一種擴增游離dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種擴增游離DNA的方法，包括如下步驟：設(shè)計并合成兩條寡核苷酸，寡核苷酸甲3’端為T堿基，從寡核苷酸甲3’端的第二個堿基與寡核苷酸乙5’端開始互補；將寡核苷酸乙5’端用磷酸根修飾；經(jīng)退火反應(yīng)得到接頭DNA。另將游離DNA末端補平后經(jīng)加A反應(yīng)，得到有A粘性末端的游離DNA；以接頭DNA和有A粘性末端的游離DNA進行連接反應(yīng)得到的產(chǎn)物為模板，利用寡核苷酸甲為引物進行PCR擴增。本方法能夠最大程度上保留DNA片段的完整性，防止游離DNA進一步片段化，利用該方法能夠獲得足以滿足常規(guī)檢測的游離DNA模板。
【專利說明】一種擴增游離DNA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于DNA擴增領(lǐng)域，具體涉及一種擴增游離DNA的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 游離DNA存在于血漿、血清或其他體液中的含量較少，且多為DNA分子片段，致使 其在提取過程中容易丟失，提取難度增大，提取量較少，難以滿足常規(guī)檢測的要求，導(dǎo)致檢 測靈敏度較低。如何獲得足以滿足常規(guī)檢測的游離DNA已經(jīng)成為亟待解決的問題。
[0003] 常規(guī)的基因組擴增方法主要有以下兩種：一是利用隨機引物與DNA的任意位置相 結(jié)合并擴增，從而獲得大量的隨機長度的DNA;二是先利用限制性內(nèi)切酶切割DNA，使其形 成長度不等的酶切DNA片段，然后在其酶切形成的粘性末端連接接頭，最后以接頭DNA為模 板進行DNA擴增。這兩種方法的缺點是，擴增產(chǎn)物DNA分子長度小于原來的DNA分子，DNA 分子的完整性遭到破壞，不能保證基因組DNA分子的全長擴增，尤其是對于由小片段DNA分 子構(gòu)成的基因組DNA樣本，很難保證在一條基因組DNA分子片段上同時存在2個酶切位點； 常規(guī)的基因組擴增還會使得基因組，小片段產(chǎn)物過多，導(dǎo)致用于常規(guī)檢測的有效DNA模板 量不足。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種擴增游離DNA的方法，保證常規(guī) 檢測的有效DNA模板量充足，并且保證基因組DNA分子的全長擴增，步驟如下：
[0005] 1.制備接頭DNA:合成兩條寡核苷酸，寡核苷酸甲3'端為T堿基，從寡核苷酸甲 3'端的第二個堿基與寡核苷酸乙5'端開始互補；將寡核苷酸乙5'端用磷酸根修飾；經(jīng)退 火反應(yīng)得到接頭DNA ;
[0006] 2.游離DNA的預(yù)處理：將游離DNA末端補平后經(jīng)加 A反應(yīng)，得到有A粘性末端的 游離DNA ;
[0007] 3.將步驟1得到的接頭DNA和步驟2得到的有A粘性末端的游離DNA進行連接反 應(yīng)，得到連接產(chǎn)物；
[0008] 4.利用步驟3所述的連接產(chǎn)物為模板，利用步驟1中的寡核苷酸甲為引物進行 PCR擴增。
[0009] 以下對本發(fā)明做進一步說明。
[0010] 所述游離DNA取自于血漿、血清、其他體液中。
[0011] 所述的寡核苷酸甲長度為10-50個堿基，所述的寡核苷酸乙長度為5-47個堿基， 寡核苷酸甲的堿基數(shù)比寡核苷酸乙多3-30個。
[0012] 在上述方法中，步驟1所述的磷酸根修飾是通過T4多聚核苷酸激酶實現(xiàn)的。
[0013] 在上述方法中，步驟2所述的末端補平是通過T4 DNA聚合酶實現(xiàn)的。
[0014] 在上述方法中，步驟所述的加 A是通過Taq DNA聚合酶實現(xiàn)的。
[0015] 在上述方法中，步驟3所述的接頭DNA和有A粘性末端的游離DNA的連接是通過 T4DNA連接酶實現(xiàn)的。
[0016] 在上述方法中，步驟4中PCR擴增反應(yīng)過程如下：
[0017] (a)60 ?73°C下接頭延伸 5 ?lOmin，
[0018] (b)90 ?100°C下預(yù)變性 3 ?lOmin，
[0019] (c)90 ?10(TC下變性 10 ?30s，
[0020] (d) 68?73°C下退火（每個循環(huán)較前一循環(huán)降低0· 5°C ) 10?30s，
[0021] (e) 68 ?73°C 下延伸 1 ?5min，
[0022] (f)重復(fù)（c)?（e) 30個循環(huán)，
[0023] (g)90 ?KKTC下變性 10 ?30s，
[0024] (h) 53 ?58? 下退火 10-30s，
[0025] (i) 68 ?73°C下延伸 l-5min，
[0026] 本發(fā)明方法具有以下優(yōu)越性：1、解決了利用隨機引物與DNA的任意位置相結(jié)合并 擴增方法中產(chǎn)物DNA分子的完整性遭到破壞，不能保證基因組DNA分子全長擴增的問題。2、 解決了先利用限制性內(nèi)切酶切割DNA，后在其粘性末端連接接頭，最后以接頭DNA為模板進 行擴增的方法中DNA分子進一步片段化的問題，本方法能夠在擴增的同時最大程度上保留 DNA片段的完整性，防止游離DNA進一步片段化，利用該方法能夠獲得足以滿足常規(guī)檢測的 游離DNA模板。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是實施例1和實施2中游離DNA起始量和獲得量對比圖。
[0028] 圖2是實施例1和實施2的電泳圖像。
[0029] 圖3中A為實施例1和實施2熒光定量PCR擴增曲線，B為未經(jīng)處理的血漿游離 DNA熒光定量PCR擴增曲線。

【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合實驗對本發(fā)明進行進一步說明。
[0031] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實施例中所用的材料試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 實施例1
[0034] (1)設(shè)計并合成甲乙二條寡核苷酸：寡核苷酸甲：5' -GCG GTG ACC CGG GAG ATC TGA ATT CT-3'，寡核苷酸乙：5' -GAA TTC AGA TC-3'。
[0035] (2)寡核苷酸乙5'端磷酸根修飾，反應(yīng)如下（總體系50 μ 1):
[0036] 寡核苷酸乙（ΙΟΟμΜ) Ιμ? lOxrcaction buffer A for T4 PNIC 5μ1 ATP (lOmM) 0·5μ1 T4多聚核苷酸激酶（lOU/μΙ) 1 5μ1 ddH20 丨<|、個 Μ)μΙ
[0037] 輕柔吹打混勻，37°C水浴60min，75°C水浴lOmin滅活。
[0038] (3)退火反應(yīng)（總體系100 μ 1):
[0039] 經(jīng)磷酸跟修飾的寡核苷酸乙 Μμ?
[0040] 寡核苷酸甲 Ιμ? Annealing Buffer for DNA Oligos (5x ) 20μ1 ddH2〇 補個. 100μΙ
[0041] 反應(yīng)條件如下：
[0042] 95 °C 2min
[0043] 95°C (每 90sec 下降 1°C，降至 25°C )
[0044] 4°C 保溫
[0045] 所得產(chǎn)物即為接頭DNA。
[0046] (4)游離DNA的末端補平：利用100ng經(jīng)過酚/氯仿/異戊醇法提取的游離DNA， 進行如下反應(yīng)（總體系10 μ 1):
[0047] 游離 DNA !00ng 1〇χΤ4 BuiTcr Ιμ? 1% BSA Ιμ? dNTP Mixture (2.5mM each) Ιμ? ddH2〇 補至 9μ1 75 °C保溫5min后，移入37°C恒溫槽 T4聚合酶 Ιμ? 用加樣器輕輕吹打混勻。 37°C 保溫 30min
[0048] 使用AxyPr印PCR清潔試劑盒純化DNA，溶解于25 μ lEluent溶液中。
[0049] (5)經(jīng)末端補平后的游離DNA的加 A反應(yīng)：利用步驟（4)所得產(chǎn)物，進行如下反應(yīng) (總體系50 μ 1):
[0050] 經(jīng)末端補平后的游離DNA 24μ1 2><dA Tailing Buffer 25μ1 TaqDNA 聚合酶（5υ/μ1) Ιμ? 72°C 保溫 21ι
[0051] 使用AxyPr印PCR清潔試劑盒純化DNA，樣品溶解于25 μ lEluent溶液中。
[0052] (6)將步驟（3)得到的接頭DNA和步驟（5)得到有A粘性末端的游離DNA進行連 接反應(yīng),反應(yīng)體系如下（總體系30 μ 1):
[0053] 有Α粘性末端的游離DNA 25μ? 接頭DNA 3μ1 l〇xLigasc Buffer 3μ1 T4 DNA 連接酶（3υ/μ1) 1 μ? ddH2〇 補午. 30μ1
[0054] 反應(yīng)條件如下：
[0055] 4°C 12h
[0056] 70°C lOmin
[0057] (7)以步驟（6)產(chǎn)物為模板，步驟⑴中的寡核苷酸為引物，進行PCR擴增反應(yīng)：
[0058] PCR擴增反應(yīng)體系（20μ 1):
[0059] 步驟（6)產(chǎn)物 3μ1 IOxPlaiinum HiProofTaq PCR Buffer 2μ1 MgCh (25mM) 1.2μ1 dNTP (2.5mM each) 1 6μ1 步驟（1)中的寡核苷酸（20μΜ) 0.5μ1 Platinum HiProofTaq (2υ/μ1) 0 5μ| ddH20 補個. 20μ1
[0060] PCR擴增反應(yīng)過程如下：
[0061] (a)60 ?73°C下接頭延伸 5 ?10min，
[0062] (b) 90 ?100°C下預(yù)變性 3 ?10min，
[0063] (c)90 ?10(TC下變性 10 ?30s，
[0064] (d) 68?73°C下退火（每個循環(huán)較前一循環(huán)降低0· 5°C ) 10?30s，
[0065] (e)68 ?73? 下延伸 1 ?5min，
[0066] (f)重復(fù)（c)?（e) 30個循環(huán)，
[0067] (g)90 ?KKTC下變性 10 ?30s，
[0068] (h) 53 ?58? 下退火 10-30s，
[0069] (i) 68 ?73°C下延伸 l-5min，
[0070] (j)重復(fù)（g)?⑴10個循環(huán)，
[0071] (k) 68 ?73°C下延伸 5 ?lOmin，
[0072] (1)-20 ?37°C下保溫。
[0073] 如圖1所示步驟（7)的產(chǎn)物經(jīng)純化后游離DNA的獲得量為1775ng。
[0074] 實施例2
[0075] 步驟⑷中游離DNA為10ng，其它步驟同實施例1。
[0076] 如圖1所示步驟（7)的產(chǎn)物經(jīng)純化后游離DNA的獲得量為1050ng。
[0077] 實施例1和實施例2擴增前后游離DNA起始量和獲得量對比如圖1所示。
[0078] 取實施例1和實施2產(chǎn)物進行電泳，結(jié)果如圖2所示，其中泳道1為DL2000 DNA Marker，泳道1為實施例1產(chǎn)物，泳道2為實施例2產(chǎn)物。
[0079] 實施例1產(chǎn)物、實施例2產(chǎn)物以及血漿游離DNA經(jīng)過qPCR擴增GAPDH基因，上游引 物：5'-GGA CTG AGG CTC CCA CCT TT-3'，下游引物：5'-GCA TGG ACT GTG GTC TGC AA-3'； 反應(yīng)體系：1〇μ 1的2XqPCR Mix、0. 5μ 1的上游引物（10mM)、0. 5μ 1的下游引物（10mM)、 2μ 1 的實施例產(chǎn)物、7μ 1 的 ddH20 ;反應(yīng)條件：95°C 5min，95°C 15s，58°C 15s，72°C 30s，50 個循環(huán)，72°C檢測熒光，72°C 5min。擴增曲線如圖3所示，其中A為實施例1產(chǎn)物和實施例 2產(chǎn)物擴增曲線，B為未經(jīng)處理的血漿游離DNA擴增曲線。
[0080] 結(jié)果表明：本方法可保證常規(guī)檢測的有效DNA模板量充足，提高了檢測靈敏度，并 且保證基因組DNA分子的全長擴增。
【權(quán)利要求】
1. 一種擴增游離DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 合成兩條寡核苷酸，寡核苷酸甲3'端為T堿基，從寡核苷酸甲3'端的第二個堿基與 寡核苷酸乙5'端開始互補；將寡核苷酸乙5'端用磷酸根修飾；經(jīng)退火反應(yīng)得到接頭DNA ; (2) 將游離DNA末端補平后經(jīng)加 A反應(yīng)，得到有A粘性末端的游離DNA ; (3) 將步驟（1)得到的接頭DNA和步驟（2)得到的有A粘性末端的游離DNA進行連接 反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物； (4) 利用步驟（3)得到的連接產(chǎn)物為模板，步驟（1)中的寡核苷酸甲為引物進行PCR擴 增。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述游離DNA取自于血漿、血清、其他體 液中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的寡核苷酸甲長度為10-50個堿基， 所述的寡核苷酸乙長度為5-47個堿基，寡核苷酸甲堿基數(shù)比寡核苷酸乙多3-30個。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中所述的磷酸根修飾是通過T4 多聚核苷酸激酶實現(xiàn)的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的末端補平是通過T4 DNA聚合酶實現(xiàn)的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟⑵中所述的加 A是通過Taq DNA聚 合酶實現(xiàn)的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)中所述的連接是通過T4 DNA連 接酶實現(xiàn)的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟⑷中PCR擴增反應(yīng)過程如下： (a) 60?73°C下接頭延伸5?lOmin， (b) 90?100°C下預(yù)變性3?lOmin， (c) 90 ?100°C下變性 10 ?30s， (d) 68?73°C下退火（每個循環(huán)較前一循環(huán)降低0· 5°C ) 10?30s， (e) 68?73°C下延伸1?5min， (f) 重復(fù)（c)?（e) 30個循環(huán)， (g) 90 ?100°C下變性 10 ?30s， (h) 53 ?58°C下退火 10-30s， (i) 68 ?73°C下延伸 l_5min， (j) 重復(fù)（g)?⑴10個循環(huán)， (k) 68 ?73°C下延伸 5 ?lOmin， (l) -20?37 °C下保溫。
【文檔編號】C12N15/10GK104232619SQ201410468186
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊麒巍, 張桂珍, 杜珍武, 宋旸, 于杉 申請人:吉林大學(xué)