FcRn介導(dǎo)的抗細(xì)粒棘球蚴靶向黏膜疫苗載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種FcRn介導(dǎo)的抗細(xì)粒棘球蚴靶向黏膜疫苗載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)目的基因Eg95的擴(kuò)增(2)小鼠野生型Fc片段(Fc/wFc)和突變型Fc片段(Fc/mFc)的擴(kuò)增(3)Eg95-Fc/wFc(mFc)的擴(kuò)增(4)Eg95-Fc/wFc(mFc)融合蛋白在桿狀病毒表面的展示(5)Eg95-Fc/wFc(mFc)重組病毒粒子的純化。
【專利說明】FcRn介導(dǎo)的抗細(xì)粒棘球蚴靶向黏膜疫苗載體的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和疫苗學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種FcRn介導(dǎo)的抗細(xì)粒棘 球蚴靶向黏膜疫苗載體的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 1. 1細(xì)粒棘球蚴病概況
[0003] 細(xì)粒棘球蝴?。‥chinococcosis granulosus)亦稱囊型包蟲病（Cystic Echinococcosis, CE)是由細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus, Eg)的續(xù)絳期幼蟲所 引起的一種嚴(yán)重危害人畜健康的人獸共患寄生蟲病，是當(dāng)前國家衛(wèi)生部規(guī)劃防治的重要寄 生蟲病之一。包蟲病患者主要通過誤食細(xì)粒棘球蚴蟲卵或幼蟲而發(fā)生感染，蟲卵六鉤蚴在 腸內(nèi)孵出后經(jīng)遷移最后定居于宿主肝、肺等臟器。該病呈世界性分布，現(xiàn)已證實(shí)在我國已有 29個(gè)省市區(qū)存在棘球蚴病感染病例，有100多萬棘球蚴病現(xiàn)癥患者，受威脅人口約5000余 萬人，棘球蚴病畜超過4000萬頭，每年新增病畜達(dá)800多萬頭，年經(jīng)濟(jì)損失超過10億元。寧 夏是我國包蟲病的高發(fā)區(qū)之一，2011年中國疾病預(yù)防控制中心網(wǎng)絡(luò)直報(bào)統(tǒng)計(jì)分析，寧夏包 蟲病平均感染率為10. 8%，估計(jì)全區(qū)感染者約50萬，病人約24萬，該病已成為當(dāng)?shù)厝罕娨?病致貧、因病返貧的主要原因之一。馮運(yùn)靈等對1991-2010年寧夏包蟲病住院病例的回顧 性調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著城市化進(jìn)程的加快帶來的農(nóng)村和城市之間的物質(zhì)和人員流動的增加， 導(dǎo)致包蟲病有從農(nóng)村向城市蔓延的趨勢，對這種現(xiàn)象已有專家表示擔(dān)憂。因此，包蟲病的防 治重要性和緊迫性刻不容緩。
[0004] 1. 2FcRn 與疫苗
[0005] 目前對包蟲病的治療主要通過手術(shù)和藥物，但手術(shù)治療術(shù)后常繼發(fā)感染或難以根 除，而藥物治療會產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用和耐藥性。有保護(hù)作用的疫苗將成為控制該病的有 效工具。黏膜疫苗是現(xiàn)在疫苗研究的一個(gè)方向。
[0006] 黏膜疫苗要想獲得理想的免疫效果就必須要穿過黏膜上皮細(xì)胞，然后將免疫原遞 呈給免疫效應(yīng)細(xì)胞。然而，由于黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接，致使大分子抗原物質(zhì)無法穿過 上皮細(xì)胞而發(fā)揮有效的黏膜免疫。研究發(fā)現(xiàn)，新生兒Fc受體（Neonatal Fc receptor, FcRn) 是識別免疫球蛋白IgG Fc片段的受體。FcRn可以通過黏膜表面的上皮細(xì)胞，特異性的與 IgG Fc片段結(jié)合，從而介導(dǎo)黏膜上皮細(xì)胞主動轉(zhuǎn)運(yùn)IgG，使機(jī)體獲得抵御病原體的能力。 FcRn最早是在新生嚙齒動物腸道上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，近些年發(fā)現(xiàn)FcRn在成年小鼠的鼻黏 膜上皮細(xì)胞中表達(dá)量很高，而在小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)量卻很低，在人體的許多組織中也存 在，包括心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉、胰腺、胎兒和成人小腸。FcRn與IgG結(jié)合具有pH依賴 性，即在酸性pH條件下結(jié)合，在中性pH條件下釋放。FcRn-IgG復(fù)合物在pH5?6之間相對 穩(wěn)定，但當(dāng)pH上升到7. 0時(shí)，其結(jié)合力顯著下降兩個(gè)數(shù)量級以上。FcRn除了具有胞轉(zhuǎn)IgG 作用外，還可以保護(hù)循環(huán)中的IgG免受降解，延長IgG半衰期，從而可以長時(shí)間發(fā)揮免疫作 用。
[0007] 1. 3桿狀病毒表面展示系統(tǒng)
[0008] 要進(jìn)行疫苗的研究，表達(dá)載體的選擇至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室前期對包蟲抗原做了大 量的原核表達(dá)研究，盡管一些蛋白表現(xiàn)出了免疫原性和一定的保護(hù)力，但由于蛋白表達(dá)量 低以及純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力，限制了該蛋白的進(jìn)一步研究。更重要的是，原核表達(dá)系統(tǒng)由于缺乏 真核生物蛋白正確折疊所需的分子伴侶及相關(guān)酶類，所以不能完成復(fù)雜真核生物蛋白磷酸 化、糖基化等翻譯后修飾加工過程，致使表達(dá)的蛋白活性受到限制。本研究構(gòu)建了一個(gè)全新 的真核表達(dá)載體系統(tǒng)--桿狀病毒表面展示系統(tǒng)，不僅具有外源蛋白高效表達(dá)的特性，而 且使表達(dá)的蛋白直接展示在病毒粒子的表面，只需超速離心得到重組病毒粒子即可同時(shí)獲 得目的蛋白，簡化了蛋白純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力不經(jīng)濟(jì)等缺陷。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)，和其他滅活 疫苗和以病毒為載體的疫苗不同，桿狀病毒對人類和哺乳動物不引起致病，能在一般的生 物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作；能在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行感染昆蟲細(xì)胞而大量的表達(dá)目的蛋白，加速生 產(chǎn)過程。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建，不但可為真核表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)提供理想的技術(shù)模型， 具有重要的理論意義，而且利用桿狀病毒表面展示系統(tǒng)具有周期短、費(fèi)用低、可控性強(qiáng)等優(yōu) 點(diǎn)，用其表達(dá)一些具有特殊應(yīng)用價(jià)值和藥用價(jià)值的蛋白，將會產(chǎn)生巨大的潛在的社會和經(jīng) 濟(jì)效益。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)的建立，可為試驗(yàn)的研究提供充足的實(shí)驗(yàn)材料，為包蟲病疫 苗的研制提供了一個(gè)理想的表達(dá)載體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術(shù)不足，基于目前對包蟲病尚無有效的疫苗問世，而且現(xiàn)有的方法在 制備黏膜疫苗中效果不好，提供一種FcRn介導(dǎo)的抗細(xì)粒棘球蚴靶向黏膜疫苗載體的構(gòu)建 方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明涉及一種FcRn介導(dǎo)的抗細(xì)粒棘球蚴靶向黏膜疫苗載體的構(gòu)建方法，其特 征在于包括如下步驟：
[0011] ⑴目的基因 Eg95的擴(kuò)增
[0012] 合成引物
[0013] P1 :3, -GCTCTCGAGATGGCATTCCAGTTA-5,，
[0014] P2 :3, -GAAGAATTCAGTAAGGACAACCAC-5,；
[0015] 處死細(xì)粒棘球蝴感染小鼠，無菌分離Eg包囊，抽提囊液，分離原頭節(jié)，按RNAeasy Mini試劑盒提取總RNA，然后以總RNA為模板，用01igo(dT) 18隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以 Pl，P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離大小約為468bp特異性條帶，其 核苷酸序列為SEQ ID NO. 1 ;
[0016] (2)小鼠野生型Fc片段（Fc/wFc)和突變型Fc片段（Fc/mFc)的擴(kuò)增
[0017] 合成引物 P3 :3 ' -GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGC-5 '，
[0018] P4 :3，-TTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG-5，，
[0019] 用于擴(kuò)增Fc片段，然后通過點(diǎn)突變將Glu318、LyS320、Lys322突變?yōu)锳la，將擴(kuò)增 出的片段命名為Fc/wFc，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 2 ;進(jìn)一步通過點(diǎn)突變的方式，以Fc/ wFc為模板，將His310、His433突變?yōu)锳la殘基，將擴(kuò)增出的片段命名為Fc/mFc，其核苷酸 序列為 SEQ ID N0. 3 ;
[0020] (3)Eg95_Fc/wFc(mFc)的擴(kuò)增
[0021] 在Eg95下游引物的Y端和Fc/wFc或Fc/mFc基因上游引物的Y端引入14個(gè) 柔性氨基酸linker (GSGGGGSGGGGSGS)，然后通過長片段無模板擴(kuò)增法獲得融合片段，經(jīng) 1. 〇%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和序列測定正確的片段命名為Eg95-Fc/WFc和Eg95-Fc/mFc， Eg95-wFc融合基因序列為SEQ ID NO. 4 ;Eg95-mFc融合基因序列為SEQ ID NO. 5 ;
[0022] (4)Eg95-Fc/WFC(mFc)融合蛋白在桿狀病毒表面的展示
[0023] 將測序后正確的融合基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xhol和PstI雙酶切后回收并純化，然后 定向插入與同樣雙酶切的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC的MCS中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受 態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行序列測定鑒定；
[0024] 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒DNA的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DHlOBac 中，經(jīng)過卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三種抗性LB平板篩選，挑取白斑菌落，提取重組桿狀 病毒DNA ;
[0025] 將重組桿狀病毒DNA利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞；待細(xì)胞出現(xiàn)病變或大量熒 光出現(xiàn)后，收集培養(yǎng)上清作為原毒種，分小管貯存于_80°C冰箱。
[0026] 懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，待細(xì)胞濃度達(dá)到IX 106個(gè)/ml，以1M0I的重組桿狀病毒量感 染昆蟲細(xì)胞，利用病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制達(dá)到病毒增殖，感染3?4d后離心除去細(xì)胞及細(xì) 胞碎片，收集上清液，便完成病毒量擴(kuò)增；
[0027] (5)Eg95_Fc/wFc (mFc)重組病毒粒子的純化
[0028] 通過病毒感染Sf-9細(xì)胞完成病毒量的擴(kuò)增后，收集病毒感染3?4d的細(xì)胞，經(jīng)反 復(fù)凍融、離心收集上清液，然后通過超速離心和蔗糖密度梯度離心獲得純化的重組病毒粒 子，用BCA法測重組蛋白濃度，置_80°C保存?zhèn)溆谩?br>
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖lEg95基因的RT-PCR鑒定；
[0030] 圖2Eg95-Fc/wFc融合基因的PCR鑒定；
[0031] 圖3pBacSC質(zhì)粒構(gòu)建模式圖；
[0032] 圖4轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間細(xì)胞的生長表現(xiàn)情況（400X);
[0033] 圖5轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間綠色熒光蛋白的表現(xiàn)情況（100X);
[0034] 圖6激光共聚焦顯微鏡觀察重組蛋白在Sf-9細(xì)胞膜上的表現(xiàn)；
[0035] 圖7純化的重組桿狀病毒W(wǎng)estern blot分析：
[0036] 1. BacSC-Eg95病毒粒子經(jīng)Triton X-100裂解后的囊膜蛋白部分；2. BacSC-Eg95 病毒粒子經(jīng)Triton X-100裂解后的核衣殼蛋白部分；3.完整的BacSC-Eg95病毒粒子。
[0037] 圖8體外FcRn介導(dǎo)Eg95_Fc/wFc重組蛋白胞轉(zhuǎn)；
[0038] 圖9體內(nèi)FcRn介導(dǎo)Eg95_Fc/wFc重組蛋白胞轉(zhuǎn)。 具體實(shí)施方案
[0039] 下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是此說明不會構(gòu)成對本發(fā)明的限 制。
[0040] 實(shí)施例1
[0041] (一）細(xì)粒棘球蚴靶向黏膜疫苗載體的構(gòu)建
[0042] 1.目的基因 Eg95的擴(kuò)增
[0043] 根據(jù) GenBank 上登錄的 Eg95 (X90928. 1) cDNA 序列，設(shè)計(jì)引物 PI 3'-GCTCTCGAGAT GGCATTCCAGTTA-5'，P2 3' -GAAGAATTCAGTAAGGACAACCAC-5'。處死細(xì)粒棘球蚴感染小鼠，無 菌分離Eg包囊，抽提囊液，分離原頭節(jié)，按RNAeasy Mini試劑盒提取總RNA，然后以總RNA 為模板，用01 igo (dT) 18隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以P1，P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1. 0 %瓊 脂糖凝膠電泳鑒定，可見一條特異性條帶，大小約為468bp，與預(yù)期的Eg95目的基因大小一 致（如圖1所示），其中Eg95的核苷酸序列為SEQ ID N0. 1。
[0044] 2.小鼠野生型Fc片段（Fc/wFc)和突變型Fc片段（Fc/mFc)的擴(kuò)增
[0045] 根據(jù)GenBank上收錄的小鼠 IgG2a的重鏈序列（V00798. 1)，設(shè)計(jì)一對引物P3 GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGC, P4 ITTACCCGGAGTCCGGGAGAAG，用于擴(kuò)增 Fc 片段，然后通過點(diǎn) 突變，使其喪失結(jié)合補(bǔ)體Clq位點(diǎn)的能力（將Glu318、LyS320、Lys322突變?yōu)锳la)，而保留 結(jié)合FcRn的能力，將擴(kuò)增出的片段命名為Fc/wFc，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 2;進(jìn)一步通 過點(diǎn)突變的方式，以Fc/wFc為模板，將His310、His433突變?yōu)锳la殘基，使其喪失與FcRn 結(jié)合的能力，將擴(kuò)增出的片段命名為Fc/mFc，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3。
[0046] 3. Eg95_Fc/wFc (mFc)的擴(kuò)增
[0047] 在Eg95下游引物的5'端和Fc/wFc或Fc/mFc基因上游引物的5'端引入14個(gè) 柔性氨基酸linker (GSGGGGSGGGGSGS)，然后通過長片段無模板擴(kuò)增法獲得融合片段，經(jīng) 1. 〇%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和序列測定正確的片段命名為Eg95-Fc/WFc和Eg95-Fc/mFc， Eg95-wFc融合基因序列為SEQ ID NO. 4 :(全長1209bp)。（結(jié)果如圖2所示）。Eg95-mFc 融合基因序列為SEQ ID Ν0· 5 :(全長1209bp)
[0048] 4.Eg95_Fc/wFc(mFc)融合蛋白在桿狀病毒表面的展示
[0049] 展示Eg95-Fc/WFC(mFc)供體質(zhì)粒的構(gòu)建將測序后正確的融合基因的PCR產(chǎn)物經(jīng) Xhol和PstI雙酶切后回收并純化，然后定向插入與同樣雙酶切的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC(模式圖 如圖3所示）的MCS中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，提取質(zhì) 粒，進(jìn)行序列測定鑒定。
[0050] 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒DNA的大腸桿菌感 受態(tài)細(xì)胞DHlOBac (商品化產(chǎn)品，購買于Invitrogen公司）中，經(jīng)過卡那霉素、慶大霉素和 四環(huán)素三種抗性LB平板篩選，挑取白斑菌落，提取重組桿狀病毒DNA。
[0051] 重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞將重組桿狀病毒DNA利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染Sf-9 細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，普通倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，對照細(xì) 胞未見明顯變化，細(xì)胞長勢良好，輪廓清晰，大小均一，胞體明亮；轉(zhuǎn)染后第3天細(xì)胞停止生 長，部分細(xì)胞直徑增大，脫落，胞核充滿整個(gè)細(xì)胞；第5天則可看到大部分細(xì)胞從瓶底脫落、 懸浮，最終裂解死亡（如圖4所示）。倒置熒光顯微鏡下觀察，對照細(xì)胞未見熒光產(chǎn)生，而轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞則出現(xiàn)綠色熒光，且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長熒光逐漸增多、增強(qiáng)（如圖5所示）。說 明重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后包裝產(chǎn)生了具有感染活性的重組桿狀病毒。待細(xì)胞出 現(xiàn)病變或大量熒光出現(xiàn)后，收集培養(yǎng)上清作為原毒種，分小管貯存于-80°C冰箱。
[0052] 重組桿狀病毒的擴(kuò)增懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，待細(xì)胞濃度達(dá)到1 X 106個(gè)/ml，以1M0I 的重組桿狀病毒量感染昆蟲細(xì)胞，利用病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制達(dá)到病毒增殖。感染3?4d 后離心除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片，收集上清液，便完成病毒量擴(kuò)增。
[0053] 在Sf-9細(xì)胞表面的展示將重組病毒感染的Sf-9細(xì)胞接種于30mm共聚焦專用培 養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行共軛聚焦顯微鏡分析。第一抗體分別為鼠抗His6單克隆抗體、兔抗Eg95陽性 血清，第二抗體分別為FITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG。結(jié)果如圖6所 示，證明Eg95-Fc/wFc融合蛋白展示在了病毒感染的細(xì)胞膜上。
[0054] 在病毒囊膜上的展示將重組桿狀病毒粒子經(jīng)蔗糖密度梯度超速離心純化后用 Triton X-100處理，離心后分別收集病毒囊膜蛋白部分和核衣殼部分，用于Western blot 分析。結(jié)果如圖7所示，用兔抗Eg95抗體檢測，完整的BacSC-Eg95病毒粒子可以檢測到一 條特異性條帶，當(dāng)將BacSC-Eg95用Triton X-100處理后，囊膜蛋白部分可檢測到特異性條 帶，而核衣殼部分則檢測不到任何條帶，蛋白條帶的大小與預(yù)測的Eg95融合蛋白的大小一 致（Mr約為46 000)。說明Eg95融合蛋白展示在了出芽病毒粒子的囊膜上。
[0055] 5. Eg95_Fc/wFc (mFc)重組病毒粒子的純化
[0056] 通過病毒感染Sf-9細(xì)胞完成病毒量的擴(kuò)增。收集病毒感染3?4d的細(xì)胞，經(jīng)反復(fù) 凍融、離心收集上清液，然后通過超速離心和蔗糖密度梯度離心獲得純化的重組病毒粒子， 用BCA法測重組蛋白濃度，置_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0057](二）FcRn介導(dǎo)外源蛋白胞轉(zhuǎn)作用研究
[0058] 1.體外FcRn介導(dǎo)外源蛋白胞轉(zhuǎn)作用研究
[0059] 將MDCK-FcRn細(xì)胞（將小鼠 FcRn α鏈全長基因插入到PcDNA3. 1質(zhì)粒中，通過脂 質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MDCK細(xì)胞，然后通過G418篩選獲得單克隆細(xì)胞株，由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并 保存）和正常MDCK細(xì)胞接種在Transwell filterinserts培養(yǎng)板上，待長成單層，用組織電 阻檢測儀測定跨膜上皮電阻達(dá)到300 Ω /cm2時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，用無血清DMEM培養(yǎng)基平衡3h， 然后將Eg95-Fc/ WFc、Eg95-Fc/mFc和Eg95重組蛋白分別加入到內(nèi)小室的細(xì)胞中，同時(shí)在 DMEM培養(yǎng)基中加入（或不加入）lmg/ml鼠 IgG或雞IgY作為對照，在5% C02, 37°C培養(yǎng)箱 中孵育2h，然后收集外小室的培養(yǎng)液，用于Western blot分析。
[0060] 結(jié)果如圖8所示，單獨(dú)加入外源蛋白Eg95_Fc/wFc時(shí)，用Eg95抗體進(jìn)行Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)有一條特異性的條帶出現(xiàn)；當(dāng)同時(shí)加入過量的小鼠 IgG或雞IgY時(shí)，由于 IgG和融合Fc片段的外源蛋白對FcRn的競爭作用，抑制了外源蛋白的胞轉(zhuǎn)，所以沒有檢測 出特異性蛋白條帶，而IgY由于和FcRn不結(jié)合，因而會有特異條帶出現(xiàn)。而當(dāng)加入外源蛋 白Eg95-Fc/mwFc或Eg95時(shí)，用同樣的方法處理，結(jié)果沒有檢測到任何蛋白條帶。結(jié)果證明 FcRn可介導(dǎo)融合Fc片段的外源蛋白發(fā)生胞轉(zhuǎn)。
[0061] 2.體內(nèi)FcRn介導(dǎo)外源蛋白胞轉(zhuǎn)作用研究
[0062] 將 50 μ g Eg95-Fc/wFc、Eg95-Fc/mFc 和 Eg95 蛋白分別加入到 50 μ 1 PBS 中，將小 鼠用ΙΟΟμ 1三溴乙醇（40mg/ml)麻醉后，通過鼻腔免疫C57BL/6小鼠，免疫后8h，分離小鼠 血清，用ELISA方法測定血清中不同免疫組Eg95的抗體濃度。
[0063] 結(jié)果如圖9所示，通過鼻腔免疫Eg95_Fc/wFc，可顯著提高血液中Eg95蛋白的抗體 濃度（達(dá)到了 13. 27±0. 5)，而免疫Eg95-Fc/mFc和單獨(dú)的Eg95,血液中的Eg95抗體濃度 則比較低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Eg95-Fc/ WFc免疫組的抗體濃度值與Eg95-Fc/mFc和Eg95對照 組比較，差異顯著（P < 0. 05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明通過Fc-FcRn的相互作用，可以使目的蛋白有 效的穿過黏膜上皮進(jìn)入血液中。
[0064] 以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0065] 序列表

【權(quán)利要求】
1. 一種FcRn介導(dǎo)的抗細(xì)粒棘球蚴靶向黏膜疫苗載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如 下步驟： (1)目的基因 Eg95的擴(kuò)增 合成引物 P1 :3' -GCTCTCGAGATGGCATTCCAGTTA-5'， P2 :3' -GAAGAATTCAGTAAGGACAACCAC-5' ； 處死細(xì)粒棘球蝴感染小鼠，無菌分離Eg包囊，抽提囊液，分離原頭節(jié)，按RNAeasy Mini 試劑盒提取總RNA，然后以總RNA為模板，用Oligo (dT) 18隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以Pl，P2 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離大小約為468bp特異性條帶，其核苷酸 序列為 SEQ ID NO. 1 ; ⑵小鼠野生型Fc片段（Fc/wFc)和突變型Fc片段（Fc/mFc)的擴(kuò)增 合成引物 P3 :3' -GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGC-5'， P4 :3' -TTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG-5'， 用于擴(kuò)增Fc片段，然后通過點(diǎn)突變將Glu318、LyS320、Lys322突變?yōu)锳la，將擴(kuò)增出的 片段命名為Fc/wFc，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2;進(jìn)一步通過點(diǎn)突變的方式，以Fc/wFc為 模板，將His310、His433突變?yōu)锳la殘基，將擴(kuò)增出的片段命名為Fc/mFc，其核苷酸序列為 SEQ ID NO. 3 ； (3) Eg95_Fc/wFc(mFc)的擴(kuò)增 在Eg95下游引物的5'端和Fc/wFc或Fc/mFc基因上游引物的5'端引入14個(gè)柔性氨 基酸linker (GSGGGGSGGGGSGS)，然后通過長片段無模板擴(kuò)增法獲得融合片段，經(jīng)1. 0%瓊 脂糖凝膠電泳鑒定和序列測定正確的片段命名為Eg95-Fc/WFc和Eg95-Fc/mFc，Eg95-wFc 融合基因序列為SEQ ID NO. 4 ;Eg95-mFc融合基因序列為SEQ ID NO. 5 ; (4) Eg95-Fc/wFc (mFc)融合蛋白在桿狀病毒表面的展示 將測序后正確的融合基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xhol和PstI雙酶切后回收并純化，然后定向 插入與同樣雙酶切的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC的MCS中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì) 胞，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行序列測定鑒定； 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒DNA的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DHlOBac中， 經(jīng)過卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三種抗性LB平板篩選，挑取白斑菌落，提取重組桿狀病 毒 DNA ; 將重組桿狀病毒DNA利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞；待細(xì)胞出現(xiàn)病變或大量熒光出 現(xiàn)后，收集培養(yǎng)上清作為原毒種，分小管貯存于_80°C冰箱； 懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，待細(xì)胞濃度達(dá)到1X106個(gè)/ml，以1M0I的重組桿狀病毒量感染昆 蟲細(xì)胞，利用病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制達(dá)到病毒增殖，感染3?4d后離心除去細(xì)胞及細(xì)胞碎 片，收集上清液，便完成病毒量擴(kuò)增； (5) Eg95_Fc/wFc (mFc)重組病毒粒子的純化 通過病毒感染Sf-9細(xì)胞完成病毒量的擴(kuò)增后，收集病毒感染3?4d的細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)凍 融、離心收集上清液，然后通過超速離心和蔗糖密度梯度離心獲得純化的重組病毒粒子，用 BCA法測重組蛋白濃度，置-80°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12N15/62GK104232667SQ201410471012
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】王志昇, 楊文 , 陳健茂, 李麗, 林 源, 邱紅燕, 吳璟, 馬學(xué)平 申請人:寧夏醫(yī)科大學(xué)