兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及寄生蟲的純化提取方法，具體為一種兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法，該方法將感染兔肝球蟲肝臟的白色病變結節(jié)研磨后，過濾并經(jīng)多次離心后獲得沉淀，加入重鉻酸鉀溶液，25-40℃下?lián)u床培養(yǎng)2-6天，獲得純化的肝球蟲卵囊；之后，洗去重鉻酸鉀，再次經(jīng)研磨后多次離心后獲得沉淀，經(jīng)消化和蔗糖梯度離心后，最終獲得形成攻擊性月牙狀的子孢子。該方法從感染兔的肝臟中分離提純斯氏艾美爾球蟲的純卵囊并形成攻擊性子孢子，以便對其后續(xù)進行體外的大規(guī)模繁殖、疫苗及藥物的研究做好前期的研究準備工作。
【專利說明】兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及寄生蟲的純化提取方法，具體為一種兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法。

【背景技術】
[0002]兔球蟲是家兔最常見的一種寄生蟲，由于其對養(yǎng)兔業(yè)危害極大，幼兔感染率高達90%以上，患病幼兔死亡率高達40%?70%。早在1935年我國研究者就開始了兔球蟲種類調(diào)查，尤其是解放后眾多學者在全國范圍內(nèi)開展了兔球蟲種類調(diào)查、內(nèi)生發(fā)育史、各階段蟲體的超微結構、細胞化學、球蟲免疫機理等方面的研究?，F(xiàn)公開文獻所記載的兔球蟲種類較多，據(jù)Levine (1985年)等人的研究確認共有14種，且都為艾美爾屬，除斯氏艾美爾球蟲寄生于兔肝膽管上皮細胞外，其余13種都寄生于腸。目前，國內(nèi)外對斯氏艾美爾球蟲即兔肝球蟲的研究不多，對它造成的危害性也沒有引起足夠的重視，實用性的研究成果基本上處于零。肝球蟲卵囊在外界環(huán)境中有極強的生存能力和抵抗力，卵囊在外界土壤中可生存4-9個月，在有樹蔭的地方可生存15-18個月。一般的消毒藥,如5%福爾馬林、5%石碳酸、5%硫酸銅、10%硫酸、5%氫氧化鉀及5%碘化鉀、2%的來蘇爾、0.2%的新潔爾滅、0.25%麝香草酚對卵囊均無作用，甲醛熏煙無效，由此造成的傳播極其廣泛，且由于不同蟲株的免疫原性沒有交叉性限制了疫苗的研制，使該病預防極為困難。因此，一旦感染則很難清除，給畜牧業(yè)經(jīng)濟造成極大的危害。
[0003]經(jīng)查閱及參考相關外文文獻，發(fā)現(xiàn)僅有一篇關于Eimeria tenella的子孢子純化過程，即用胰蛋白酶牛黃膽酸鈉進行脫囊，隨后按文獻記載的方法進行還原，但沒有成功，更沒有出現(xiàn)文獻報道的形成子孢子。
[0004]概括其步驟如下:
A、用5%的次氯酸鈉分離純化后的艾美爾球蟲卵囊，卵囊壁為兩層，薄的淺色內(nèi)層和厚的亮色外層，內(nèi)層顏色較淺并清晰。
[0005]B、用0.4%胃蛋白酶/HCl室溫培養(yǎng)2h后卵囊壁變皺接近孢子囊。
[0006]C、分離艾美爾球蟲的卵囊，0.4%胰蛋白酶/0.75%牛磺膽酸液在40°C條件下孵育
2.5h，卵囊壁破裂，孢子囊開始向外擠出。
[0007]D、脫離卵囊壁的孢子囊和卵囊壁的碎片在0.75%牛磺膽酸液中繼續(xù)40°C孵育2h。
[0008]E、子孢子在RPMI培養(yǎng)基中40°C孵育1h ;具體步驟如下:
步驟1:培養(yǎng)基0.4%的胃蛋白酶用蒸餾水配制，用IN的HCl調(diào)節(jié)pH至3，孵育16卵囊/10ml，0.4%胃蛋白酶在40°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，用PBS (llOOg, 1min)洗2次。
[0009]步驟2:培養(yǎng)基A液，0.4%胰蛋白酶/0.75%?；悄懰嵋?，用RPMI為基質配制孵育，16卵囊/1ml，0.4%A液在40°C恒溫振蕩器(180rpm)中培養(yǎng)2h，釋放出的孢子囊達30_40%。用 PBS (1100g，10min)洗 2 次。
[0010]步驟3:培養(yǎng)基B液，0.75%?；悄懰嵋?，2.5mM的MgCl2用RPMI為基質配制孵育:16 卵囊 /10ml，B 液在 40。。，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2h 用 PBS (llOOg, 1min)洗 2 次。
[0011]步驟4:培養(yǎng)基RPMI加1%的胎牛血清，孵育40°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6_10h。
[0012]上述所有步驟必須進行無菌操作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于從注冊場的兔廠中分離提純斯氏艾美爾肝球蟲的純卵囊及形成攻擊性子孢子。
[0014]本發(fā)明是采用如下技術方案實現(xiàn)的:
一種兔肝球蟲卵囊純化的方法，包括如下步驟:
(1)、從感染兔肝球蟲的兔子肝臟中將白色病變結節(jié)挑出于研磨容器中并加生理鹽水；
(2)、將白色病變結節(jié)研磨；
(3)、過濾于容器內(nèi)；
(4)、將收集的濾液分裝于多個離心管中，離心后棄上清；然后將沉淀懸浮于水中，重復此步驟一次；
(5)、將沉淀溶于飽和NaCl溶液中，加水后離心，吸取表面的糊狀物及上清液于另一容器內(nèi)，加水稀釋收集液，再次離心后棄上清；重復此步驟一次；
(6)、在沉淀中加入重鉻酸鉀溶液，25-40°C下?lián)u床培養(yǎng)2-6天，即可得到純化后的肝球蟲卵囊。
[0015]優(yōu)選的,上述步驟(4)中，離心參數(shù)為:2000_4000r/min離心5_15min。
[0016]步驟(5)中，首次離心參數(shù)為:500-1500r/min離心4_10min ;再次離心參數(shù)為:3000-5000r/min 離心 5_15min。
[0017]步驟(6)中，重鉻酸鉀溶液的濃度為1.5%_4%。
[0018]兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法，包括如下步驟:
(1)、兔肝球蟲卵囊純化的方法同上；
(2)、用無菌生理鹽水先洗掉重鉻酸鉀，離心后得到沉淀；
(3)、將沉淀溶于滅菌的生理鹽水中，將懸浮液加至組織研磨器，研磨至90%以上破碎；
(4)、用生理鹽水洗凈研磨器中剩余的孢子放入離心管，將懸浮液離心后棄上清液，得到沉淀；
(5)、將膽汁用生理鹽水稀釋后置于消化瓶中，將沉淀加入該消化瓶中，然后加1-5倍消化液，放置30-40°C恒溫水浴中消化，經(jīng)觀察無子孢子囊后終止消化，然后將其轉入離心管內(nèi)，離心后棄上清，用生理鹽水懸浮沉淀；
(6)、將懸浮液加入配好的蔗糖梯度離心管中離心；在梯度離心管內(nèi)蔗糖濃度按從下到上57-65%、45-52%、28-37%配制；離心后的子孢子分別集中于不同蔗糖濃度的分界液面之間；
(7)、吸取子孢子于離心管中然后加生理鹽水稀釋，離心后棄上清，沉淀即為具備攻擊性月牙狀的子孢子。
[0019]優(yōu)選的,上述步驟(2)中，離心參數(shù)為:2000-3000r/min離心5_6min。
[0020]步驟(4)中，離心參數(shù)為:2000-3500r/min離心 5-lOmin。
[0021]步驟(5)中，所述消化液由體積比為0.6-1.8:1的0.18%_0.30%的胰酶和膽汁構成，所述膽汁由l_2ml純膽汁加5-8ml生理鹽水構成；離心參數(shù)為:1800-3000r/min離心6-10mino
[0022]步驟(6)中，離心參數(shù)為:1000-1800r/min離心 4_8min。
[0023]步驟(7)中，離心參數(shù)為:2000-2500r/min離心 6_8min。
[0024]上述方法從感染兔的肝臟中分離提純斯氏艾美爾球蟲的純卵囊和攻擊性子孢子，以便對其后續(xù)進行繁殖及藥物的研究做好前期的研究工作，也為下一步研究針對其生長的特異性即僅在兔肝臟中存活的特性，通過原代培養(yǎng)兔肝細胞，接種分離到的純斯氏艾美爾球蟲的純卵囊對其進行繁殖及藥物的研究，尋找合適的針對本病的防治方法，以便解決治療兔球蟲病過程中造成的濫用藥物等方面提供參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1表示直接從屠宰車間患病肝臟中挑取鏡檢后的肝球蟲卵囊。
[0026]圖2表示飽和鹽水處理I次的卵囊純化情況。
[0027]圖3表示飽和鹽水處理2次的卵囊純化情況。
[0028]圖4表示研磨10分后的鏡檢情況。
[0029]圖5表示消化36分鐘后的鏡檢情況。
[0030]圖6表示處于蔗糖段的攻擊性孢子。
[0031 ]圖7表示處于最下層的攻擊性孢子。

【具體實施方式】
[0032]下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施例進行詳細說明。
[0033]肝球蟲的病原形態(tài)結構如下:
①直接涂片法:從兔屠宰車間挑選有白色突起的肝臟，通過冷藏的方法當日運送到實驗室。用接種環(huán)自肝臟表面的白色腫塊突起挑取一環(huán)至生理鹽水中，在40倍顯微鏡下觀察肝球蟲卵囊為長卵圓形或橢圓形，試驗中測得其平均大小為34umX22um，如圖1所示，直接從屠宰車間患病肝臟中挑取鏡檢后的肝球蟲卵囊。
[0034]②飽和鹽水漂浮法:取5?1g糞便置于100?200ml燒杯中，加入少量飽和鹽水，攪拌均勻后，繼續(xù)加飽和鹽水約至20倍，用糞篩或紗布過濾至另一燒杯中，棄去糞渣。將盛有濾液的燒杯靜置40?45min后，用直徑0.5?1.0cm的金屬圈水平接觸液面，將粘在金屬圈上的液體移置于載玻片上，加蓋玻片后鏡檢。
[0035]在分離肝球蟲時發(fā)現(xiàn)，感染不太嚴重的肝臟，最初是沿著肝膽管移行的，只要拿鑷子一扯，即可順著肝膽管提出來，在平時肉眼是看不到肝膽管的；但感染嚴重時，肝球蟲則布滿整個被感染的肝臟。
[0036]實施例1
兔肝球蟲卵囊純化的方法如下:
A、從肝臟將白色病變結節(jié)挑出于研磨容器中，并加適量的生理鹽水。
[0037]B、挑完后用小剪子將結節(jié)充分剪碎后研磨lOmin。
[0038]C、將碎塊結節(jié)經(jīng)4層紗布過濾，濾于一大容器內(nèi)，邊過濾邊用蒸餾水洗。反復洗2-3遍至結節(jié)組織完全為白色，鏡檢涂片基本無球蟲后丟棄廢液缸滅菌處理。
[0039]D、將收集的濾液分裝于50ml離心管中，3000r/min離心15min棄上清。將沉淀懸浮于水中，重復此步驟一次。
[0040]E、將沉淀溶于1ml飽和NaCl溶液中并加5ml水混勻上離心機，500r/min離心8min，吸取表面的糊狀物(肝球蟲)及上清液于另一容器內(nèi)，加水稀釋收集液5倍左右，4000r/min離心15min棄上清；重復此步驟一次，得到的白色沉淀即為雜質較少的肝球蟲卵囊。
[0041]F、加入數(shù)倍體積的1.5%重鉻酸鉀溶液，40°C恒溫搖床培養(yǎng)2-4天，得到純化后的肝球蟲卵囊，收集4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0042]實施例2
兔肝球蟲卵囊純化的方法如下:
A、從肝臟將白色病變結節(jié)挑出于研磨容器中，并加適量的生理鹽水。
[0043]B、挑完后用小剪子將結節(jié)充分剪碎后研磨20min。
[0044]C、將碎塊結節(jié)經(jīng)4層紗布過濾，濾于一大容器內(nèi)，邊過濾邊用蒸餾水洗。反復洗2-3遍至結節(jié)組織完全為白色，鏡檢涂片基本無球蟲后丟棄廢液缸滅菌處理。
[0045]D、將收集的濾液分裝于50ml離心管中，4000r/min離心5min棄上清。將沉淀懸浮于水中，重復此步驟一次。
[0046]E、將沉淀溶于1ml飽和NaCl溶液中并加5ml水混勻上離心機，1000r/min離心lOmin，吸取表面的糊狀物(肝球蟲)及上清液于另一容器內(nèi)，加水稀釋收集液8倍左右，3000r/min離心1min棄上清；重復此步驟一次，得到的白色沉淀即為雜質較少的肝球蟲卵囊。
[0047]F、加入數(shù)倍體積的4%重鉻酸鉀，25°C恒溫搖床培養(yǎng)4_6天，得到純化后的肝球蟲卵囊，收集4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0048]實施例3
兔肝球蟲卵囊純化的方法如下:
A、從肝臟將白色病變結節(jié)挑出于研磨容器中，并加適量的生理鹽水。
[0049]B、挑完后用小剪子將結節(jié)充分剪碎后研磨15min。
[0050]C、將碎塊結節(jié)經(jīng)4層紗布過濾，濾于一大容器內(nèi)，邊過濾邊用蒸餾水洗。反復洗2-3遍至結節(jié)組織完全為白色，鏡檢涂片基本無球蟲后丟棄廢液缸滅菌處理。
[0051]D、將收集的濾液分裝于50ml離心管中，2000r/min離心1min棄上清。將沉淀懸浮于水中，重復此步驟一次。
[0052]E、將沉淀溶于1ml飽和NaCl溶液中并加5ml水混勻上離心機，1500r/min離心4min，吸取表面的糊狀物(肝球蟲)及上清液于另一容器內(nèi)，加水稀釋收集液7倍左右，5000r/min離心5min棄上清；重復此步驟一次，得到的白色沉淀即為雜質較少的肝球蟲卵囊。
[0053]F、加入數(shù)倍體積的3%重鉻酸鉀，30°C恒溫搖床培養(yǎng)3-4天，得到純化后的肝球蟲卵囊，收集4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0054]飽和鹽水處理I次的卵囊純化情況如圖2所示。飽和鹽水處理2次的卵囊純化情況如圖3所示。
[0055]實施例4 兔肝球蟲卵囊純化后形成攻擊性子孢子的方法如下:
A、用無菌生理鹽水先洗掉重鉻酸鉀,洗2-3次,2500r/min離心6min,棄上清。
[0056]B、將沉淀溶于Iml滅菌的生理鹽水中，將懸浮液放置組織研磨器中，研磨1min左右后鏡檢一次。如圖4所示，研磨1min后卵囊的破碎情況。
[0057]C、若未達90%上破碎，再研磨2min后鏡檢；直至90%以上破碎。
[0058]D、用生理鹽水洗凈研磨器中剩余的孢子放入離心管，將懸浮液經(jīng)3500r/min離心1min,棄上清液,得到沉淀。
[0059]E、將膽汁用少許生理鹽水稀釋置于青霉素小瓶(消化瓶)中，將沉淀置于消化瓶中，然后加I倍消化液(消化液由體積比為0.2%的胰酶:膽汁=0.6:1，膽汁由Iml純膽汁加8ml生理鹽水構成)30°C恒溫水浴消化，每半小時觀察一次，如圖5所示，消化36min后的鏡檢情況；間隔1min搖晃消化瓶，經(jīng)觀察基本無子孢子囊后終止消化，然后將其轉入離心管內(nèi)，1800r/min離心8min。棄上清,用l_2ml生理鹽水懸浮沉淀。
[0060]F、將懸浮液加入配好的蔗糖梯度(蔗糖濃度按從下到上57%，48%，35%配制)離心管中，1300r/min離心8min。子孢子分別基本集中于35%與48%、48%與57%之間的分界液面中；如圖6、7所示，成為攻擊性子孢子。
[0061]G、用長嘴吸管吸出子孢子置于離心管中，然后加數(shù)倍體積生理鹽水稀釋后，2500r/min離心7min后棄上清,沉淀即為具備攻擊性月牙狀的子孢子。
[0062]實施例5
兔肝球蟲卵囊純化后形成攻擊性子孢子的方法如下:
A、用無菌生理鹽水先洗掉重鉻酸鉀,洗2-3次,2000r/min離心5min,棄上清。
[0063]B、將沉淀溶于Iml滅菌的生理鹽水中，將懸浮液放置組織研磨器中，研磨15min后鏡檢一次。如圖4所示,研磨1min后卵囊的破碎情況。
[0064]C、若未達90%上破碎，再研磨2min后檢驗；直至90%以上破碎。
[0065]D、用生理鹽水洗凈研磨器中剩余的孢子放入離心管，將懸浮液經(jīng)2500r/min離心5min,棄上清液,得到沉淀。
[0066]E、將膽汁用少許生理鹽水稀釋置于青霉素小瓶(消化瓶)中，將沉淀置于消化瓶中，然后加3倍消化液(消化液有體積比0.3%的胰酶:膽汁=1.2:1，膽汁由1.5ml純膽汁加5ml生理鹽水構成)40°C恒溫水浴消化，每半小時觀察一次，如圖5所示，消化36min后的鏡檢情況；間隔1min搖晃消化瓶，經(jīng)觀察基本無子孢子囊后終止消化，然后將其轉入離心管內(nèi)，2700r/min離心lOmin。棄上清,用l_2ml生理鹽水懸浮沉淀。
[0067]F、將懸浮液加入配好的蔗糖梯度(蔗糖濃度按從下到上65%，45%，37%配制)離心管中，1800r/min離心4min。子孢子分別基本集中于37%與45%、45%與65%之間的分界液面中；如圖6、7所示，成為攻擊性子孢子。
[0068]G、用長嘴吸管吸出子孢子置于離心管中，然后加數(shù)倍體積生理鹽水稀釋后，2200r/min離心8min后棄上清,沉淀即為具有攻擊性月牙狀的子孢子。
[0069]實施例6
兔肝球蟲卵囊純化后形成攻擊性子孢子的方法如下:
A、用無菌生理鹽水先洗掉重鉻酸鉀,洗2-3次,3000r/min離心6min,棄上清。
[0070]B、將沉淀溶于Iml滅菌的生理鹽水中，將懸浮液放置組織研磨器中，研磨15min后鏡檢一次。如圖4所示,研磨1min后卵囊的破碎情況。
[0071]C、若未達90%上破碎，再研磨2min后檢驗；直至90%以上破碎。
[0072]D、用生理鹽水洗凈研磨器中剩余的孢子放入離心管，將懸浮液經(jīng)2000r/min離心8min,棄上清液,得到沉淀。
[0073]E、將膽汁用少許生理鹽水稀釋置于青霉素小瓶(消化瓶)中，將沉淀置于消化瓶中，然后加5倍消化液(消化液由體積比為0.18%的胰酶:膽汁=1.8:1，膽汁通常由2ml純膽汁加7ml生理鹽水構成)35°C恒溫水浴消化，每半小時觀察一次，如圖5所示，消化36min后的鏡檢情況；間隔1min搖晃消化瓶，經(jīng)觀察基本無子孢子囊后終止消化，然后將其轉入離心管內(nèi)，3000r/min離心6min。棄上清,用l_2ml生理鹽水懸浮沉淀。
[0074]F、將懸浮液加入配好的蔗糖梯度(蔗糖濃度按從下到上62%，52%，28%配制)離心管中，1000r/min離心6min。子孢子分別基本集中于28%與52%、52%與62%之間的分界液面中；如圖6、7所示，成為攻擊性子孢子。
[0075]G、用長嘴吸管吸出子孢子置于離心管中，然后加數(shù)倍體積生理鹽水稀釋后，2000r/min離心6min后棄上清,沉淀即為具備攻擊性月牙狀的子孢子。
【權利要求】
1.一種兔肝球蟲卵囊純化的方法，其特征在于如下幾個步驟: (1)、從感染兔肝球蟲的兔子肝臟中將白色病變結節(jié)挑出于研磨容器中并加生理鹽水； (2)、將白色病變結節(jié)研磨； (3)、過濾于容器內(nèi)； (4)、將收集的濾液分裝于多個離心管中，離心后棄上清；然后將沉淀懸浮于水中，重復此步驟一次； (5)、將沉淀溶于飽和NaCl溶液中，加水后離心，吸取表面的糊狀物及上清液于另一容器內(nèi)，加水稀釋收集液，再次離心后棄上清；重復此步驟一次； (6)、在沉淀中加入重鉻酸鉀溶液，25-40°C下?lián)u床培養(yǎng)2-6天，即可得到純化后的肝球蟲卵囊。
2.根據(jù)權利要求1所述的兔肝球蟲卵囊純化的方法，其特征在于:步驟(4)中，離心參數(shù)為:2000-4000r/min 離心 5_15min。
3.根據(jù)權利要求1所述的兔肝球蟲卵囊純化的方法，其特征在于:步驟(5)中，首次離心參數(shù)為:500-1500r/min離心4-10min ;再次離心參數(shù)為:3000-5000r/min離心5_15min。
4.根據(jù)權利要求1所述的兔肝球蟲卵囊純化的方法，其特征在于:步驟(6)中，重鉻酸鉀溶液的濃度為1.5-4%。
5.一種兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法，其特征在于如下幾個步驟: (1)、兔肝球蟲卵囊純化方法同權利要求1-4任一所述； (2)、用無菌生理鹽水先洗掉重鉻酸鉀，離心后得到沉淀； (3)、將沉淀溶于滅菌的生理鹽水中，將懸浮液加至組織研磨器，研磨至90%以上破碎； (4)、用生理鹽水洗凈研磨器中剩余的孢子放入離心管，將懸浮液離心后棄上清液，得到沉淀； (5)、將膽汁用生理鹽水稀釋后置于消化瓶中，將沉淀加入該消化瓶中，然后加1-5倍消化液，放置30-40°C恒溫水浴中消化，經(jīng)觀察無子孢子囊后終止消化，然后將其轉入離心管內(nèi)，離心后棄上清，用生理鹽水懸浮沉淀； (6)、將懸浮液加入配好的蔗糖梯度離心管中離心；在梯度離心管內(nèi)蔗糖的濃度按從下到上57-65%、45-52%、28-37%配制；離心后的子孢子分別集中于不同蔗糖濃度的分界液面之間； (7)、吸取子孢子于離心管中然后加生理鹽水稀釋，離心后棄上清，沉淀即為具備攻擊性月牙狀的子孢子。
6.根據(jù)權利要求5所述的兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法，其特征在于:步驟(2)中，離心參數(shù)為:2000-3000r/min離心5_6min。
7.根據(jù)權利要求5所述的兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法，其特征在于:步驟(4)中，離心參數(shù)為:2000-3500r/min離心5-lOmin。
8.根據(jù)權利要求5所述的兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法，其特征在于:步驟(5)中，所述消化液由體積比為0.6-1.8:1的0.18%-0.30%的胰酶和膽汁構成，所述膽汁由l_2ml純膽汁加5-8ml生理鹽水構成；離心參數(shù)為:1800-3000r/min離心6-10mino
9.根據(jù)權利要求5所述的兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法，其特征在于:步驟(6)中，離心參數(shù)為:1000-1800r/min離心4_8min。
10.根據(jù)權利要求5所述的兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法，其特征在于:步驟(7)中，離心參數(shù)為:2000_2500r/min離心6_8min。
【文檔編號】C12N1/10GK104232488SQ201410468113
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權日:2014年9月16日
【發(fā)明者】鞏紅霞, 鞏強, 傅英文, 張祖維, 田文霞, 賈廣樂, 雷宇平, 安偉 申請人:山西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 鞏強