一種包含表達(dá)功能性重組人凝血因子Ⅶ載體的宿主細(xì)胞及其高水平表達(dá)方法
【專(zhuān)利摘要】一種包含表達(dá)功能性重組人凝血因子Ⅶ載體的宿主細(xì)胞及其高水平表達(dá)方法，目的是構(gòu)建含F(xiàn)Ⅶ、GGCX及VKORC1重組核酸的表達(dá)載體，利用GGCX及VKORC1的協(xié)同表達(dá)提高重組FⅦ的g-羧基化修飾；本發(fā)明宿主細(xì)胞包含編碼維生素K依賴(lài)的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重組核酸、小鼠維生素K還原酶復(fù)合體亞基1（VKORC1）重組核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重組核酸，以及絕緣子insulator（4X）重組核酸；高水平表達(dá)功能性人凝血因子Ⅶ的方法包括構(gòu)建一種表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體法將該表達(dá)載體介導(dǎo)進(jìn)入DHFR缺陷型CHO動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，DMEM培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克?。粺o(wú)血清馴化培養(yǎng)該宿主細(xì)胞株；利用鎳離子親和層析純化hFⅦ重組蛋白，SDS-PAGE及Westernblot檢測(cè)；凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定FⅦ重組蛋白促凝血活性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種包含表達(dá)功能性重組人凝血因子VII載體的宿主細(xì)胞及 其高水平表達(dá)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及包含一種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包 含：編碼維生素K依賴(lài)的人凝血因子W (F W)重組核酸、小鼠維生素K還原酶復(fù)合體亞基1 (VKORCl)重組核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX)重組核酸，以及絕緣子insulator (4X)重 組核酸。其中小鼠維生素K還原酶復(fù)合體亞基I (VKORCl)和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX)， 及人凝血因子W(FW)在所述的宿主細(xì)胞中均獲得穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明同時(shí)還涉及一種可高 水平表達(dá)功能性人凝血因子W的方法，該宿主細(xì)胞在特定條件和規(guī)模下培養(yǎng)可顯著提高功 能性人凝血因子W的產(chǎn)率。

【背景技術(shù)】
[0002] 凝血因子VH (coagulation factor VH，F(xiàn) VH )是一種維生素K依賴(lài)的單鏈糖蛋 白，主要由肝臟合成，是凝血塊形成起始的關(guān)鍵分子之一，在凝血過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的 作用。F VH主要通過(guò)與組織因子（tissue facter, TF)結(jié)合，形成TF-F VH復(fù)合物，從而啟動(dòng) 外源凝血途徑，并對(duì)內(nèi)源性凝血途徑具有特殊的調(diào)控作用。人F W在血漿中主要以酶原形 式存在，當(dāng)F W的Arg152-Ile153之間的肽鏈裂解后，由單鏈形式轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式，形成活性 F W a。F W a由含153個(gè)氨基酸、分子量為20 kDa的輕鏈，含254個(gè)氨基酸、分子量為30 kDa的重鏈，通過(guò)原135位和262位氨基酸之間形成的二硫鍵連接。臨床研究表明，F(xiàn) W對(duì) 血小板減少癥和血小板功能障礙、嚴(yán)重創(chuàng)傷、大面積外科手術(shù)的止血具有令人滿(mǎn)意的治療 效果。而目前藥用FW的主要來(lái)源為血漿提取，但血漿中FW含量很低，僅有200-400 mg/ ml，難以滿(mǎn)足臨床需要；同時(shí)血漿提取制備工藝復(fù)雜，批間差異較大、穩(wěn)定性較差；而且以 血漿作為原料，大大增加了外源病毒的感染風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 血漿提取制備F VL由于含量有限、工藝復(fù)雜、感染風(fēng)險(xiǎn)等原因而受到限制，基因 重組制備F W成為開(kāi)發(fā)和研究的重點(diǎn)，而基因工程技術(shù)的發(fā)展也為F W的體外重組制備提 供了可能。F W的凝血活性功能需要復(fù)雜的翻譯后加工，包括谷氨酸的g_羧基化、天冬氨 酸的0 -羥基化、N-糖基化、0-糖基化等，因此必須利用具有復(fù)雜的蛋白后加工的真核表 達(dá)系統(tǒng)來(lái)完成。目前已有包括酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的多種FW重組制 備策略被公開(kāi)（參見(jiàn)CN101376875A, CN102321668A, CN101906438A)，在一定程度上實(shí)現(xiàn) 了 F W的重組表達(dá)。然而其中具有g(shù)_羧基谷氨酸區(qū)修飾的功能性重組蛋白卻含量甚少，成 為阻礙其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的瓶頸。g_羧基谷氨酸區(qū)（也稱(chēng)"Gla"區(qū)）的翻譯后修飾，是F W 保持凝血活性的關(guān)鍵。而Gla修飾，是g氨基酸羧化酶（GGCX)在還原型維生素K輔酶作 用下的結(jié)果（de Visser MC, Roshani S, Rutten JW, van Hylckama Vlieg A, Vos HL， Rosendaal FR, Reitsma PH., 2011. Haplotypes of VK0RC1, NQOl and GGCXj their effect on activity levels of vitamin K-dependent coagulation factors, and the risk of venous thrombosis. Thromb Haemost. 106(3) :563-565.)。在Gla修飾中，還原型 維生素K被GGCX氧化形成維生素K環(huán)氧化物，然后維生素K環(huán)氧化物又被還原酶復(fù)合體亞 基I (VKORCl)再循環(huán)為還原型維生素K參與羧基化修飾。因此，GGCX和VKORCl是F W進(jìn) 行谷氨酸g_羧基化、保證凝血活性的關(guān)鍵酶蛋白。然而研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)基中外源維生 素1(的添加，無(wú)法提高？￥11的表達(dá)水平（參見(jiàn)0附0112432(^)疋￥11與￥1(010的共表達(dá)對(duì)其 表達(dá)水平的提高也貢獻(xiàn)有限(參見(jiàn)CN101124320A);且與GGCX的協(xié)同表達(dá)，也難以實(shí)現(xiàn)功能 性F W的有效釋放(參見(jiàn)CN101124320A)。因此，VKORCl作用下還原型維生素K的供應(yīng)形 式，是該反應(yīng)的限速步驟；GGCX和VKORCl的協(xié)同作用是活性F W穩(wěn)定高水平表達(dá)的關(guān)鍵。 已有報(bào)道通過(guò)F W、GGCX及VKORCl的共表達(dá)在一定程度上提升提高了功能性F W的表達(dá) 水平(參見(jiàn)CN101198696A)。然而由于不同啟動(dòng)子之間的啟動(dòng)強(qiáng)度差異，以及外源基因片段 過(guò)大，共表達(dá)基因之間的相互影響，導(dǎo)致功能性F W的整體生產(chǎn)率依然較低。絕緣體是一類(lèi) 獨(dú)特的染色質(zhì)調(diào)控元件，可通過(guò)阻止異染色質(zhì)擴(kuò)散，降低共表達(dá)單元相互影響，維持被保護(hù) 基因的持續(xù)表達(dá)，從而有效提高目的基因的表達(dá)水平(參見(jiàn)CN101285072A)。通過(guò)插入絕緣 子基因單元提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和合成水平，是目前活性蛋白質(zhì)制備的一種有效策略。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服上述已有技術(shù)的不足，通過(guò)基因重組技術(shù)，構(gòu)建含F(xiàn) W、GGCX 及VKORCl重組核酸的表達(dá)載體，利用GGCX及VKORCl的協(xié)同表達(dá)提高重組F W的g_羧基 化修飾，同時(shí)引入絕緣子insulator (4X)重組核酸，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和亞克隆篩選提供一 種包含表達(dá)功能性重組人凝血因子VH載體的宿主細(xì)胞；同時(shí)利用氨甲碟呤（amethopterin, MTX)梯度加壓篩選及金屬親和層析，提供一種可高水平表達(dá)功能性人凝血因子W的方法。
[0005] 本發(fā)明第一方面，提供了一種包含表達(dá)功能性重組人凝血因子W載體的宿主細(xì) 胞，其特征在于包含：編碼維生素K依賴(lài)的人凝血因子W (F W)重組核酸、小鼠維生素K還 原酶復(fù)合體亞基I (VKORCl)重組核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX)重組核酸，以及絕緣 子insulator (4X)重組核酸；其中F W、VKORCl和GGCX在宿主細(xì)胞中均獲得穩(wěn)定表達(dá)。
[0006] 其中，編碼維生素K依賴(lài)的F W重組核酸和二氫葉酸還原酶（DHFR)重組核酸通過(guò) 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)連接，利用CAG啟動(dòng)子（CMV early enhancericken beta actin promoter，由 AG promoter 和 hCMV-IE enhancer 組成)啟動(dòng)；編碼 VKORCl 重組核酸和 GGCX 重組核酸同樣通過(guò)IRES連接，CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)；且兩個(gè)啟動(dòng)子組成的重組核酸表達(dá)單元通 過(guò)絕緣子insulator (4X)重組核酸隔離。所述宿主細(xì)胞為DHFR缺陷型CHO哺乳細(xì)胞。
[0007] 所述的絕緣子insulator (4X)由經(jīng)部分改造的雞HS4絕緣體單元4倍串聯(lián)而成； 經(jīng)改造的雞HS4絕緣體重組核酸其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1;絕緣子insulator (4X)插 入位置為兩個(gè)啟動(dòng)子組成的重組核酸表達(dá)單元的下游； 所述編碼維生素K依賴(lài)的人凝血因子W(FVn)重組核酸其核苷酸序列為SEQ ID N0:2; 所述編碼小鼠維生素K還原酶復(fù)合體亞基I (VK0RC1)重組核酸其核苷酸序列為SEQ ID NO: 3 ;所述編碼小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX)重組核酸其核苷酸序列為SEQ ID NO:4 ; 所述表達(dá)功能性重組人凝血因子W載體從上游到下游依次包含以下表達(dá)元件： 1) 第一啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自 CAG promoter(CMV early enhancericken beta actin promoter)； 2) 人凝血因子W(F W) cDNA基因； 3) 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)，連接篩選基因二氫葉酸還原酶基因（DHFR)，利用同 一個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因F W和篩選基因DHFR的表達(dá)，有利于通過(guò)篩選基因的擴(kuò)增提 高目的基因的擴(kuò)增； 4) 篩選基因二氫葉酸還原酶基因（DHFR); 5) 第二啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子同樣選擇CAG promoter ; 6) 小鼠維生素K還原酶復(fù)合體亞基1基因（VKORCl); 7) 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)，連接VKORC1和GGCX基因，通過(guò)同一啟動(dòng)子 CAG promoter實(shí)現(xiàn)雙基因的協(xié)同表達(dá)； 8 )小鼠g氨基酸羧化酶基因（mGGCX ); 9)絕緣子insulator (4X)，降低外源基因之間的相互影響，提高活性F W的整體生產(chǎn) 率； 本發(fā)明還提供了一種可高水平表達(dá)功能性人凝血因子W的方法，所述方法包括： 1) 構(gòu)建一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體中F W重組核酸通過(guò)IRES與DHFR重組核酸連接，由 CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)共表達(dá)；同時(shí)含有CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)、由IRES連接VKORCl重組核酸和mGGCX 重組核酸組成的表達(dá)單元；兩個(gè)重組核酸表達(dá)單元由絕緣子insulator (4X)重組核酸隔 離； 2) 利用脂質(zhì)體法將1)所述表達(dá)載體介導(dǎo)進(jìn)入DHFR缺陷型CHO動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)DMEM 培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克??；利用有限稀釋法亞克隆穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；挑選高表達(dá)陽(yáng)性克隆擴(kuò)大 培養(yǎng)，氨甲喋呤（MTX)梯度加壓篩選，提高F vn表達(dá)水平； 3) 無(wú)血清馴化培養(yǎng)該宿主細(xì)胞株； 4) 利用鎳離子親和層析純化F VH重組蛋白，SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)； 5) 凝血酶原時(shí)間（PT)測(cè)定F W重組蛋白促凝血活性。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)F W、GGCX及VK0RC1的共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了 F W保持其 凝血活性關(guān)鍵的谷氨酸的g-羧基化修飾；在F W和DHFR基因單元、GGCX和VK0RC1基因 單元之間插入絕緣子insulatorUX)，避免了基因之間的相互影響，大大增加了基因表達(dá)的 協(xié)同性，提高了功能性F W的表達(dá)水平；利用DHFR系統(tǒng)，通過(guò)MTX加壓篩選，獲得高表達(dá)細(xì) 胞株。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為高效表達(dá)活性人凝血因子W的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖2為人凝血因 子W的SDS-PAGE分析結(jié)果；圖2中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量，1為重組人凝血因子W純化樣； 圖3為人凝血因子W的Wester Blot分析結(jié)果；圖3中，1、2、3、4為重組人凝血因子W純化 樣。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 實(shí)施例1 :功能性重組人凝血因子W表達(dá)載體Plnsulator4x-CAGGS-VKORC1-GGCX- FVII的構(gòu)建； (1)人凝血因子W (F W)、小鼠維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位I (VK0RC1)和 小鼠Y-谷氨酰基羧化酶（GGCX)基因克隆。
[0011] 分別取人胎肝組織、小鼠肝組織，利用TRIZ0LLS試劑盒提取制備總RNA，1%甲醛 變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性；以總RNA作為模版，采用Oligo (dT)為引物， 按照試劑盒使用說(shuō)明合成cDNA第一鏈；以各自逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模版，分別以設(shè)計(jì)合成的 FVII、GGCX和VKORC引物擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板10 ul、25mmol/L 10父卩0?811打6『5 111、25臟〇1/1]\%2+1.5 111、引物（10臟〇1/1)各2.5 111、7^'0嫩酶2.5 ul 和 10 mmol/L dNTP 5 ul，加 CldH2O 至 50 uKPCR 反應(yīng)條件：95 °C預(yù)變性 5 min，以 94°C 變性 30 s，55.5 °C (FVII)或 60.0 °C (GGCX)或 65.0 °C (VKORC)退火 50 s，70 °C延伸 1 min,再延伸10 min,共30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后4 °C保存待 用。
[0012] F W (Genbank:NM-019616. 3)、VK0RC1 (Genbank:NM-178600)和 GGCX(Genbank: NM-019802. 5)基因RT-PCR引物設(shè)計(jì)如下： GGCX-For : ACCGGTCCACCATGGCTGTGCACCGCGGCTC (Age I) GGCX-Rev: GGATCCTTAGAACTCAGAGTGAACATGCTCAG (Bam HI) VKORCl- For: GCGGCCGCCACCATGGGCACCACCTGGAGGAGC (Not I) VKORCl- Rev: CTCGAGTTAGTGCTTTTTGGTCTTGTGTTCTG (Xho I) FW-For: ATATGCGGCCGCCACCATGGTCTCCCAG (Not I) F W-Rev: CGCGCAATTGTTAGGGAAATGGGGCTC (Mun I) 將鑒定正確的PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒純化后與pGEM-T載體按照3 :1 (mol/mol) 的比例，在T4 DNA連接酶作用下16 °C過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化凡co/i DH5a感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn) 化液涂布于LB瓊脂平板上(含氨節(jié)青霉素0.1 mg/ml，IPTG 4 mmol/ml，X-gal 0.8 mg/L), 37 °C孵育過(guò)夜。挑取白色單菌搖菌，小量提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定（FW :1401 bp; VKORCl :504 bp; GGCX: 2291 bp)，對(duì)重組子進(jìn)行DNA測(cè)序分析（由上海生工生物工程有限公司完 成)。
[0013] (2) pCAGGS-IRES-AscI 載體構(gòu)建 從載體pCAGGS出發(fā)，進(jìn)行載體改造，引入IRES單元和AscI酶切位點(diǎn)。主要通過(guò)以下 方案實(shí)施完成： I) pCAGGS- AscI 載體構(gòu)建 根據(jù) pCAGGS 載體上酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì) Iinker-AscI-For:AGCTGGCGCGCC; Iinker-AscI-Rev: GATCGGCGCGCC，用PCR儀溫度95 °C逐漸降低褪火溫度，形成雙鏈linker。HindIII 和BamHI雙酶切pCAGGS，膠回收4280 bp酶切產(chǎn)物，其與雙鏈linker 4 °C過(guò)夜連接形成 pCAGGS-AscI。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到凡coBDH5a感受態(tài)細(xì)胞后，用LB/Amp+平板篩選出陽(yáng)性 克隆，挑取陽(yáng)性克隆菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取試 劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，XhoI和AscI雙酶切，目的片段為558 bp、3734 bp和HindIII、BamH I分別單酶切鑒定，pCAGGS- AscI載體不能被酶切。
[0014] 2) pCAGGS-linker-lst-AscI 載體構(gòu)建 根據(jù)構(gòu)建載體需要設(shè)計(jì) I inker: pCAGGS-1 inker-Fl: AAITCGATATCGGATCCACCGGTGC GGCCGCCGTCTCGAGCTTGAGCTCGGGA ;pCAGGS-linker-Rl: GATCTCCCGAGCTCAA GCTCGAGACGGCTAGCGCGGCCGCACCGGTGGATCCGATATCG，用 PCR 儀溫度 95 °C 逐漸降低褪火 溫度，形成雙鏈？04665-1丨111?51'1。88111和￡(3〇1?1雙酶切？04663-48(31，膠回收4291 6口酶 切產(chǎn)物，其與雙鏈pCAGGS-linker 4 °C過(guò)夜連接形成pCAGGS-linker-lst-AscI。再將連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到凡co/i DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，用LB/Amp+平板篩選出陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆 菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒， XbaI和SacI雙酶切鑒定，目的片段為150bp、4109 bp。
[0015] 3) pCAGGS-linker-2nd_AscI 載體構(gòu)建 根據(jù)構(gòu)建載體需要設(shè)計(jì) I inker: pCAGGS-1 inker-F2: CATCGATCCGGATGATCACAAITGC AGCTGCATGCTTCCCGGGAAA ;pCAGGS-linker-R2: GATCTTTCCCGGGAAGCATGCAGC TG CAAITGTGATCATCATCCGGATCGATGAGCT，用 PCR 儀溫度 95 °C 逐漸降低退火，形成 雙鏈pCAGGS-linker2。BgIII和SacI雙酶切載體2,膠回收4254 bp酶切產(chǎn)物，其與雙 鏈pCAGGS-linker2 4 °C過(guò)夜連接形成pCAGGS-linker-2nd-AscI。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 萬(wàn).co/i DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，用LB/Amp+平板篩選出陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，XbaI和SphI 雙酶切鑒定，目的片段為184 bp、4116 bp。
[0016] 4) pCAGGS-IRES-AscI 載體構(gòu)建 SphI和XmaI雙酶切pCAGGS-linker-2nd-AscI，膠回收4296 bp酶切產(chǎn)物，與同樣經(jīng) 雙酶切PlRES (購(gòu)于Clontech公司）的607 bp酶切產(chǎn)物室溫連接4-5 h，形成連接產(chǎn)物 pCAGGS-IRES- AscI。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到凡co/i DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，用LB/Amp+平板篩選出陽(yáng) 性克隆，挑取陽(yáng)性克隆菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，XmaI和SphI雙酶切鑒定，目的片段為607 bp、4296 bp。
[0017] (3) pCAGGS-IRES-DHFR-AscI 載體構(gòu)建 取I uL pSV2- DHFR質(zhì)粒（購(gòu)于中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心）為模板， 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，上游引物：DHFR-F :GTCACCCGGG CCACCATGGITCGACCAITGAAC，下游引物 DHFR-R:GGCCAGATCTTA GTCTTTCTTCTCGTAGACTT，反應(yīng)條件94 °C變性 15 s，60 °C退火 15 s， 72 °C延伸30 s，共27個(gè)循環(huán)。末次循環(huán)后于72 °C延伸10 min。取10 uL PCR產(chǎn)物（588 bp)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并進(jìn)行XmaI和Bgl II雙酶切，膠回收目的片段。然后 將pCAGGS-IRES-AscI經(jīng)同樣的酶處理后，膠回收4895 bp片段，其與PCR產(chǎn)物室溫連接4-5 h，形成重組產(chǎn)物pCAGGS- IRES-dhfr-AscI。然后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到凡co/i DH5a感受態(tài) 細(xì)胞后，用LB/Amp+平板篩選出陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，XmaI和Bgl II雙酶切鑒定，目的 片段為 588 bp、4895 bp。
[0018] (4) pCAGGS-FVII-IRES-DHFR-AscI 載體構(gòu)建 根據(jù)F W基因序列設(shè)計(jì)引物：上游引物F W -N-for:GGCCGCGGCCGCCACCATGGTCTCC CAG,下游引物： 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件是94 °C預(yù)變性2 min; 94 °C變性30 s，60 °C退火30 s，72 °C 延伸I min，30個(gè)循環(huán)；72 °C再延伸10 min ;1 %瓊脂糖電泳膠回收210 bp片段（insert 1)。然后將insert 1片段經(jīng)NotI和MluI雙酶切后膠回收，準(zhǔn)備連接。
[0019] MluI和EcoRI雙酶切pGEM-F W質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收1257 bp片 段（insert 2)。Not I 和 Mun I 雙酶切載體 pCAGGS-IRES-DHFR-AscI，膠回收 5421 bp片段。然后將此片段和insert Uinsert 2于4 °C過(guò)夜連接，形成重組質(zhì)粒 pCAGGS-F W -IRES-DHFR-AscI。SphI 和 EcoRI 雙酶切鑒定，目的片段為 1530 bp 和 5381 bp 〇
[0020] (5) pCAGGS-VKORCl-IRES-GGCX-AscI 載體構(gòu)建 XmaI和Bgl II雙酶切載體pCAGGS-IRES- DHFR-AscI，膠回收4895 bp的酶切產(chǎn)物1 ; 同時(shí)Age I和Bam HI雙酶切載體pGEM-GGCX，膠回收2285 bp的酶切產(chǎn)物2。然后將酶切 產(chǎn)物1和酶切產(chǎn)物2以分子量為3:1的比例連接，形成重組質(zhì)粒pCAGGS-IRES- GGCX-AscI。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到凡co/i DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，用LB/Amp+平板篩選出陽(yáng)性克 隆，挑取陽(yáng)性克隆菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取試劑 盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，Sal I酶切鑒定，目的片段為7180 bp。
[0021] Not I 和 Xho I 雙酶切載體 pCAGGS-IRES-GGCX-AscI，膠回收 7164 bp 的酶切產(chǎn) 物3 ;同時(shí)，同樣的酶雙酶切載體pGEM-VKORCl，膠回收497 bp的酶切產(chǎn)物4,然后將酶切產(chǎn) 物3和酶切產(chǎn)物4連接，形成重組載體pCAGGS-VKORCl-IRES-GGCX-AscI。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 到凡cWi DH5ci感受態(tài)細(xì)胞后，用LB/Amp+平板篩選出陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，Not I和 Xho I酶切鑒定，酶切片段為497 bp和7164 bp。
[0022] (6) pInsulator4x-CAGGS-VK0RCl-GGCX 載體構(gòu)建 Sal I 和 Asc I 雙酶切載體 pCAGGS-VKORCl-IRES-GGCX-AscI，膠回收酶切 產(chǎn)物5662 bp; MauB I和Bpi I雙酶切pinsulator4x (東北師范大學(xué)鄭耀武教 授提供)，膠回收酶切產(chǎn)物9696 bp.然后將以上2個(gè)酶切產(chǎn)物連接形成重組質(zhì)粒 pinsulator4x-CAGGS-VK0RCl-GGCX。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到凡co/i DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，用 LB/Amp+平板篩選出陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振 蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，Sal I和Asc I酶切鑒定，酶切片段為866 bp 和 14492 bp。
[0023] (7)功能性重組人凝血因子W表達(dá)載體 pInsulator4x-CAGGS-VK0RCl-GGCX-F W 的構(gòu)建 Sal I 和 Asc I 雙酶切載體 pCAGGS-FVII-IRES-DHFR-AscI，膠回收 4837 bp 酶切產(chǎn) 物；同樣的酶雙酶切載體pinsulator4x-CAGGS-VK0RCl-GGCX，膠回收14492 bp酶切產(chǎn)物， 然后將以上2個(gè)酶切產(chǎn)物連接形成重組質(zhì)粒pinsulator4x-CAGGS-VK0RCl-GGCX-FVIIa，將 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到凡cWi DH5ci感受態(tài)細(xì)胞后，用LB/Amp+平板篩選出陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性 克隆菌溶于5 mL LB培養(yǎng)基37 °C、200 r/min振蕩過(guò)夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取 質(zhì)粒，Sal I和Asc I酶切鑒定，酶切片段為4837 bp和14492 bp。
[0024] 通過(guò)一系列的基因克隆操作，釣取的FVII基因、GGCX基因及VK0RC1均成功插入 到載體的特定克隆位置，PCR鑒定及酶切鑒定結(jié)果均顯示克隆成功。功能性人凝血因子W 表達(dá)載體構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖1。
[0025] 實(shí)施例2 :CH0哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、篩選及克隆化 ⑴實(shí)例1構(gòu)建的Plsulator4x-VOKRC1-GGCX-F W質(zhì)粒線(xiàn)性化 Swa I酶切質(zhì)粒，25 °C酶切8 h，然后加入1/10體積的3 M的乙酸鈉和2. 5倍體積的 無(wú)水乙醇，-20 °C孵育2 h，14000 rpm低溫離心10 min。棄上清，加入70 %乙醇500 uL， 14000 rpm低溫離心I min。重復(fù)以上步驟，棄上清，加入10 uL無(wú)菌水。
[0026] (2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 采用Iipofectin脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。含4 g/L次黃嘌呤（H)和胸腺嘧啶（T) DMEM 培養(yǎng)基（HT選擇培養(yǎng)基)常規(guī)培養(yǎng)DHFR缺陷型CHO細(xì)胞，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按照2 X 105/L接 種至6孔板，2 ml/L，培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成50%?70%單層時(shí)棄去培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌 細(xì)胞2次，將Iipofectin脂質(zhì)體和pIsulator4x-V0KRCl-GGCX-F W質(zhì)粒按照1 :1的比例 混合。混勻形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體，室溫靜止20 min后均勻滴入細(xì)胞孔中，輕柔搖勻細(xì)胞 板，37°C培養(yǎng)，5-6 h后換新鮮培養(yǎng)液。24 h后將細(xì)胞分至培養(yǎng)皿中，48 h后利用DMEM培 養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，獲得抗性細(xì)胞集落。
[0027] (3)加壓篩選及克隆化 獲得的抗性細(xì)胞集落按照10 %的接種量接種培養(yǎng)，先用20 nM MTX篩選，7天左右換 液，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好時(shí)，再提高至40 nM MTX篩選，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞集落進(jìn)行有 限稀釋法克隆篩選穩(wěn)定的CHO細(xì)胞株。
[0028] 實(shí)施例3 :人重組凝血因子VII的表達(dá)、純化及鑒定 (I)F W的表達(dá)、純化 經(jīng)有限稀釋獲得的高表達(dá)細(xì)胞株，經(jīng)無(wú)血清馴化后，在MTX壓力下擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng) 上清。1000rpm，4°C離心后，上清經(jīng)0.22 MM濾膜過(guò)濾后Ni sepharose? 6 Fast Flow分離 純化。平衡緩沖液（20禮1'1^8、50〇1111氯化鈉、1〇1111咪唑？117.8)平衡附8印1^1'〇86? 6 Fast Flow柱，然后將過(guò)濾后上清上柱。上樣后再用平衡緩沖液洗至基線(xiàn)，然后用洗脫緩 沖液（20 mM Tris、500 mM氯化鈉、50 mM咪唑pH 7. 8)洗脫雜蛋白，最后用洗脫緩沖液（20 mM Tris、500 mM氯化鈉、250 mM咪唑pH 7. 8)洗脫目的蛋白峰。
[0029] (2) F VH的 SDS-PAGE、Western blot 分析 洗脫峰組分經(jīng)10000 MWCO超濾管超濾交換至hF W儲(chǔ)存液（25 mM Ifepes; 100 mM NaCl; 5 mM CaC12; pH 7. 5)，濃縮后即重組FW純化樣。FW純化樣品經(jīng)12 % SDS-PAGE電 泳分析后，用電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad)將SDS-PAGE膠中的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液（PBST + 5%脫脂奶粉）封閉過(guò)夜，PBST洗膜4次，10 min/次，加入1:500稀釋的抗6His tag鼠 多抗作為一抗，4 °C過(guò)夜，PBST洗膜4次后，加入1:5000稀釋的AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室 溫反應(yīng)2 h，用PBST洗膜4次后，最后用BCIP/NBT顯色試劑盒避光顯色并拍照，結(jié)果見(jiàn)圖 2和圖3。
[0030] (3) F W的表達(dá)水平分析及活性測(cè)定 重組F W純化樣，利用bradford法測(cè)蛋白濃度（以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白），計(jì)算重組宿主 細(xì)胞F W的表達(dá)水平和產(chǎn)率，結(jié)果如表1。凝血酶原時(shí)間（PT)測(cè)定F W重組蛋白促凝血活 性：利用人凝血因子W促凝活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明，以人凝血因子W缺乏血漿為基質(zhì)血漿， 采用凝血酶原時(shí)間（PT)測(cè)定重組F W純化樣的效價(jià)。以諾其N(xiāo)ovoseven (60 KIU)作為標(biāo) 準(zhǔn)品，利用人凝血因子W缺乏血漿倍比稀釋?zhuān)瑴y(cè)定不同稀釋倍數(shù)的促凝時(shí)間。以標(biāo)準(zhǔn)品效 價(jià)（IU/ml)的對(duì)數(shù)對(duì)其相應(yīng)的凝固時(shí)間（S)對(duì)對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。人凝血因子W缺乏血漿 倍比稀釋待測(cè)重組F VL計(jì)算樣品hF W的效價(jià)，結(jié)果顯示重組F W純化樣品的效價(jià)與諾其 Novoseven (60 KIU)標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)相當(dāng)，約為45KIU/mg，具有良好的促凝血活性。
[0031] 表1重組hF vn的測(cè)定及活性hF vn比率

【權(quán)利要求】
1. 一種包含表達(dá)功能性重組人凝血因子νπ載體的宿主細(xì)胞，其特征在于包含編碼維生 素 Κ依賴(lài)的人凝血因子W(F W)重組核酸、小鼠維生素 Κ還原酶復(fù)合體亞基1 (VK0RC1)重 組核酸和小鼠 g氨基酸羧化酶（GGCX)重組核酸，以及絕緣子insulator (4X)重組核酸；其 中F W、VK0RC1和GGCX在宿主細(xì)胞中均獲得穩(wěn)定表達(dá)。
2. 如權(quán)利要求1所述的包含表達(dá)功能性重組人凝血因子W載體的宿主細(xì)胞，其特征在 于編碼維生素 K依賴(lài)的hF W重組核酸和二氫葉酸還原酶（DHFR)重組核酸通過(guò)內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)連接，利用 CAG啟動(dòng)子（CMV early enhancericken beta actin promoter， 由AG promoter和hCMV-IE enhancer組成）啟動(dòng)；編碼VK0RC1重組核酸和GGCX重組核酸 同樣通過(guò)IRES連接，CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)；且兩個(gè)啟動(dòng)子組成的重組核酸表達(dá)單元通過(guò)絕緣子 insulator (4X)重組核酸隔離。
3. 如權(quán)利要求1和2所述的包含表達(dá)功能性重組人凝血因子W載體的宿主細(xì)胞，其特 征在于所述的絕緣子insulator (4X)重組核酸由經(jīng)部分改造的雞HS4絕緣體單元4倍串 聯(lián)而成；經(jīng)部分改造的雞HS4絕緣體單元其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1 ;絕緣子insulator (4X)重組核苷酸插入位置為兩個(gè)啟動(dòng)子組成的重組核酸表達(dá)單元的下游。
4. 如權(quán)利要求1和2所述的包含表達(dá)功能性重組人凝血因子W載體的宿主細(xì)胞，其 特征在于所述編碼維生素 K依賴(lài)的人凝血因子W (F W)重組核酸其核苷酸序列為SEQ ID NO: 2 ;所述編碼小鼠維生素 K還原酶復(fù)合體亞基1 (VK0RC1)重組核酸其核苷酸序列為SEQ ID NO: 3;所述編碼小鼠 g氨基酸羧化酶（GGCX)重組核酸其核苷酸序列為SEQ ID NO:4。
5. 如權(quán)利要求1所述的包含表達(dá)功能性重組人凝血因子W表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其特 征在于該宿主細(xì)胞為DHFR缺陷型CH0哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求1所述的可高水平表達(dá)功能性人凝血因子W的方法，其特征在于： 1) 構(gòu)建一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體中F W重組核酸通過(guò)IRES與DHFR重組核酸連接，由 CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)共表達(dá)；同時(shí)含有CAG啟動(dòng)子啟動(dòng)、由IRES連接VK0RC1重組核酸和GGCX重 組核酸組成的表達(dá)單元；兩個(gè)重組核酸表達(dá)單元由絕緣子insulator (4X)重組核酸隔離； 2) 利用脂質(zhì)體法將1)所述表達(dá)載體介導(dǎo)進(jìn)入DHFR缺陷型CH0動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，DMEM培 養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆；利用有限稀釋法亞克隆穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；挑選高表達(dá)陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培 養(yǎng)，氨甲喋呤（MTX)梯度加壓篩選，提高h(yuǎn)F W表達(dá)水平； 3) 無(wú)血清馴化培養(yǎng)該宿主細(xì)胞株； 4) 利用鎳離子親和層析純化hF ΥΠ 重組蛋白，SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)； 5) 凝血酶原時(shí)間（PT)測(cè)定FW重組蛋白促凝血活性。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104293737SQ201410470196
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】張全愛(ài), 趙邑, 張祿卿, 鄭耀武, 何永吉, 潘薇薇, 趙峰梅, 梁雅麗, 曹鵬程, 趙亞蕊 申請(qǐng)人:太原博奧特生物技術(shù)有限公司