一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法用一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置進(jìn)行。該裝置在支承桌中部設(shè)通孔，桌上放置底板，轉(zhuǎn)化室放于底板上，底板上下表面中部設(shè)上、下圓柱，上、下圓柱上分別套有磁鐵環(huán)Ⅱ和Ⅰ，下圓柱和磁鐵環(huán)Ⅰ位于桌面之下，上圓柱和磁鐵環(huán)Ⅱ位于室內(nèi)，放置滲透液盛放容器的支架置于磁鐵環(huán)Ⅱ上，室內(nèi)上部內(nèi)壁設(shè)環(huán)狀承接臺及帶閥門的空氣通氣管、真空抽氣接管，室的底端口和頂端口均設(shè)密封圈。該裝置可以在轉(zhuǎn)化室處于真空狀態(tài)后，再通過磁鐵環(huán)Ⅰ調(diào)控容器使?jié)B透液與待轉(zhuǎn)化植株稻穗接觸進(jìn)行真空狀態(tài)下的目的基因的滲透轉(zhuǎn)化。本發(fā)明方法操作簡便、快速、能真正在真空狀態(tài)下實現(xiàn)水稻原位滲透遺傳轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)了農(nóng)桿菌對植株的侵染力。
【專利說明】一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于基因工程和分子生物學(xué)實驗技 術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是全球一半以上人口主要的糧食作物，然而，水稻生產(chǎn)受到越來越多不利因 素(如病蟲害等）的限制，因此，水稻品種的改良十分迫切。轉(zhuǎn)基因技術(shù)能突破生物種間障 礙，實現(xiàn)物種間基因的轉(zhuǎn)移，從而為作物遺傳改良提供了新途徑。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對水稻進(jìn) 行遺傳改良的成功與否，很大程度上依賴于有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法的開發(fā)和應(yīng)用?，F(xiàn)在，公 知的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法一般分為2類：一類是直接的基因轉(zhuǎn)化(包括基因槍法、電擊法、PEG 法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等)，這類方法往往因為成本高，操作技術(shù)繁瑣而極少應(yīng) 用；另一類是由載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，目前應(yīng)用較為廣泛的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，利用該方法在水稻 上已成功獲得一些具有抗病蟲害、抗逆等優(yōu)異性狀的轉(zhuǎn)基因材料。
[0003] 然而傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法明顯地存在許多不足：轉(zhuǎn)化的實現(xiàn)必須經(jīng)過對成熟種胚 等外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)、胚性愈傷繼代、胚性愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)、抗性愈傷篩選及抗性愈 傷分化出苗等至少近4個月的組織培養(yǎng)過程，其轉(zhuǎn)化操作繁瑣且周期長，人財物花費大，而 且對操作者的技術(shù)要求高；其次在近4個月的組織培養(yǎng)過程中，易發(fā)生體細(xì)胞變異、形態(tài)畸 形、染色體數(shù)目改變和育性喪失等問題，造成遺傳背景復(fù)雜化；再者得到的轉(zhuǎn)化植株常出現(xiàn) 基因沉默，轉(zhuǎn)化效率低。因此，開發(fā)一種無需經(jīng)過組培過程，具有簡便、快速和高效等優(yōu)勢， 只需對開花前的活體植株短暫真空處理即實現(xiàn)外源基因向植株轉(zhuǎn)化的水稻真空滲透轉(zhuǎn)化 法，便成為水稻基因轉(zhuǎn)化的另一重要途徑。
[0004] 盡管目前有關(guān)真空滲透轉(zhuǎn)化法成功應(yīng)用的研究報道很多，但基本只局限在擬南 芥、芥菜、白菜、菜薹、甘藍(lán)型油菜、蘿卜、煙草等等個體較小的植物上應(yīng)用，而且轉(zhuǎn)化率偏 低，真正獲得的有應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因植物較少?，F(xiàn)有的真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化大多是用現(xiàn)成的、 體積較小的真空干燥器(如圖14所示）作為真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置，其基本操作是：將滲透 轉(zhuǎn)化液倒入真空干燥器，除擬南芥用活體植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化外，其余植物(如芥菜、白菜、菜薹、 甘藍(lán)型油菜、蘿卜、煙草等）均是將待轉(zhuǎn)化植株直接從培養(yǎng)缽中拔出、洗凈后，先將待轉(zhuǎn)化植 株全株或部分浸泡在真空干燥器中的滲透轉(zhuǎn)化液中，此時真空干燥器處于常壓狀態(tài)，然而 植株已浸泡在滲透轉(zhuǎn)化液中開始了滲透遺傳轉(zhuǎn)化，然后，再用真空泵減壓使真空干燥器達(dá) 到真空狀態(tài)，繼續(xù)在真空狀態(tài)下滲透遺傳轉(zhuǎn)化（即真空處理)，達(dá)到預(yù)定時間后（即完成滲透 遺傳轉(zhuǎn)化)，關(guān)閉真空泵開關(guān)，打開真空干燥器通氣閥門，待恢復(fù)常壓后，揭開干燥器蓋，取 出植株種植在培養(yǎng)缽中或田間。擬南芥真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化不同的是，由于擬南芥植株較小 (20-30cm)，一般是在真空干燥器中放置裝有滲透轉(zhuǎn)化液的燒杯，然后將種植在營養(yǎng)缽里的 擬南芥活體植株連同營養(yǎng)缽一起倒置浸入在燒杯中，然后如上所述進(jìn)行真空滲透轉(zhuǎn)化?，F(xiàn) 有的真空滲透轉(zhuǎn)化裝置存在以下不足：（1)采用現(xiàn)有的真空干燥器進(jìn)行的真空滲透轉(zhuǎn)化， 在抽真空減壓之前，植株已經(jīng)浸泡在容器內(nèi)的農(nóng)桿菌滲透液(滲透轉(zhuǎn)化液）中，雖然容器內(nèi) 的植株和滲透液還處于常壓狀態(tài)，但是植株浸泡在容器內(nèi)的農(nóng)桿菌滲透液中已經(jīng)開始了遺 傳轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化過程可以說包含了部分常壓下的滲透轉(zhuǎn)化和部分真空的滲透轉(zhuǎn)化，并沒有 真正實現(xiàn)真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，其農(nóng)桿菌對植株的侵染力降低，轉(zhuǎn)化效率也隨之降低。這可能 也是目前真空滲透轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率偏低的主要原因。（2)現(xiàn)有的真空干燥器由于受體積較 小、沒有適宜活體植物放置的相應(yīng)配套部件以及操作不方便等因素限制，使水稻、花卉、棉 花、麥類等個體較大作物不能實現(xiàn)原種植條件的活體狀態(tài)（即原位條件）下進(jìn)行滲透遺傳轉(zhuǎn) 化，多采用將受體植株挖出，將其直接倒放于容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后又移栽的操作方式， 一方面并不是真正的原位轉(zhuǎn)化，另一方面對轉(zhuǎn)化后植株的生長狀態(tài)、健壯程度和結(jié)實率均 有影響，進(jìn)而造成真空滲透轉(zhuǎn)化效率偏低。（3)即便像擬南芥這樣小的活體植株的真空滲透 遺傳轉(zhuǎn)化操作，也存在許多側(cè)枝被壓斷，導(dǎo)致處理轉(zhuǎn)化效果低的問題。綜上所述，現(xiàn)有的真 空滲透轉(zhuǎn)化裝置及其轉(zhuǎn)化方法并不適于水稻等作物的真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，因此設(shè)計和開發(fā) 出一種操作簡便、快速和高效的適于水稻等作物的真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置及其及其轉(zhuǎn)化方 法，這將極大地縮短轉(zhuǎn)化周期、節(jié)約科研成本，提高轉(zhuǎn)化效率，為作物品種的遺傳改良和基 因功能研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服現(xiàn)有真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置未真正在真空狀態(tài)下實現(xiàn)滲透遺傳轉(zhuǎn)化和不 適于水稻等個體較大作物的不足，本發(fā)明提供一種真正在真空狀態(tài)下、操作簡便、實現(xiàn)水稻 原位真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法，用一種水稻真空滲透轉(zhuǎn)化 裝置對水稻進(jìn)行真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，包括以下步驟： A. 培養(yǎng)待轉(zhuǎn)化的水稻受體植株：根據(jù)遺傳轉(zhuǎn)化計劃，提前在溫室內(nèi)將待轉(zhuǎn)化水稻植株 種植在培養(yǎng)缽20內(nèi)； B. 制備含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液：將構(gòu)建好的Bar基因作為篩選標(biāo)記的含目的 基因的待轉(zhuǎn)化載體用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中；將保存的農(nóng)桿菌菌液接種于含相應(yīng) 抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，于28°C、200r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 7?0. 9,離心收 集菌體，菌體用滲透培養(yǎng)液重懸調(diào)節(jié)0D600至0. 6-0. 8作為含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化 液備用，所述的滲透培養(yǎng)液為1/2MS液體培養(yǎng)基+ As 19. 6mg/L + 200ul/L Silwet L-77+ 鹿糖 50g/L，ρΗ5· 8 ; C. 真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化： ① 將固定連接有上圓柱和下圓柱的底板放置在支承桌上，使下圓柱穿過支承桌上的 通孔并位于支承桌的桌面之下，將磁鐵環(huán)II套在上圓柱上； ② 將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室放置在底板上表面，且使上圓柱位于真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的 室內(nèi)，用密封圈II將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的底端口與底板的上表面密封連接； ③ 從真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的頂端口將支架的四條支腿放置在磁鐵環(huán)II的上表面上，在 支架的支承板上放置盛有步驟B制備的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液的滲透液盛放容 器； ④ 當(dāng)步驟A種植在培養(yǎng)缽里的水稻處于開花前時，將培養(yǎng)缽內(nèi)的水浙干并用紗布或泡 沫把培養(yǎng)缽內(nèi)的土進(jìn)行阻隔，使倒置培養(yǎng)缽時缽內(nèi)的土不下掉，然后連同水稻一起將培養(yǎng) 缽倒置在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的環(huán)狀承接臺上，使活體水稻植株稻穗自然下垂，然后將蓋 板蓋在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的頂端口并通過密封圈I將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的頂端口與 蓋板密封連接； ⑤關(guān)閉空氣通氣管上的閥門，將真空泵的真空管與真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室壁上的真空抽 氣接管連接，打開真空泵開關(guān)，減壓抽真空，維持0.05 MPa壓力，保持真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化 室為該真空狀態(tài)，然后再將磁鐵環(huán)I套在下圓柱上且使磁鐵環(huán)I與磁鐵環(huán)II相鄰的磁極為 同極（即磁鐵環(huán)I 3上表面的磁極與磁鐵環(huán)II 6下表面的磁極相同)，手動向上推動下圓柱 上的磁鐵環(huán)I，由于上圓柱上的磁鐵環(huán)II與磁鐵環(huán)I相鄰兩磁極為同極，根據(jù)同極相斥的 原理，上圓柱上的磁鐵環(huán)II會隨之向上移動，從而推動置于支架上的滲透液盛放容器也隨 之向上升，當(dāng)滲透液盛放容器隨之上升到使倒置的活體水稻稻穗完全浸泡在滲透液盛放容 器內(nèi)的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液中時，停止向上推磁鐵環(huán)I，且手托住磁鐵環(huán)I不 動并維持磁鐵環(huán)I處于使倒置的活體水稻稻穗完全浸泡在滲透液盛放容器內(nèi)的含目的基 因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液中的位置，此時立即開始計時，當(dāng)活體水稻植株在滲透液盛放容器 內(nèi)浸泡達(dá)到預(yù)定滲透遺傳轉(zhuǎn)化時間后，取下磁鐵環(huán)I，磁鐵環(huán)II隨之向下滑落至底板上，滲 透液盛放容器及支架也隨之向下降落，水稻植株與滲透液盛放容器內(nèi)的含目的基因的農(nóng)桿 菌滲透液分離，培養(yǎng)缽內(nèi)水稻植株的滲透遺傳轉(zhuǎn)化即完成；此時關(guān)閉真空泵開關(guān)，然后緩慢 打開閥門，待真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室室內(nèi)恢復(fù)常壓狀態(tài)，打開蓋板，再從真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室 的頂口將培養(yǎng)缽連同水稻一起取出； 所述的一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置設(shè)有支承桌、底板、磁鐵環(huán)I、磁鐵環(huán)II、下圓 柱、上圓柱、真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室、支架、滲透液盛放容器，密封圈I，密封圈II部件，具體結(jié) 構(gòu)是： 真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的結(jié)構(gòu)：真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室為中空的圓柱形，且真空滲透遺傳 轉(zhuǎn)化室的頂端和底端均為敞口，在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的頂端口蓋有蓋板，真空滲透遺傳 轉(zhuǎn)化室室內(nèi)上部的內(nèi)壁固定連接有環(huán)狀承接臺，在位于環(huán)狀承接臺之上的室壁上分別設(shè)置 有空氣通氣管和真空抽氣接管，空氣通氣管上設(shè)置有閥門； 支架的結(jié)構(gòu)：支架由四條堅直的支腿和支承板組成，四條堅直的支腿的頂端分別與支 承板的下表面固定連接； 總體結(jié)構(gòu)： 在支承桌的桌面中部設(shè)置有通孔，支承桌的桌面上放置有底板，底板的下表面中部垂 直固定連接有下圓柱，下圓柱上間隙套有磁鐵環(huán)I，通孔的直徑D大于磁鐵環(huán)I的外徑K， D > K，下圓柱和磁鐵環(huán)I均穿過通孔位于支承桌桌面之下，在底板上表面中部且在與下圓 柱對應(yīng)的位置垂直固定連接有上圓柱，上圓柱上間隙套有磁鐵環(huán)II，磁鐵環(huán)I與磁鐵環(huán)II 相鄰的磁極為同極；真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室放置在底板的上表面中部，且上圓柱及其套有磁 鐵環(huán)II位于真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的室內(nèi)；支架的四條支腿放置在磁鐵環(huán)II的上表面上，在 支架的支承板上放置有滲透液盛放容器，滲透液盛放容器位于真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室室內(nèi)的 環(huán)狀承接臺的下方；支腿的長度Η與磁鐵環(huán)II的厚度N之和大于上圓柱的柱高L，H+N> L ;磁鐵環(huán)II位于上圓柱最低處時，滲透液盛放容器口與環(huán)狀承接臺下表面之間的距離R為 80cm?120cm ;真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的底端口通過密封圈II與底板的上表面密封連接，真 空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的頂端口通過密封圈I與蓋板密封連接。
[0007] 上述真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室內(nèi)壁連接的環(huán)狀承接臺的環(huán)孔孔徑Μ尺寸以能使倒置 在環(huán)狀承接臺上的培養(yǎng)缽不從環(huán)狀承接臺的環(huán)孔中掉落為準(zhǔn)。Μ可以為18?23cm。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)中待轉(zhuǎn)化植株的真空滲透轉(zhuǎn)化雖然是在真空干燥器內(nèi)進(jìn)行，但是在待轉(zhuǎn) 化植株剛開始浸泡在容器內(nèi)的滲透液中時，真空干燥器內(nèi)還為常壓狀態(tài)，當(dāng)待轉(zhuǎn)化植株完 全浸泡在容器內(nèi)的滲透液中后，才能用真空泵抽真空使真空干燥器為真空狀態(tài)，因此，現(xiàn)有 技術(shù)雖然是在真空干燥器內(nèi)對待轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，浸泡于滲透液內(nèi)進(jìn)行滲 透遺傳轉(zhuǎn)化的植株實際是部分時間在常壓下，部分時間在真空狀態(tài)下，并沒有真正在真空 狀態(tài)下對待轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行滲透遺傳轉(zhuǎn)化。
[0009] 本發(fā)明方法中所述的一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置的工作原理是： 本發(fā)明是在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室處于真空狀態(tài)后，利用磁鐵同極相斥的原理，通過操 控室外的磁鐵帶動室內(nèi)磁鐵按預(yù)定軌跡運動（上升)，達(dá)到在真正的真空狀態(tài)下對水稻進(jìn)行 滲透遺傳轉(zhuǎn)化的目的。本發(fā)明在底板上不穿孔，通過設(shè)置在底板上表面的上圓柱上的磁鐵 環(huán)II和在底板下表面的下圓柱上的磁鐵環(huán)I相鄰兩磁極為同極，利用磁鐵同極相斥的原 理，當(dāng)向上推動底板下面的磁鐵環(huán)I時，在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室內(nèi)的上圓柱上的磁鐵環(huán)II 上也隨之上移，從而真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室內(nèi)的滲透液盛放容器也隨之上升至能使活體水稻 植株稻穗完全浸泡在滲透液盛放容器內(nèi)的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透遺傳轉(zhuǎn)化液中的位置 為止并托住磁鐵環(huán)I不動維持磁鐵環(huán)I所處位置，待真空處理完畢后進(jìn)行后續(xù)操作。本發(fā) 明在底板上不穿孔，真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室頂部端口和底部端口又均分別通過密封圈I、密 封圈II密封，并關(guān)閉關(guān)閉空氣通氣管上的閥門11，然后抽真空，使真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室在活 體水稻植株還沒有與含目的基因的農(nóng)桿菌滲透遺傳轉(zhuǎn)化液接觸時，真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室就 已處于真空狀態(tài)，使活體水稻植株從一開始與含目的基因的農(nóng)桿菌滲透遺傳轉(zhuǎn)化液接觸時 就是在真空狀態(tài)下接觸，實現(xiàn)了真正的真空狀態(tài)下的水稻滲透遺傳轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)了農(nóng)桿菌對 植株的侵染力，因此，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果： 1、本發(fā)明裝置能夠使待轉(zhuǎn)化植株一開始接觸滲透遺傳轉(zhuǎn)化液進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時就在真 空狀態(tài)下進(jìn)行，真正實現(xiàn)了在真空狀態(tài)下對水稻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化（即待轉(zhuǎn)化植株從滲透遺傳 轉(zhuǎn)化一開始至結(jié)束整個過程都是在真空狀態(tài)下進(jìn)行的)，增強(qiáng)了農(nóng)桿菌對植株的侵染力?？?服了現(xiàn)有技術(shù)在植株浸泡在容器內(nèi)的滲透遺傳轉(zhuǎn)化液內(nèi)后，才抽空氣，浸泡于滲透液內(nèi)進(jìn) 行滲透遺傳轉(zhuǎn)化的植株實際是部分時間在常壓下，部分時間在真空狀態(tài)下，并沒有真正實 現(xiàn)真空滲透轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌對植株的侵染力降低，轉(zhuǎn)化效率也隨之降低的缺陷。
[0010] 2、本發(fā)明實現(xiàn)了水稻的原位真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，且不損傷水稻植株。本發(fā)明裝置 中環(huán)狀承接臺的設(shè)置可使連同培養(yǎng)缽一起的原位條件下的水稻植株便捷地倒置在真空滲 透遺傳轉(zhuǎn)化室的環(huán)狀承接臺上，使活體水稻植株稻穗自然下垂且不受損傷。
[0011] 3、本發(fā)明所用裝置設(shè)計巧妙，各部件結(jié)構(gòu)合理，連接簡便。真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室 內(nèi)的環(huán)狀承接臺可承接較重的倒置的培養(yǎng)缽、實現(xiàn)了較大個體植物的活體原位滲透遺傳轉(zhuǎn) 化，并且植株不會被壓斷或折斷。本發(fā)明所用裝置不受作物個體大小的限制，不僅適用于芥 菜、白菜、菜薹、甘藍(lán)型油菜、蘿卜、煙草等個體較小作物，水稻、花卉、棉花、麥類等個體較大 作物同樣適用。
[0012] 4、本發(fā)明方法及所用裝置操作簡便，大大提高了工作效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0014] 圖2是本發(fā)明裝置的主示圖。
[0015] 圖3是圖2中A- A剖視圖。
[0016] 圖4是真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017] 圖5是底板的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018] 圖6是支承桌的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019] 圖7是真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室與底板連接的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020] 圖8是底板、上圓柱、磁鐵環(huán)II連接的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021] 圖9是底板、上圓柱、磁鐵環(huán)II、下圓柱、磁鐵環(huán)I連接的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022] 圖10是支架的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023] 圖11是滲透液盛放容器、支架、上圓柱、磁鐵環(huán)II、底板、下圓柱、磁鐵環(huán)I連接的 結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 圖12是本發(fā)明裝置使用狀態(tài)示意圖。所述使用狀態(tài)是指將種植有水稻的培養(yǎng)缽 倒置在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室內(nèi)的環(huán)狀承接臺上時的狀態(tài)。
[0025] 圖13是圖3中磁鐵環(huán)II上升至最高位置時的結(jié)構(gòu)示意圖。所述磁鐵環(huán)II上升至 最高位置時是指向上推動磁鐵環(huán)I使磁鐵環(huán)II隨之上升至不能再向上升的位置。
[0026] 圖14是現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行植物真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化使用的真空干燥器示意圖。
[0027] 圖中各標(biāo)記依次表不：1 一支承桌，2-下圓柱，3-磁鐵環(huán)I，4一底板，5-上圓柱， 6-磁鐵環(huán)II，7-真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室，8-支架，9一滲透液盛放容器，10-空氣通氣管， 11 -閥門，12-蓋板，13-密封圈I，14一真空抽氣接管，15-環(huán)狀承接臺，16-密封圈II， 17一支腿，18-支承板，19一通孔，20-培養(yǎng)鉢，D是通孔的直徑，K是磁鐵環(huán)I的外徑，Η是 支腿的長度，Ν是磁鐵環(huán)II的厚度，L是上圓柱的柱高，R是磁鐵環(huán)II位于上圓柱最低處時 (即磁鐵環(huán)II在底板上時）滲透液盛放容器口與環(huán)狀承接臺下表面之間的距離，Q是環(huán)狀承 接臺下表面至底板上表面之間的距離，Ε是磁鐵環(huán)II上升到最高位置時，滲透液盛放容器口 至底板上表面之間的距離(所述磁鐵環(huán)II上升至最高位置時是指向上推動磁鐵環(huán)I使磁鐵 環(huán)II隨之上升至不能再向上升的位置)，Μ是環(huán)狀承接臺的環(huán)孔孔徑。

【具體實施方式】
[0028] 以下實施例無特殊說明的為常規(guī)方法。
[0029] 實施例1 參見圖1 一圖13,本發(fā)明所提供的一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法用一種水 稻真空滲透轉(zhuǎn)化裝置對水稻進(jìn)行真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，包括以下步驟： Α.培養(yǎng)待轉(zhuǎn)化的水稻受體植株：根據(jù)遺傳轉(zhuǎn)化計劃，提前在溫室內(nèi)將待轉(zhuǎn)化水稻植株 種植在培養(yǎng)缽20內(nèi)；選擇的培養(yǎng)缽20大小以培養(yǎng)缽20倒置在所述的一種水稻真空滲透轉(zhuǎn) 化裝置中的真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的環(huán)狀承接臺15上不會從環(huán)狀承接臺15的環(huán)孔中掉落 為準(zhǔn)； Β.制備含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液：將構(gòu)建好的Bar基因作為篩選標(biāo)記的含目 的基因的待轉(zhuǎn)化載體用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中；將保存的農(nóng)桿菌菌液接種于含相 應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，于28°C、200r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 7,離心收集菌 體，菌體用滲透培養(yǎng)液重懸調(diào)節(jié)OD600至0. 6作為含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液備用，所 述的滲透培養(yǎng)液為1/2MS液體培養(yǎng)基+ As 19. 6mg/L + 200ul/L Silwet L-77+蔗糖50g/ L, pH5. 8 ； C.真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化： ① 將固定連接有上圓柱5和下圓柱2的底板4放置在支承桌1上，使下圓柱2穿過支 承桌1上的通孔19并位于支承桌1的桌面之下，將磁鐵環(huán)II 6套在上圓柱5上； ② 將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7放置在底板4上表面，且使上圓柱5位于真空滲透遺傳轉(zhuǎn) 化室7的室內(nèi)，用密封圈II將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的底端口與底板的上表面密封連接； ③ 從真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的頂端口將支架8的四條支腿17放置在磁鐵環(huán)II 6的上 表面上，在支架8的支承板18上放置盛有步驟B制備的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液的 滲透液盛放容器9 ; ④ 當(dāng)步驟A種植在培養(yǎng)缽里的水稻處于開花前時，將培養(yǎng)缽內(nèi)的水浙干并用紗布或泡 沫把培養(yǎng)缽內(nèi)的土進(jìn)行阻隔，然后連同水稻一起將培養(yǎng)缽倒置在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的 環(huán)狀承接臺15上，使活體水稻植株稻穗自然下垂，然后將蓋板12蓋在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室 7的頂端口并通過密封圈I 13將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的頂端口與蓋板12密封連接； ⑤ 關(guān)閉空氣通氣管10上的閥門11，將真空泵的真空管與真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7壁上的 真空抽氣接管14連接，打開真空泵開關(guān)，減壓抽真空，維持0.05 MPa壓力，保持真空滲透 遺傳轉(zhuǎn)化室7為該真空狀態(tài)，然后再將磁鐵環(huán)I 3套在下圓柱2上且使磁鐵環(huán)I 3與磁鐵 環(huán)II 6相鄰的磁極為同極（即磁鐵環(huán)I 3上面的磁極與磁鐵環(huán)II 6下面的磁極相同)，手動向 上推動下圓柱2上的磁鐵環(huán)I 3,由于上圓柱5上的磁鐵環(huán)II 6與磁鐵環(huán)I 3相鄰兩磁極為 同極，根據(jù)同極相斥的原理，上圓柱5上的磁鐵環(huán)II 6會隨之向上移動，從而推動置于支架8 上的滲透液盛放容器9也隨之向上升，當(dāng)滲透液盛放容器9上升到使倒置的活體水稻稻穗 完全浸泡在滲透液盛放容器9內(nèi)的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液中時，停止向上推磁鐵 環(huán)I 3,且手托住磁鐵環(huán)I 3不動并維持磁鐵環(huán)I 3處于使倒置的活體水稻稻穗完全浸泡在 滲透液盛放容器9內(nèi)的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液中的位置，此時立即開始計時，當(dāng) 活體水稻植株在滲透液盛放容器9內(nèi)浸泡達(dá)到預(yù)定滲透遺傳轉(zhuǎn)化時間后，取下磁鐵環(huán)I 3， 磁鐵環(huán)II 6隨之向下滑落至底板4上，滲透液盛放容器9及支架8也隨之向下降落，水稻植 株與滲透液盛放容器9內(nèi)的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透液分離，培養(yǎng)缽內(nèi)水稻植株的滲透遺 傳轉(zhuǎn)化即完成；此時立即關(guān)閉真空泵開關(guān)，然后緩慢打開閥門11，待真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7 室內(nèi)恢復(fù)常壓狀態(tài)后，打開蓋板12,再從真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的頂端口將培養(yǎng)缽20連同 水稻一起取出。
[0030] 取出培養(yǎng)缽20后，進(jìn)行水稻植株滲透遺傳轉(zhuǎn)化完成后的后續(xù)工作，如將培養(yǎng)缽內(nèi) 的水稻植株全部覆蓋上塑料膜保濕24小時后，將其培養(yǎng)缽置于溫室內(nèi)，按常規(guī)栽培方法培 育植株至成熟，收獲種子即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，獲得轉(zhuǎn)化子。
[0031] 參見圖1 一圖13,本發(fā)明所述的一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置設(shè)有支承桌1、底 板4、磁鐵環(huán)I 3、磁鐵環(huán)II 6、下圓柱2、上圓柱5、真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7、支架8、滲透液盛 放容器9,密封圈I 13,密封圈II 16部件，具體結(jié)構(gòu)是： A.真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的結(jié)構(gòu)：真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7為中空的圓柱形，且真空滲 透遺傳轉(zhuǎn)化室7的頂端和底端均為敞口，在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的頂端口蓋有蓋板12， 真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的頂端口全部與蓋板12的下表面接觸，真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7室內(nèi) 上部的內(nèi)壁固定連接有環(huán)狀承接臺15,環(huán)狀承接臺15的環(huán)孔孔徑Μ的尺寸以能使倒置在 環(huán)狀承接臺15上的水稻培養(yǎng)缽20不從環(huán)狀承接臺15的環(huán)孔中掉落為準(zhǔn)。環(huán)狀承接臺15 的的環(huán)孔孔徑Μ可為18?23cm，通常培育水稻的培養(yǎng)缽的內(nèi)徑為21cm?25cm，因此，倒置 在環(huán)狀承接臺15的培養(yǎng)缽不會從環(huán)狀承接臺15的環(huán)孔中漏下，可以達(dá)到試驗?zāi)康摹Ｔ谖?于環(huán)狀承接臺15之上的室壁上分別設(shè)置有空氣通氣管10和真空抽氣接管14,空氣通氣管 10上設(shè)置有閥門11 ; B. 支架8的結(jié)構(gòu)：支架8由四條堅直的支腿17和支承板18組成，四條堅直的支腿17 的頂端均分別與支承板18的下表面固定連接； C. 總體結(jié)構(gòu)： 在支承桌1的桌面中部設(shè)置有通孔19,支承桌1的桌面上放置有底板4,底板4將支承 桌1的桌面全部覆蓋，底板4的下表面中部垂直固定連接有下圓柱2,下圓柱2上間隙套有 磁鐵環(huán)I 3 (即套在下圓柱2上的磁鐵環(huán)I 3與下圓柱2間隙配合)，通孔19的直徑D大 于磁鐵環(huán)I 3的外徑K，D>K，下圓柱2和磁鐵環(huán)I 3均穿過通孔19位于支承桌1桌面之 下，在底板4上表面中部且在與下圓柱2對應(yīng)的位置垂直固定連接有上圓柱5 (即上圓柱5 的中心線與下圓柱2的中心線重合)，上圓柱5上間隙套有磁鐵環(huán)II 6 (即套在上圓柱5上 的磁鐵環(huán)II 6與上圓柱5間隙配合)，磁鐵環(huán)I 3與磁鐵環(huán)II 6相鄰的磁極為同極（即磁鐵 環(huán)I 3上表面的磁極與磁鐵環(huán)II 6下表面的磁極相同);真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7放置在底板 4的上表面中部，真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7底端口全部與底板4的上表面接觸，且上圓柱5及 其套有磁鐵環(huán)II 6位于真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的室內(nèi)；支架8的四條支腿17放置在磁鐵環(huán) II 6的上表面上，在支架8的支承板18上放置有滲透液盛放容器9,支架8和滲透液盛放容 器9均位于位于在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的室內(nèi)，滲透液盛放容器9位于真空滲透遺傳轉(zhuǎn) 化室7內(nèi)的環(huán)狀承接臺15的下方；支腿17的長度Η與磁鐵環(huán)II 6的厚度N之和大于上圓 柱5的柱高L，H+N > L ;磁鐵環(huán)II 6位于上圓柱5最低處時（即磁鐵環(huán)II 6在底板4的上表 面)，滲透液盛放容器9 口與環(huán)狀承接臺15下表面之間的距離R為80cm?120cm ;80cm? 120cm是通常適宜進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化的水稻全植株高，此R值可滿足常規(guī)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化 的需求，使真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7內(nèi)還未處于真空狀態(tài)時(還未進(jìn)行抽真空操作)，倒置的活 體水稻植株稻穗與滲透液盛放容器9內(nèi)含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液不接觸。R尺寸還 可根據(jù)待轉(zhuǎn)化植株的株高進(jìn)行調(diào)整，其目的是使真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7內(nèi)還未處于真空狀 態(tài)時，倒置的活體植株與含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液不接觸。真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7 的底端口通過密封圈II 16與底板4的上表面密封連接，以使真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的底端 口密封不漏氣，真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的頂端口通過密封圈I 13與蓋板12密封連接，以使 真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7的頂端口密封不漏氣，使整個真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室7達(dá)到密封狀態(tài)。
【權(quán)利要求】
1. 一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法用一種水稻真空滲透轉(zhuǎn)化裝置對水稻進(jìn)行 真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，包括以下步驟： A. 培養(yǎng)待轉(zhuǎn)化的水稻受體植株：根據(jù)遺傳轉(zhuǎn)化計劃，提前在溫室內(nèi)將待轉(zhuǎn)化水稻植株 種植在培養(yǎng)缽20內(nèi)； B. 制備含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液：將構(gòu)建好的Bar基因作為篩選標(biāo)記的含目 的基因的待轉(zhuǎn)化載體用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中；將保存的農(nóng)桿菌菌液接種于含相 應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，于28°C、200r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 7?0. 9,離心收 集菌體，菌體用滲透培養(yǎng)液重懸調(diào)節(jié)0D600至0. 6-0. 8作為含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化 液備用，所述的滲透培養(yǎng)液為1/2MS液體培養(yǎng)基+ As 19. 6mg/L + 200ul/L Silwet L-77+ 鹿糖 50g/L，ρΗ5· 8 ; C. 真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化： ① 將固定連接有上圓柱（5)和下圓柱（2)的底板（4)放置在支承桌（1)上，使下圓柱 (2)穿過支承桌（1)上的通孔（19)并位于支承桌（1)的桌面之下，將磁鐵環(huán)II (6)套在上圓 柱（5)上； ② 將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)放置在底板（4)上表面，且使上圓柱（5)位于真空滲透遺 傳轉(zhuǎn)化室（7)的室內(nèi)，用密封圈II將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的底端口與底板的上表面密 封連接； ③ 從真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的頂端口將支架（8)的四條支腿（17)放置在磁鐵環(huán)II (6)的上表面上，在支架（8)的支承板（18)上放置盛有步驟B制備的含目的基因的農(nóng)桿菌 滲透轉(zhuǎn)化液的滲透液盛放容器（9); ④ 當(dāng)步驟A種植在培養(yǎng)缽里的水稻處于開花前時，將培養(yǎng)缽內(nèi)的水浙干并用紗布或泡 沫把培養(yǎng)缽內(nèi)的土進(jìn)行阻隔，然后連同水稻一起將培養(yǎng)缽倒置在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7) 的環(huán)狀承接臺（15)上，使活體水稻植株稻穗自然下垂，然后將蓋板（12)蓋在真空滲透遺傳 轉(zhuǎn)化室（7)的頂端口并通過密封圈I (13)將真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的頂端口與蓋板（12) 密封連接； ⑤ 關(guān)閉空氣通氣管（10)上的閥門（11)，將真空泵的真空管與真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7) 壁上的真空抽氣接管（14)連接，打開真空泵開關(guān)，減壓抽真空，維持0.05 MPa壓力，保持 真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)為該真空狀態(tài)，然后再將磁鐵環(huán)I (3)套在下圓柱（2)上且使磁鐵 環(huán)I (3)與磁鐵環(huán)II (6)相鄰的磁極為同極，手動向上推動下圓柱（2)上的磁鐵環(huán)I (3)， 當(dāng)滲透液盛放容器（9)隨之上升到使倒置的活體水稻稻穗完全浸泡在滲透液盛放容器（9) 內(nèi)的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液中時，停止向上推磁鐵環(huán)I 3,且手托住磁鐵環(huán)I (3) 不動并維持磁鐵環(huán)I (3)處于使倒置的活體水稻稻穗完全浸泡在滲透液盛放容器9內(nèi)的 含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液中的位置，此時立即開始計時，當(dāng)活體水稻植株在滲透液 盛放容器9內(nèi)浸泡達(dá)到預(yù)定滲透遺傳轉(zhuǎn)化時間后，取下磁鐵環(huán)I (3)，磁鐵環(huán)II (6)隨之向 下滑落至底板（4)上，滲透液盛放容器（9)及支架（8)也隨之向下降落，水稻植株與滲透液 盛放容器9內(nèi)的含目的基因的農(nóng)桿菌滲透液分離，培養(yǎng)缽內(nèi)水稻植株的滲透遺傳轉(zhuǎn)化即完 成；此時關(guān)閉真空泵開關(guān)，然后緩慢打開閥門（11)，待真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)室內(nèi)恢復(fù)常 壓狀態(tài)后，打開蓋板（12)，再從真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的頂端口將培養(yǎng)缽20連同水稻一 起取出； 所述的一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置，其特征在于：該裝置設(shè)有支承桌（1)、底板 (4)、磁鐵環(huán)I (3)、磁鐵環(huán)II (6)、下圓柱（2)、上圓柱（5)、真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)、支架 (8)、滲透液盛放容器（9)，密封圈I (13)，密封圈II (16)部件，具體結(jié)構(gòu)是： 真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的結(jié)構(gòu)：真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)為中空的圓柱形，且真空滲 透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的頂端和底端均為敞口，在真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的頂端口蓋有蓋板 (12)，真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)室內(nèi)上部的內(nèi)壁固定連接有環(huán)狀承接臺（15)，在位于環(huán)狀 承接臺（15)之上的室壁上分別設(shè)置有空氣通氣管（10)和真空抽氣接管（14)，空氣通氣管 (10)上設(shè)置有閥門（11); 支架（8)的結(jié)構(gòu)：支架（8)由四條堅直的支腿（17)和支承板（18)組成，在四條堅直的 支腿（17)的頂端分別與支承板（18)的下表面固定連接； 總體結(jié)構(gòu)： 在支承桌（1)的桌面中部設(shè)置有通孔（19)，支承桌（1)的桌面上放置有底板（4)，底板 (4)的下表面中部垂直固定連接有下圓柱（2)，下圓柱（2)上間隙套有磁鐵環(huán)I (3)，通孔 (19)的直徑D大于磁鐵環(huán)I (3)的外徑K，D > K，下圓柱（2)和磁鐵環(huán)I (3)均穿過通孔 (19)位于支承桌（1)桌面之下，在底板（4)上表面中部且在與下圓柱（2)對應(yīng)的位置垂直 固定連接有上圓柱（5)，上圓柱（5)上間隙套有磁鐵環(huán)II (6)，磁鐵環(huán)I (3)與磁鐵環(huán)II (6) 相鄰的磁極為同極；真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)放置在底板（4)的上表面中部，且上圓柱（5) 及其套有磁鐵環(huán)II (6)位于真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的室內(nèi)；支架（8)的四條支腿（17)放 置在磁鐵環(huán)II (6)的上表面上，在支架（8)的支承板（18)上放置有滲透液盛放容器（9)，滲 透液盛放容器（9)位于真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)室內(nèi)的環(huán)狀承接臺（15)的下方；支腿（17) 的長度Η與磁鐵環(huán)II (6)的厚度N之和大于上圓柱（5)的柱高L，H+N> L ;磁鐵環(huán)II (6)位 于上圓柱（5)最低處時，滲透液盛放容器（9) 口與環(huán)狀承接臺（15)下表面之間的距離R為 80cm?120cm;真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的底端口通過密封圈II (16)與底板（4)的上表面 密封連接，真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化室（7)的頂端口通過密封圈I (13)與蓋板（12)密封連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：真空滲透遺傳轉(zhuǎn) 化室（7)室內(nèi)壁連接的環(huán)狀承接臺（15)的環(huán)孔孔徑Μ為18?23cm。
【文檔編號】C12N15/84GK104195170SQ201410469053
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】鐘巧芳, 程在全, 李定琴, 李維蛟, 余騰瓊, 殷富有, 肖素勤, 王玲仙, 張敦宇, 柯學(xué), 陳玲, 陳越, 付堅, 蔣聰, 李娥賢, 羅紅梅, 蔣春苗, 王波, 曾民, 黃興奇 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所