、正常成人不表達(dá)、伴隨腫瘤發(fā)生又重新 表達(dá)的抗原，如AFP、CEA。2)腫瘤相關(guān)糖脂及糖蛋白。CA199、CA50、CA242、CA724、CA125、 CA153等。3)激素肽、酶、蛋白。這些在正常組織中有表達(dá)，但是在腫瘤組織中只是過(guò)量表 達(dá)的抗原。PSA、NSE、TPA等。對(duì)這些腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)也發(fā)展出很多微量免疫檢測(cè)技術(shù)， I：匕如：1959 年 Berson 與 Yalow創(chuàng)立了放射免疫測(cè)定（radioimmunoassay, RIA), 1971 年瑞典 的 Engvall 建立了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以及 近期的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（chemluminescence immunoassay, CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 (electrochemiluminesence immunoassay, ECLI)、時(shí)間分辨突光免疫測(cè)定（time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)。目前對(duì)于任何一個(gè)腫瘤標(biāo)志物不管采用那種測(cè)定技術(shù)，鑒定 腫瘤和非腫瘤患者不是100%準(zhǔn)確的。比如AFP對(duì)原發(fā)性肝癌的特異性為70% ;CEA對(duì)結(jié) 腸癌特異性為60%、胰腺癌為80%、胃癌為60%、肺癌為75%和乳腺癌為60% ;CA125對(duì) 卵巢癌為82% ;CA153對(duì)乳腺癌早期為75% ;CA724對(duì)胃癌為42%，NSE對(duì)小細(xì)胞肺癌為 70%。以上的標(biāo)志物并不是廣譜的，大都只能診斷一種或幾種腫瘤，并且以CEA為例，其對(duì) 胰腺癌診斷效果最好，為80%，雖然對(duì)結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌也有效，但最低的特異性 僅有60%，換句話說(shuō)，40%是會(huì)漏診的。腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)與診斷，對(duì)于提高患者治愈率、延長(zhǎng) 患者生命是至關(guān)重要的，致力于腫瘤研究的學(xué)者在探索和尋找有效的腫瘤標(biāo)志從未松懈。
[0003] 腫瘤早期診斷至今仍然是世界性難題，現(xiàn)用的腫瘤標(biāo)志物只能檢出約70%的腫 瘤，且絕大多數(shù)已屬晚期?，F(xiàn)行腫瘤標(biāo)志物大都確切結(jié)構(gòu)尚不明確，難于復(fù)制。
[0004] 現(xiàn)行商品試劑盒的模式分為兩類，夾心模式和競(jìng)爭(zhēng)模式，且在腫瘤標(biāo)志物領(lǐng)域只 有雙結(jié)合體的夾心模式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)腫瘤的試劑盒，該試劑盒包含可以與 N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)。本發(fā)明利用N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì) 制備簡(jiǎn)單，檢測(cè)特異性和靈敏性高，適于腫瘤發(fā)病初期的檢測(cè)。
[0006] 所述檢測(cè)腫瘤的試劑盒為以血清為檢測(cè)樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
[0007] 所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、 宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌的一種或幾種。
[0008] 上述能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)為以N-乙酰氨基葡萄糖為抗原決 定簇的單克隆抗體、多克隆抗體、與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的適配體或與N-乙酰氨 基葡萄糖特異性結(jié)合的凝集素。
[0009] 所述與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的適配體為序列表中序列1所示的核酸。 [0010] 本發(fā)明還保護(hù)與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的適配體，為序列表中序列1所示 的核酸。
[0011] N-乙酰氨基葡萄糖分子式：C8H15N06，分子量：221. 21，化學(xué)代號(hào)-GlcNAc，其結(jié)構(gòu)如 圖1A所示它可以與載體蛋白偶聯(lián)得到抗原，制備可以檢測(cè)腫瘤的特異性結(jié)合體，如抗體、 核酸適配體、凝集素等，這些特異性結(jié)合體可以與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合。
[0012] 上述載體蛋白可以為常用的載體蛋白，如卵白蛋白（0VA)、牛血清白蛋白（BSA)與 多管式載體血藍(lán)蛋白（KLH)，也可以為糖蛋白，如粘蛋白及其他的蛋白中的一種或幾種。
[0013] 例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中， 申請(qǐng)人:在血清中分離出了 N-乙酰氨基葡萄 糖鏈接粘蛋白1 (Mucinl，代號(hào)Mu)形成的本專利所提純的腫瘤抗原Mu-GlcNAc (代 號(hào)MA153)，它鏈接的位置在粘蛋白1內(nèi)糖鏈的暴露端，見圖1B，粘蛋白1 (Mu)結(jié)構(gòu) 的氨基酸序列為（-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-) X N，即粘蛋白1 (Mu_)的氨基酸序列 為：-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-的多次重復(fù)排列。
[0014] 本發(fā)明利用N-乙酰氨基葡萄糖的特異結(jié)合體包括提純的新的高靈敏血清腫瘤標(biāo) 志物抗原即 2-deoxy-N-acetyl-D-glucosamine-mucinl (簡(jiǎn)稱 Mu-GlcNAc,也稱為 MA153) 和N-乙酰氨基葡萄糖的特異結(jié)合體：適配體（核酸，如MA153-A)和其它結(jié)合體如單克隆抗 體，多克隆抗體，植物凝集素（PHA)和/或受體，相關(guān)配體，以及檢測(cè)早期腫瘤的方法。直接 檢測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖的方法包括兩個(gè)模式：l)Ma695 - Mu-GlcNAc -MA153-A夾心式，2) 單結(jié)合體式，由N-乙酰氨基葡萄糖的特異結(jié)合體直接識(shí)別GlcNAc。用此方法可以檢測(cè)出 97 %的肺癌，腫瘤特異度96 %。
[0015] 本發(fā)明提供上述檢測(cè)腫瘤的方法，是檢測(cè)待測(cè)患者血清中的N-乙酰氨基葡萄糖 的濃度，以lU/mL為正常界值的上限值，其中，U為N-乙酰氨基葡萄糖活性單位。
[0016] 臨床血清學(xué)檢測(cè)表明，本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)很多腫瘤的檢出率都在90%以上，腫 瘤特異性在95%以上。這必將大大提高腫瘤的早期診斷率。本發(fā)明適于在正常人群中做腫 瘤早期普查。
[0017] 本發(fā)明開辟了一種新模式，命名為單結(jié)合體模式（Single binder assay)，由N-乙 酰氨基葡萄糖的特異結(jié)合體直接識(shí)別N-乙酰氨基葡萄糖。它節(jié)省抗體，可降低成本80%， 提高靈敏度而不降低特異度。在本發(fā)明中，單結(jié)合體模式比夾心模式將肺癌的檢出率提高 了 22% :前者靈敏度97%，特異度96% ;后者靈敏度75%，特異度95%。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1A表示N-乙酰氨基葡萄糖的結(jié)構(gòu)圖；
[0019] 圖1B表示N-乙酰氨基葡萄糖與粘蛋白1的關(guān)系；N-乙酰氨基葡萄糖與適配體 MA153-A的關(guān)系；粘蛋白1與單抗Ma695的關(guān)系；Mu-GlcNAc模擬結(jié)構(gòu)；
[0020] 圖2表示Mu-GlcNAc夾心測(cè)定分析的原理；
[0021] 圖3表示Mu-GlcNAc夾心式測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022] 圖4A表示N-乙酰氨基葡萄糖單結(jié)合體測(cè)定原理
[0023] 圖4B與圖4A相似，不同的是待測(cè)血清中與N-乙酰氨基葡萄糖鏈接的蛋白部分中 沒有-PDTR-肽段。表明在MA153中可能存在mucinl以外其它攜帶-GlcNAc的糖蛋白。
[0024] 圖5為N-乙酰氨基葡萄糖單結(jié)合體測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0026] 基于本發(fā)明，提供本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)腫瘤的試劑盒，該試劑盒包含可以與 N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)。本發(fā)明利用N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì) 制備簡(jiǎn)單，檢測(cè)特異性和靈敏性高，適于腫瘤發(fā)病初期的檢測(cè)。
[0027] 所述檢測(cè)腫瘤的試劑盒為以血清為檢測(cè)樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
[0028] 所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、 宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌的一種或幾種。
[0029] 上述能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)為以N-乙酰氨基葡萄糖為抗原決 定簇的單克隆抗體、多克隆抗體、與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的適配體或與N-乙酰氨 基葡萄糖特異性結(jié)合的凝集素。
[0030] 所述與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的適配體為序列表中序列1所示的核酸。
[0031] 本發(fā)明還保護(hù)與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的適配體，為序列表中序列1所示 的核酸。
[0032] N-乙酰氨基葡萄糖分子式：C8H15N06，分子量：221. 21，化學(xué)代號(hào)-GlcNAc，其結(jié)構(gòu)如 圖1A所示它可以與載體蛋白偶聯(lián)得到抗原，制備可以檢測(cè)腫瘤的特異性結(jié)合體，如抗體、 核酸適配體、凝集素等，這些特異性結(jié)合體可以與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合。
[0033] N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc)腫瘤抗原的特性：
[0034] N-乙酰氨基葡萄糖分子式：C8H15N06，分子量：221. 21，化學(xué)代號(hào)-GlcNAc，其結(jié)構(gòu)如 圖1A所示，它可以用于篩選、制備可以檢測(cè)腫瘤的特異性結(jié)合體，如抗體、核酸適配體、凝 集素等，這些特異性結(jié)合體可以與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合。N-乙酰氨基葡萄糖可以 作為半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到抗原，用于制備檢測(cè)其的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0035] 上述載體蛋白可以為常用的載體蛋白，如卵白蛋白（0VA)、牛血清白蛋白（BSA)與 多管式載體血藍(lán)蛋白（KLH)，也可以為糖蛋白，如粘蛋白及其他的蛋白中的一種或幾種。
[0036] 例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中， 申請(qǐng)人:在血清中分離出了 N-乙酰氨基葡萄 糖鏈接粘蛋白1 (Mucinl，代號(hào)Mu)形成的本專利所提純的腫瘤抗原Mu-GlcNAc (代 號(hào)MA153)，它鏈接的位置在粘蛋白1內(nèi)糖鏈的暴露端，見圖1B，粘蛋白1 (Mu)結(jié)構(gòu) 的氨基酸序列為（-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-) X N，即粘蛋白1 (Mu_)的氨基酸序列 為：-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-(序列2)的多次重復(fù)排列。本發(fā)明N-乙酰氨基葡萄糖鏈接 粘蛋白1得到的腫瘤抗原，可以從腫瘤細(xì)胞或者腫瘤患者血清中分離純化得到，其主要特 點(diǎn)如下：
[0037] A、Mu-GlcNAc的模擬結(jié)構(gòu)及與相關(guān)結(jié)合體的關(guān)系：Mu_GlcNAc通過(guò)決定 簇-PDTR-掛到單抗Ma695親和層析柱上，從而得到純化的腫瘤抗原Mu-GlcNAc (見圖1B);
[0038] B、Mu-GlcNAc 分子量約 140kd ;
[0039] C、由腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生；
[0040] D、在粘蛋白1上有-PDTR-肽段抗原決定簇；此決定簇可被Ma695單抗識(shí)別（見圖 1B)；
[0041] E、作為GlcNAc抗原可被N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體所識(shí)別；
[0042] F、存在于乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮 頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌、賁門癌患者的血清中；
[0043] G、不存在于正常人的血清中；
[0044] H、不存在于良性疾病患者血清中；
[0045] I、用0. 05M pH9. 2磷酸緩沖液可以將此抗原包被于聚苯乙烯材料表面成為固相化 抗原；
[0046] J、此抗原可與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體反應(yīng)，而形成血清腫瘤標(biāo)志物測(cè) 定；
[0047] K、Mu_GlcNAc抗原可與Ma695單抗，以及N-乙酰氨基葡萄糖的特異性結(jié)合體形成 夾心模式測(cè)定；
[0048] N、此抗原可與N-乙酰氨基葡萄糖的特異性結(jié)合體反應(yīng)，形成單結(jié)合體測(cè)定 (Single binder assay)；
[0049] N-乙酰氨基葡萄糖還可以鏈接其他糖蛋白形成腫瘤抗原，即-GlcNAc也可以和其 它糖蛋白鏈接形成Glycoprotein-N-acetyl-glucosamine (糖蛋白-N-乙酰-氨基葡萄糖） 結(jié)構(gòu)，可又名Gp-GlcNAc ;其特征是：
[0050] A、通過(guò)單結(jié)合體測(cè)定的靈敏度高于夾心模式測(cè)定的事實(shí)說(shuō)明在腫瘤抗原中與 N-乙酰氨基葡萄糖鏈接的可能還含有Mucinl以外的少部分糖蛋白；
[0051] B、A所述的此糖蛋白帶有-GlcNAc，而不帶有-PDTR-肽段；
[0052] C、此糖蛋白可與結(jié)合體A、B、C、D中的任何一個(gè)反應(yīng)，而不與Ma695單抗反應(yīng)；
[0053] 通過(guò)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，N-乙酰氨基葡萄糖（-GlcNAc)的特異性結(jié)合體對(duì) 比-PDTR-的特異性結(jié)合體而言，前者的腫瘤識(shí)別率更高；因此，N-乙酰氨基葡萄糖 (-GlcNAc)可以被稱為一個(gè)新的血清腫瘤標(biāo)志物，用于篩選檢測(cè)腫瘤的物質(zhì)（適配體、抗 體、凝集素）。
[0054] 本發(fā)明提供檢測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)在制備檢測(cè)腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。
[0055] 其中，所述檢測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)是能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合 的物質(zhì)（N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體）。
[0056] 所述檢測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)是能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的單克 隆抗體、多克隆抗體、適配體或凝集素。
[0057] 所述能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體是以N-乙酰 氨基葡萄糖為抗原的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0058] 所述檢測(cè)腫瘤的試劑盒為以血清為檢測(cè)樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
[0059] 所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、 宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌的一種或幾種。
[0060] 上述檢測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)分列如下：
[0061] A適配體，MA153-A，核苷酸序列為Pl(18)-N60-P2(18)通式，本實(shí)驗(yàn)所用MA153-A 屬克隆 A1 其序列：5 '-biotin-CGTAC GGTCG ACGCT AGC_3'_gggtt cagtg gtcga cgact ttgtt tgtgt cctca catgc attac taacg gtcat ccctg_5'_GGATC CGAGC TCCAC GTG_3'，Kd 20nM，起始靶的（"抗原"）：N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc)，所用技術(shù)：SELEX。
[0062] B 單克隆抗體，MA153-B :Mab Elll，IgGl，Ka 1010L/M，抗原決定簇 GlcNAc，鼠抗， 雜交瘤技術(shù)。
[0063] C 多克隆抗體，MA153-C ;Pab anti-GlcNAc，Ka 1010L/M，所對(duì)應(yīng)的半抗原GlcNAc， 兔抗，皮下多點(diǎn)注射免疫技術(shù)。
[0064] D新植物凝集素/或受體，MA153-D :生物素-植物凝集素 Triticum Vulgaris, ATV, Sigma USA, Catalogue No 9604〇
[0065] N-乙酰氨基葡萄糖檢測(cè)方法有下列特點(diǎn)：
[0066] N-乙酰氨基葡萄糖測(cè)定有兩種模式，夾心模式和單結(jié)合體模式；
[0067] A、在夾心模式中，Ma695是撲捉體，MA153是中心抗原，N-乙酰氨基葡萄糖特異 性結(jié)合（上述檢測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)中A.B.C.D之一，下同）是報(bào)告體；任何 "GlcNAc-結(jié)合體"聯(lián)接式分析，用以檢測(cè)腫瘤；如Ma695-Mu-GlcNAc -適配體夾心式分析， 做腫瘤檢測(cè)。
[0068] B、單結(jié)合體式分析又名為"單結(jié)合體非競(jìng)爭(zhēng)性分析"或"直接識(shí)別式分析"以區(qū) 別于現(xiàn)行的競(jìng)爭(zhēng)性分析；單結(jié)合體式分析是只用N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體做識(shí)別 體；單結(jié)合體分析是用N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體直接識(shí)別檢測(cè)對(duì)象中的的N-乙酰 氨基葡萄糖；.單結(jié)合體分析的本質(zhì)是結(jié)合體與-GlcNAc形成的特異性結(jié)合。如-GlcNAc-MA153-A聯(lián)接做成單結(jié)合體測(cè)定，做腫瘤檢測(cè) ；-GlcNAc-MA153-B(MabEm)聯(lián)接做成 單結(jié)合體測(cè)定，做腫瘤檢測(cè)；-GlcNAc -MA153-C(Pab)聯(lián)接做成單結(jié)合體測(cè)定，做腫瘤檢 測(cè)；-GlcNAc-MA153-D(biotin_ATV新植物凝集素 Triticum Vulgaris)聯(lián)接做成單結(jié)合體 測(cè)定，做腫瘤檢測(cè)。
[0069] 本發(fā)明以-GlcNAc用作初始抗原、靶標(biāo)、配體，來(lái)制備、尋找、培育、篩選特異結(jié)合 體，如：適配體、單克隆抗體、多克隆抗體、植物凝集素、凝集素、受體，以建立腫瘤標(biāo)志物檢 測(cè)分析。以-GlcNAc為目的分析物，做腫瘤標(biāo)志物測(cè)定；
[0070] 由于在腫瘤患者的血清中，N-乙酰氨基葡萄糖經(jīng)常與糖蛋白鏈接，因此，在檢測(cè) 腫瘤的物質(zhì)中，可以使用N-乙酰氨基葡萄糖與糖蛋白鏈接產(chǎn)物作為抗原，如高度純化的 MA153(Mu-GlcNAc)抗原作為起始抗原、靶標(biāo)、配體、來(lái)制備、尋找、篩選、培育特異結(jié)合體 如：適配體、單克隆抗體、多克隆抗體、植物凝集素、凝集素、受體，以便建立腫瘤檢測(cè)方法； 以MA153 (Mu-GlcNAc)為目的分析物，做腫瘤標(biāo)志物測(cè)定；
[0071] 抗原結(jié)構(gòu)（Mu-GlcNAc)為指導(dǎo)，或以這些路線為線索，來(lái)獲得結(jié)合體，做成腫瘤標(biāo) 志物檢測(cè)；
[0072] 又如，糖蛋白-N-乙酰-氨基葡萄糖Gp-GlcNAc用作初始抗原、靶標(biāo)、配體，來(lái)制 備、尋找、培育、篩選特異結(jié)合體，如：適配體、單克隆抗體、多克隆抗體、植物凝集素、凝集 素、受體，以建立腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)分析；以-Gp-GlcNAc為目的分析物，做腫瘤標(biāo)志物測(cè)定；
[0073] 基于上述方法，本發(fā)明利用N-乙酰氨基葡萄糖作為腫瘤檢測(cè)的標(biāo)志物進(jìn)行腫瘤 檢測(cè)物質(zhì)的篩選應(yīng)用有下述幾種方式：
[0074] a、l)Mu_GlcNAc、或者Gp-GlcNAc作為整體純靶標(biāo)制備適配體；2)小分子的GlcNAc 可以單獨(dú)做靶標(biāo)直接篩選、制備適配體，用于腫瘤檢測(cè)；
[0075] b、l)Mu_GlcNAc、或者Gp-GlcNAc作為整體純抗原制備單克隆抗體；2)小分子 GlcNAc作為半抗原（hapten)聯(lián)接載體蛋白成為有效抗原，制備單克隆抗體，用于腫瘤檢 測(cè)；
[0076] c、l)Mu_GlcNAc、或者Gp-GlcNAc作為整體純抗原制備多克隆抗體；2)小分子 GlcNAc作為半抗原（hapten)聯(lián)接載體蛋白成為有效抗原，制備多抗，用于腫瘤檢測(cè)。
[0077] 實(shí)施例
[0078] 實(shí)施例1、N-乙酰氨基葡萄糖用于腫瘤檢測(cè)的發(fā)現(xiàn)和鑒定
[0079] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者的血液中有一種N-乙酰氨基葡萄糖的含量與健 康人的血液中的含量相比具有顯著的差異。
[0080] 本發(fā)明用腫瘤患者的血液在體外直接做SELDI、MELDI質(zhì)譜分析，得到腫瘤患者特 別的糖結(jié)構(gòu)圖譜，找到腫瘤的特異譜線，從而從兩種類型質(zhì)譜儀的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)腫瘤特 異糖結(jié)構(gòu)、糖蛋白，目前我們發(fā)現(xiàn)的就是GlcNAc(N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖） 特殊糖基，進(jìn)而以聚丙酰胺電泳、高壓液相層析、凝集素親和層析分離純化得到的目標(biāo)糖蛋 白。
[0081] 我們?cè)囉糜H和層析的方法（Mu-GlcNAc通過(guò)決定簇-PDTR-掛到單抗Ma695親和層 析柱上，從而得到純化的腫瘤抗原Mu-GlcNAc)從MCF-7腫瘤細(xì)胞株Mucinl(粘蛋白1，一個(gè) 糖蛋白）。我們用凝集素芯片技術(shù)證實(shí)，上述新提取的Mucinl恰巧攜帶有密集的-GlcNAc， 我們判斷這正是我們尋找的新標(biāo)志物，并在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。
[0082] 將上述提取的這種糖蛋白命名為MA153,其化學(xué)結(jié)構(gòu)中N-乙酰氨基葡萄糖鏈接粘 蛋白1 (Mucinl，代號(hào)Mu)它鏈接的位置在粘蛋白1內(nèi)糖鏈的暴露端，見圖1B，粘蛋白1 (Mu) 結(jié)構(gòu)的氨基酸序列為（-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-) X N，即粘蛋白1 (Mu_)的氨基酸序列 為：-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-的多次重復(fù)排列。并且發(fā)現(xiàn)它可以與單克隆抗體Ma695和相 關(guān)Aptamer (適配體）形成Ma695 -Mu-GlcNAc_Aptamer的夾心反應(yīng)。因此，可以通過(guò)對(duì) N-乙酰氨基葡萄糖的檢測(cè)，來(lái)鑒定腫瘤。新腫瘤標(biāo)志物-GlcNAc (N-乙酰氨基葡萄糖）結(jié)構(gòu) (見圖1A)及其與所在糖蛋白的關(guān)系，和與相關(guān)結(jié)合體的關(guān)系（見圖1B)。其中，其連接的 粘蛋白l(Mu-)的氨基酸序列為：-PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA-的多次重復(fù)排列。
[0083] 新標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)后建立N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合體是第二個(gè)關(guān)鍵步驟。明確 的結(jié)構(gòu)，純化的抗原為制備特異結(jié)合體，提供了極為便利的條件。SELEX新技術(shù)制備適配 體（aptamer)是我們的首選，它既可用于腫瘤診斷也可用于腫瘤治療，它的分子較小，在腫 瘤靶向治療方面具有比抗體更多的優(yōu)越性。其后是單克隆抗體、多克隆抗體、植物凝集素 (PHA)和/或受體及其他配體。最后我們得到了 4種針對(duì)-GlcNAc抗原/決定簇的最適 結(jié)合體：適配體MA153-A、單克隆抗體MA153-B(E111)、多克隆抗體MA153-C、新植物凝集素 MA153-D(biotin-ATV, biotin-phyto-Agglutinin from Triticum Vulgaris):具體如下 A-D所述：
[0084] A適配體，在Biosearch 8600DNA合成儀上合成含有百萬(wàn)億以上個(gè)不同結(jié)構(gòu)的單 鏈DNA片段構(gòu)成的核酸文庫(kù)。PCR擴(kuò)增，成為DNA雙鏈。解離雙鏈，標(biāo)記其一，用做同位素實(shí) 驗(yàn)。分離互補(bǔ)鏈進(jìn)入篩選。起始靶的（"抗原"）：N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc)，所用技術(shù)： SELEX。用固相Mu-GlcNAc撲捉候補(bǔ)Aptamer，形成Mu-GlcNAc-DNA單鏈復(fù)合物。從復(fù)合物中 解離DNA單鏈。再次進(jìn)入PCR擴(kuò)增（步驟2)。如此往復(fù)循環(huán)11周，得到想要的Aptamer。共 獲得A1 -A3030個(gè)克隆，核苷酸序列為Pl(18)-N60-P2(18)通式；本實(shí)驗(yàn)所用MA153-A屬克 隆A1為篩選獲得的特異性效果最好的克隆，其序列：5'-CGTAC GGTCG ACGCT AGC-3'-gggtt cagtg gtcga cgact ttgtt tgtgt cctca catgc attac taacg gtcat ccctg_5, -GGATC CGAGC TCCAC GTG-3'（序列 1 所示），Kd 20nM。
[0085] 生物素標(biāo)記適配體
[0086] 將適配體（序列1所示）lmg在0. 1M PH8. 8硼酸緩沖液中透析12小時(shí)以上，取出 后放置在干凈的玻璃瓶中，配制NH-Biotin lmg/mL，取50微升快速加入到適配體溶液中， 室溫（25攝氏度）震蕩2小時(shí)，在含0. 5BSA 0. 05M PH 7. 5PBS中透析兩天，取出備用。
[0087] B 單克隆抗體，MA153-B :Mab Elll，IgGl，Ka 1010L/M，抗原決定簇 GlcNAc，鼠抗， 雜交瘤技術(shù)。
[0088] C 多克隆抗體，MA153-C ;Pab anti-GlcNAc，Ka 1010L/M，所對(duì)應(yīng)的半抗原GlcNAc， 兔抗，皮下多點(diǎn)注射免疫技術(shù)。
[0089] D新植物凝集素/或受體，MA153-D :生物素-植物凝集素 Triticum Vulgaris, ATV, Sigma USA, Catalogue No 9604〇
[0090] 實(shí)施例2、利用N-乙酰氨基葡萄糖篩選特異性結(jié)合體檢測(cè)腫瘤的方法（夾心法）
[0091] 夾心模式測(cè)定Mu-GlcNAc抗原，其原理如圖2所示。
[0092] (一）材料和方法
[0093] 1試劑和腫瘤患者血清標(biāo)本
[0094] 1. 1 試劑 Ma695 單克隆抗體（Mab)，CanAg Diagnostics AB,瑞典，生物素 (biotin)聯(lián)結(jié)的Aptamer (如實(shí)施例1制備的序列1所示的適配體，生物素標(biāo)記）， Mu-GlcNAc抗原，自行親和層析提取（見實(shí)施例1);也可購(gòu)自北京永瀚星港生物科技有限公 司。
[0095] 1.2癌癥患者血清標(biāo)本腫瘤患者血請(qǐng)來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院和解放軍 301醫(yī)院，患者診斷均經(jīng)病理證實(shí)。
[0096] 2 方法
[0097] 2. 1固相抗體制備將2mg Ma695單抗溶解在200mL pH9. 2的磷酸緩沖液中，分裝 于聚苯乙烯小試管內(nèi)，每管0. 2mL，4°C放置過(guò)夜，棄去磷酸緩沖液，加入0. 2mL 6 %的牛血 清白蛋白溶液進(jìn)行飽和包被，4°C放置5小時(shí)，棄牛血清白蛋白溶液，放置4°C備用。
[0098] 2. 2 1251標(biāo)記鏈酶親和素（Streptavidin)的制備取Iodogen涂管一支（陳智 周，范振符.腫瘤相關(guān)抗原CA-50的免疫放射分析.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1988,4(1): 60-64.)，加入 0· 05mol/L ρΗ7· 5 含有 100 μ g str印tavidin 的磷酸緩沖液 100 μ L,，一邊攪 拌一邊加入10 μ L125I (3. 7xlOTBq)，室溫下反應(yīng)5min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至S印hdex G25柱，收集 第一個(gè)放射性峰，置4°C備用。
[0099] 2.3反應(yīng)溶液和洗滌液的配制于pH7.5,0.05mol/L PBS緩沖液中加入0.05% 0&(：12、0.05%1%(：1 2、6%854，成為反應(yīng)溶液；于反應(yīng)溶液中加入0.01%的吐溫20即為洗滌 液。
[0100] 2. 4標(biāo)準(zhǔn)液配制將Mu-GlcNAc原液用反應(yīng)溶液稀釋成0、1、3、10、30、100、300U/ mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)。U為N-乙酰氨基葡萄糖活性單位。
[0101] 2. 5 Mu-GlcNAc測(cè)定步驟向包被好單抗Ma695的聚苯乙烯小試管內(nèi)加入標(biāo) 準(zhǔn)液、被測(cè)血清樣品各〇. lmL，然后加入biotin-Aptamer (生物素（biotin)聯(lián)結(jié)的 Aptamer) 0· lmL (約0· 01 μ g)，4°C反應(yīng)過(guò)夜（不少于12小時(shí)），棄反應(yīng)液，用洗滌液洗3次， 加入1251-streptavidin 0· lmL (約15萬(wàn)cpm)，室溫反應(yīng)2h，棄反應(yīng)液，用洗漆液洗3次， 測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中Mu-GlcNAc含量，以U/mL表示。
[0102] 2.6臨床測(cè)定結(jié)果判定取100例正常人血清，Mu-GlcNAc抗原測(cè)定結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 檢測(cè)腫瘤的試劑盒，包含可以與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的物質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述檢測(cè)腫瘤的試劑盒為以血清為檢 測(cè)樣本的試劑盒；所述腫瘤為惡性腫瘤。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺 癌、食管癌、口腔癌、結(jié)腸癌、膽管癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、胃癌、腎癌和賁門癌 的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：能與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的 物質(zhì)為以N-乙酰氨基葡萄糖為抗原決定簇的單克隆抗體、多克隆抗體、與N-乙酰氨基葡萄 糖特異性結(jié)合的適配體或與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的凝集素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的適 配體為序列表中序列1所示的核酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括生物素標(biāo)記所述適配 體、酶標(biāo)記鏈酶親和素、聚苯乙烯酶標(biāo)板和PH9. 2, 0. 1M碳酸緩沖液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括Ma695單抗、生物素標(biāo) 記適配體、酶標(biāo)記鏈酶親和素。
8. 與N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合的適配體，為序列表中序列1所示的核酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/115GK104267185SQ201410464565
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】范振符 申請(qǐng)人:范飛舟