一種基于雙酶偶聯(lián)高通量檢測(cè)d-阿洛糖的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于雙酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量檢測(cè)D-阿洛糖的新方法。具體涉及利用吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，檢測(cè)D-阿洛糖。該方法既可用于液體培養(yǎng)基中反應(yīng)產(chǎn)物D-阿洛糖的檢測(cè)，也可用于檢測(cè)固體培養(yǎng)基中反應(yīng)產(chǎn)物D-阿洛糖的生成。當(dāng)用于液體培養(yǎng)基的檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物與N-（2-羥基-3-磺丙基）-3，5-二甲氧基苯胺鈉（HSDA）作用產(chǎn)生藍(lán)色水溶性醌類物質(zhì)，利用96孔酶標(biāo)板在583nm處讀取吸光值。吸光值與其濃度成線性關(guān)系，能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，并利用96孔酶標(biāo)板進(jìn)行高通量檢測(cè)。當(dāng)該方法用于固體培養(yǎng)基中D-阿洛糖的檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作用生成不溶于水的褐色吩嗪聚合體，利用此顯色反應(yīng)可在培養(yǎng)皿中挑出陽(yáng)性菌落。
【專利說(shuō)明】-種基于雙酶偶聯(lián)高通量檢測(cè)D-阿洛糖的新方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明屬于糖轉(zhuǎn)化工業(yè)微生物的篩選和開(kāi)發(fā)利用領(lǐng)域，特別涉及一種基于雙酶偶聯(lián)反 應(yīng)的高通量檢測(cè)D-阿洛糖的新方法。
[0002] 技術(shù)背景 高通量篩選的意義 近年來(lái)，隨著系統(tǒng)代謝工程與合成生物學(xué)的日新月異的發(fā)展，以及蛋白質(zhì)構(gòu)象預(yù)測(cè)、結(jié) 構(gòu)分析和定點(diǎn)突變方法研究的不斷深入，加速了人們利用微生物以及微生物來(lái)源的關(guān)鍵酶 的步伐。
[0003] 然而，由于生物體的復(fù)雜性和人類認(rèn)識(shí)的局限性，除了少數(shù)成功的實(shí)例外，設(shè)計(jì)合 成的工程菌株經(jīng)常不能完全達(dá)到高效的生產(chǎn)要求，企圖通過(guò)理性設(shè)計(jì)達(dá)到改善生產(chǎn)關(guān)鍵酶 性能的目的也仍然非常困難。因此，需要通過(guò)誘變進(jìn)化的方法進(jìn)一步彌補(bǔ)理性設(shè)計(jì)的不足， 而非理性的誘變則通常需要結(jié)合高效高通量的篩選。只有建立有效的高通量篩選方法，在 先進(jìn)的現(xiàn)代自動(dòng)化技術(shù)和儀器設(shè)備幫助下，才能大大突破人工篩選在速度、效率和標(biāo)準(zhǔn)化 等方面的限制。
[0004] 阿洛糖的生理活性和篩選意義 在碳水化合物研究領(lǐng)域中，稀少糖是一類重要的研究?jī)?nèi)容。盡管在自然界中含量極少， 但稀少糖卻在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域中發(fā)揮著非常重要的功能。D-阿洛糖是一種功能廣泛 的稀少糖。它可以顯著抑制中性分葉核白細(xì)胞的生成，因此能夠在器官和組織移植中作為 一種免疫抑制劑顯示重要功能。此外，D-阿洛糖還能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增生繁殖，并 誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞0VCAR-3的凋亡。D-阿洛糖的衍射物因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在許多具有生物活性的 天然化合物、糖類衍射物、核苷類似物及非糖化合物的合成中應(yīng)用廣泛。
[0005] D-阿洛糖的生物轉(zhuǎn)化目前主要是以D-阿洛酮糖為底物，利用L-鼠李糖異構(gòu)酶將 D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛糖。然而，目前發(fā)現(xiàn)的L-鼠李糖異構(gòu)酶大多催化效率不高，作用 條件嚴(yán)苛，并不適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。篩選和誘變篩選表達(dá)高效L-鼠李糖異構(gòu)酶或其生產(chǎn) 菌株因此極為重要。
[0006] 傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限 傳統(tǒng)定性或定量檢測(cè)D-阿洛糖的方法非常有限。主要的檢測(cè)方法為液相色譜法和以 半胱氨酸咔唑法為代表的化學(xué)方法。液相色譜法操作繁瑣，儀器、耗材的成本高，示差檢測(cè) 的靈敏度也比較低，如果檢測(cè)的樣品比較多，也會(huì)存在保留時(shí)間的偏移等問(wèn)題。半胱氨酸咔 唑的化學(xué)檢測(cè)方法需要濃硫酸試劑，操作比較危險(xiǎn)，而且對(duì)樣品的純度要求嚴(yán)格，受其他物 質(zhì)的干擾比較多。因此，研究建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、處理量大和應(yīng)用廣泛的分析方法，可以 促進(jìn)生物法生產(chǎn)D-阿洛糖的理論研究，加快其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，對(duì)L-鼠李糖異構(gòu)酶及其生產(chǎn)菌 株的快速進(jìn)化也能起到很好的促進(jìn)作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的： 本發(fā)明的目的在于提供一種基于雙酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量檢測(cè)D-阿洛糖的新方法。通 過(guò)吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的方法測(cè)定D-阿洛糖，高通量篩選目標(biāo)微生物或酶。與 傳統(tǒng)篩選方法相比，基于雙酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量篩選方法具有成本低、效率高、目的性強(qiáng)， 能夠批量操作的優(yōu)點(diǎn)，能夠從廣泛的自然界中篩選性能優(yōu)良的菌株。
[0008] 本發(fā)明的思路： 利用吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的方法，測(cè)定D-阿洛糖和的含量。該方法包含兩 個(gè)方面內(nèi)容。
[0009] -方面，在氧氣存在條件下，D-阿洛糖被其吡喃糖氧化酶氧化，生成過(guò)氧化氫，形 成的過(guò)氧化氫與4-安替比林和HSDA在過(guò)氧化氫酶作用下形成一種水溶性的藍(lán)色醌類物 質(zhì)，在583nm處有特征吸收值。借助96孔黑色微孔板和酶標(biāo)儀，篩選高產(chǎn)D-阿洛糖的菌 株或高效的催化用酶，為基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供寶貴的菌種和酶資源。
[0010] 另一方面，D-阿洛糖被吡喃糖氧化酶作用形成的過(guò)氧化氫與DAB作用生成不溶于 水的褐色吩嗪聚合體，可以用于固體培養(yǎng)基中指示D-阿洛糖的生成。同樣可以用于高效菌 株和酶的篩選。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)路線： 技術(shù)路線1 :液體反應(yīng)液中 (1) 將固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落或者一種純化后的酶轉(zhuǎn)入到含有液體培養(yǎng)基和轉(zhuǎn) 化底物的96深孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔對(duì)應(yīng)一個(gè)單菌落或一種酶，用硅膠蓋蓋好，培養(yǎng)0-24小 時(shí)； (2) 將96深孔培養(yǎng)板利用冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，去除菌體； (3) 將96深孔培養(yǎng)板中的上清液與HSDA、4-安替比林、吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶在 96孔板中反應(yīng)，37 °C保溫20分鐘； (4) 將反應(yīng)結(jié)束的96孔板板利用酶標(biāo)儀測(cè)定583nm處的光吸收值，并將測(cè)得的吸收值 與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算D-阿洛糖的濃度。
[0012] 技術(shù)路線2 :固體培養(yǎng)基上 (1) 利用培養(yǎng)基將待篩選樣品進(jìn)行活化培養(yǎng)12-24小時(shí)； (2) 將富集培養(yǎng)的混合菌利用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，獲得單菌落，涂布到表面有滅菌醋酸纖 維素薄膜的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6-18小時(shí)； (3) 將長(zhǎng)有單菌落的醋酸纖維素薄膜揭下置于一干凈的培養(yǎng)皿中； (4) 制備轉(zhuǎn)化顯色膠：含有DAB、吡喃糖氧化酶、過(guò)氧化物酶和轉(zhuǎn)化底物的瓊脂糖凝膠； (5) 將溶融態(tài)的轉(zhuǎn)化顯色膠倒入步驟（7)所得的培養(yǎng)皿里，轉(zhuǎn)化顯色膠冷凝后覆蓋在醋 酸纖維素薄膜上，37°C保溫，實(shí)時(shí)觀察膠上的褐變效應(yīng)。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： (1) 效率高，吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶偶聯(lián)能夠快速檢測(cè)D-阿洛糖的含量； (2) 通量高，96深孔培養(yǎng)板和96孔板板結(jié)合酶標(biāo)儀一起使用，大大提高了篩選的速度， 固體培養(yǎng)基上的篩選也很直觀，一個(gè)平板可以同時(shí)篩選上百個(gè)單菌落； (3) 操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)過(guò)程不需要任何危險(xiǎn)試劑的參與，反應(yīng)條件溫和，顯色結(jié)果靈敏； (4) 成本低，能夠以較低成本獲得大量菌種。 具體實(shí)施例
[0014] 實(shí)施例1 : 步驟：在96孔板上依次加入lg/L D-阿洛糖50 μ L，150 μ L試劑A，吡喃糖氧化酶和 過(guò)氧化氫酶液100 μ L，總體積300 μ L。對(duì)照組加10g/L D-阿洛酮糖。設(shè)置酶標(biāo)儀溫度為 37°C，讀取0_21min的583(nm)光吸收值。從時(shí)間變化圖（附圖1)中可以看出，隨著時(shí)間的 增加，光吸收值增加，因此可以設(shè)定一個(gè)合適的時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)，如反應(yīng)開(kāi)始后20min為檢測(cè)的 時(shí)間點(diǎn)。此外，對(duì)照組的光吸收值一直非常低，可以認(rèn)為，反應(yīng)底物D-阿洛酮糖對(duì)檢測(cè)無(wú)干 擾。
[0015] 實(shí)施例2 :利用吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的方法測(cè)D-阿洛糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016] 步驟：在96孔板上依次加入0、0· 2、0· 4、0· 6、0· 8和L Og/L D-阿洛糖50μ L， 150 μ L試劑Α,吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶液100 μ L,總體積300 μ L。設(shè)置酶標(biāo)儀溫度為 37°C，讀取20min的583(nm)光吸收值（附圖2)。R2=0.997,說(shuō)明D-阿洛糖在一定范圍內(nèi) 與測(cè)定的Ab(583nm)值呈顯著線性關(guān)系。
[0017] 實(shí)施例3 :液體反應(yīng)體系中篩D-阿洛糖的生產(chǎn)菌 步驟：固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)含有待篩選L-鼠李糖異構(gòu)酶及其突變體的大腸桿菌，將得到 的單菌落轉(zhuǎn)接到含有液體培養(yǎng)基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)和底物10g/L的D-psicose 的96深孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔接種一個(gè)單菌落，用硅膠蓋蓋好，37°C培養(yǎng)12小時(shí)；將96深孔 培養(yǎng)板離心，取上清液50 μ L轉(zhuǎn)入96孔板中，加入含HSDA、4-安替比林的溶液A以及含吡喃 糖氧化酶和過(guò)氧化物酶的溶液，37°C保溫20分鐘，再在583nm測(cè)光吸收。對(duì)照組用液體培 養(yǎng)基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)代替培養(yǎng)液上清參加反應(yīng)，測(cè)583nm的光吸收（附圖3)。 對(duì)照組的光吸收值在21min內(nèi)一直很低，可以認(rèn)為液體培養(yǎng)基（LB Amp IPTG)對(duì)檢測(cè)無(wú)干 擾。
[0018] 實(shí)施例4 :固體培養(yǎng)基上的D-阿洛糖的生產(chǎn)菌的篩選 步驟：在固體培養(yǎng)基LB(含抗生素 Amp和IPTG)表面覆蓋一層滅過(guò)菌的硝酸纖維素 薄膜，并在薄膜上涂布含有待篩選L-鼠李糖異構(gòu)酶及其突變體的大腸桿菌，待單菌落長(zhǎng)出 后，將膜揭下置于一干凈的培養(yǎng)皿中；預(yù)制溶融狀態(tài)的含DAB、轉(zhuǎn)化底物D-阿洛酮糖、吡喃 糖氧化酶和過(guò)氧化物酶的顯色膠，覆蓋到長(zhǎng)有單菌落的硝酸纖維素薄膜上冷凝，至于37°C 的培養(yǎng)箱中實(shí)時(shí)觀測(cè)上述膜上各菌落生產(chǎn)D-阿洛糖的進(jìn)程(附圖4)。
[0019] 實(shí)施例5 :液體反應(yīng)體系中篩D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶和L-鼠李糖異構(gòu)酶的 雙酶共表達(dá)工程菌 步驟：構(gòu)建D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶和L-鼠李糖異構(gòu)酶的雙酶共表達(dá)工程菌，以 D-果糖為底物，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿洛糖。將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)含有待篩選D-阿洛酮糖-3-差 向異構(gòu)酶和L-鼠李糖異構(gòu)酶的雙酶共表達(dá)工程菌，將得到的單菌落轉(zhuǎn)接到含有液體培養(yǎng) 基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)和底物100g/L的D-果糖的96深孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔接種 一個(gè)單菌落，用硅膠蓋蓋好，37°C培養(yǎng)12小時(shí)；將96深孔培養(yǎng)板離心，取上清液50 μ L轉(zhuǎn)入 96孔板中，加入含HSDA、4-安替比林的溶液Α以及含吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶的溶液， 37°C保溫20分鐘，再在583nm測(cè)光吸收。對(duì)照組用液體培養(yǎng)基（LB添加抗生素 Amp、IPTG 和100g/L的D-果糖)代替培養(yǎng)液上清參加反應(yīng)，測(cè)583nm的光吸收（附圖5)。對(duì)照組的光 吸收值在21min內(nèi)一直很低，可以認(rèn)為液體培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。
[0020] 附圖表說(shuō)明： 附圖1 :D-阿洛糖（D-all〇se)和D-阿洛酮糖（D-psicose)吸光隨時(shí)間變化的曲線 附圖2 :雙酶偶聯(lián)法檢測(cè)D-阿洛糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線 附圖3 :液體培養(yǎng)基（LB Amp IPTG)的吸光值隨時(shí)間的變化曲線 附圖4 :固體培養(yǎng)基上的D-阿洛糖的生產(chǎn)菌的篩選 附圖5 :液體培養(yǎng)基（LB Amp IPTG D-果糖100g/L)的吸光值隨時(shí)間的變化曲線。
【權(quán)利要求】
1. 一種利用吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶偶聯(lián)反應(yīng)的檢測(cè)D-阿洛糖的高通量篩選新方 法，當(dāng)用于液體培養(yǎng)基時(shí)，步驟如下： (1) 將單菌落或純化后的酶轉(zhuǎn)入含轉(zhuǎn)化底物的96深孔培養(yǎng)板中； (2) 將96深孔培養(yǎng)板利用冷凍離心機(jī)在合適的條件下離心，取其上清液進(jìn)行測(cè)定； (3) 利用雙酶偶聯(lián)的方法，在96孔板板中結(jié)合試劑A測(cè)定上述上清液中D-阿洛糖的含 量。
2. -種利用吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶偶聯(lián)反應(yīng)的檢測(cè)D-阿洛糖的高通量篩選新方 法，當(dāng)用于固體培養(yǎng)基時(shí)，步驟如下： (1) 將菌群涂布到固體培養(yǎng)基表面的硝酸纖維素薄膜上，待單菌落長(zhǎng)出后，將膜揭下置 于一干凈的培養(yǎng)皿中； (2) 預(yù)制溶融狀態(tài)的含試劑B、轉(zhuǎn)化底物以及雙酶的顯色膠，接著覆蓋到長(zhǎng)有菌落的硝 酸纖維素薄膜上冷凝，利用雙酶偶聯(lián)的方法實(shí)時(shí)觀測(cè)上述膜上各菌落生產(chǎn)D-阿洛糖的進(jìn) 程。
3. 按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是：所述的雙酶是吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶。
4. 按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是：結(jié)合試劑A是4-氨替比林和HSDA的磷酸 鹽緩沖溶液(包括但并不局限于)。
5. 按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是：待試劑A、吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶的雙 酶以及樣品加入到深孔板中后，37°C下反應(yīng)20min。
6. 按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是：所述的測(cè)定條件為：在583nm波長(zhǎng)下測(cè)光吸 收(包括但并不局限于)。
7. 按權(quán)利要求2中所述的方法，其特征是：所述的雙酶是吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶。
8. 按權(quán)利要求2中所述的方法，其特征是：結(jié)合試劑B是DAB的磷酸鹽緩沖溶液(包括 但并不局限于)。
9. 按權(quán)利要求2中所述的方法，其特征是：待試劑、吡喃糖氧化酶和過(guò)氧化物酶的雙酶 以及樣品加入到深孔板中后，37°C下反應(yīng)l_24h。
【文檔編號(hào)】C12Q1/28GK104195219SQ201410472672
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】柏瑋, 朱玥明, 李星碩, 門(mén)燕, 孫媛霞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所