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      一種用于快速檢測人類cyp2c19基因多態(tài)性的試劑盒及其使用方法

      文檔序號:487402閱讀:424來源:國知局
      一種用于快速檢測人類cyp2c19基因多態(tài)性的試劑盒及其使用方法
      【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測技術(shù)中的基因檢測技術(shù),具體涉及一種用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及其使用方法。本發(fā)明所述試劑盒包括3對引物、3條探針、6條PNA序歹[I,1對13-Actin內(nèi)標(biāo)引物及1條內(nèi)標(biāo)探針,還包括Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH20。利用本發(fā)明試劑盒能夠?qū)YP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行定性檢測,根據(jù)SNP位點(diǎn)進(jìn)行兩管PNA-PCR熒光擴(kuò)增反應(yīng),只需根據(jù)兩管熒光曲線是否起線就能進(jìn)行結(jié)果判斷,不會產(chǎn)生人為誤差,假陽性和假陰性率低;本發(fā)明試劑盒更容易實(shí)現(xiàn)高通量檢測,更能滿足臨床使用。
      【專利說明】-種用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及其 使用方法

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測技術(shù)中的基因檢測技術(shù),具體涉及一種用于快 速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及其使用方法。

      【背景技術(shù)】
      [0002] 細(xì)胞色素?450化7丨〇(*1'〇1116?450,0¥?450)是由一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族 基因(Superfamily gene)編碼的同工酶,對于人類,其主要存在于肝細(xì)胞微粒體中。在 CYP450超家族中,CYP2是最大的家族,有15個亞家族(CYP2A到2Q),它們代謝約20 %目前 臨床使用的藥物,其中CYP2A、CYP2C、CYP2D和CYP2E均具有遺傳多態(tài)性和種族差異。人的 肝臟中CYP2C約占20%,現(xiàn)已克隆出CYP2C8、2C9/10、2C18和2C19。近年來CYP450的基因 型與不同個體的藥物代謝酶活性的相關(guān)性研究有很大進(jìn)展,通過檢測編碼相關(guān)藥物代謝酶 的基因型來判斷不同個體對藥物的代謝以及藥效、不良反應(yīng)情況,從而指導(dǎo)用藥,達(dá)到個體 化醫(yī)療的目的。
      [0003] 研究表明,CYP2C19對藥物代謝的能力隨著等位基因的不同組合而呈現(xiàn)出一定 的規(guī)律性,表現(xiàn)為:正?;蚣兒献印嫡;蚺c突變基因雜合子〉突變基因純合子或雜 合子,即通常所說的基因劑量效應(yīng)。CYP2C19*1/*1野生純合子代表的是強(qiáng)代謝者(EM), CYP2C19*2/*2或CYP2C19*3/*3突變純合子代表的是弱代謝者(PM), CYP2C19*l/*2或 CYP2C19*l/*3雜合子代表的是中間代謝者(IM),即雜合子強(qiáng)代謝者,CYP2C19*1/*17或 CYP2C19*17/*17代表的是超快代謝者(UM)。這些代謝類型的不同會造成藥物體內(nèi)不同的 代謝速率,造成不同的藥效。因此根據(jù)CYP2C19基因型來判斷不同個體對藥物的代謝以及 藥效、不良反應(yīng)情況,從而指導(dǎo)用藥,達(dá)到個體化醫(yī)療的目的。
      [0004] 目前,用于基因分型的檢測方法分為四類:測序法,聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長 度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)、芯片法、熒光定量PCR法(qPCR)四種方法。
      [0005] 測序法:先進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到含有目的SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物,然后純化PCR產(chǎn)物, 再對其進(jìn)行測序,根據(jù)測序峰圖判讀基因型。優(yōu)點(diǎn):結(jié)果準(zhǔn)確,測序法是基因多態(tài)性位點(diǎn)檢 測的金標(biāo)準(zhǔn)。但是其成本較高,操作繁瑣,試驗周期長,限制了其在臨床使用。
      [0006] PCR-RFLP技術(shù):先進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到含有目的SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物,然后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切,電泳檢測酶切條帶,根據(jù)酶切條帶進(jìn)行判讀。優(yōu)點(diǎn):成本低,結(jié)果比較直觀; 缺點(diǎn):有的多態(tài)性位點(diǎn)所在位置沒有合適的限制性酶切位點(diǎn),需要人工引入突變,另外容易 造成產(chǎn)物污染,導(dǎo)致假陽性結(jié)果,同時操作繁瑣,試驗周期長。
      [0007] 芯片法:先進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到含有目的SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物,然后將PCR產(chǎn)物與 突變探針、野生探針雜交,通過比較兩個探針雜交的信號強(qiáng)度判斷樣品基因型。缺點(diǎn)=PCR 產(chǎn)物需要進(jìn)行后續(xù)分析,操作繁瑣;另外結(jié)果不好判讀,容易出現(xiàn)假陽性。
      [0008] qPCR法:又分為ARMS-PCR法、HRM法和Taqman探針法。qPCR的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單, 試驗周期短,PCR產(chǎn)物無需進(jìn)行后續(xù)分析即可判斷結(jié)果,因全過程在封閉的管內(nèi)進(jìn)行,減少 產(chǎn)物交叉污染。同時該方法操作簡單,檢測周期短。目前該方法已成為臨床常用的檢測方 法。
      [0009] ARMS-PCR法又叫等位基因特異PCR,TaqDNA聚合酶缺少3' - 5'外切酶活性,在 一定條件下PCR引物3'末端的錯配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少,針對不同的已知突變,分別設(shè)計 突變引物、野生引物,2個引物主要是3'末端堿基不同。由于3'末端不配對的引物產(chǎn)物量 減少或不擴(kuò)增,突變引物和野生引物的Ct值會有顯著差異,通過設(shè)定區(qū)分野生型和突變型 的閾值,當(dāng)突變引物與野生引物Ct值差值(ACt)大于閾值時即為突變型。缺點(diǎn):引物設(shè)計 困難,對于多態(tài)性位點(diǎn)還有大量GC或AT序列時,往往束手無策,同時結(jié)果判斷較為困難。
      [0010] HRM法:高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melting,HRM),有染料法 和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)雙探針法等。染料法對熒光染料、PCR儀器要求較高,臨床檢 測比較少用。FRET (fluorescence resonance energy transfer, FRET)探針比較常用,羅氏 專利的FRET探針又稱為雙雜交探針。在SNP位點(diǎn)設(shè)計兩條FRET探針,當(dāng)兩條探針和模版 互補(bǔ)、且相鄰的特異探針組成,上游探針的3'端標(biāo)記供體熒光基團(tuán),相鄰下游探針的5' 端標(biāo)記Red640受體熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時,兩探針同時結(jié)合在模板上,供體基團(tuán)和Red640受 體基團(tuán)緊密相鄰,激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被Red640基團(tuán)吸收,使得檢測探頭可以檢測到 Red640發(fā)出波長為640的熒光。當(dāng)變性時,兩探針游離,兩基團(tuán)距離遠(yuǎn),不能檢測到640波 長的熒光。FRET探針檢測的信號是退火時的實(shí)時信號,每次檢測信號始終嚴(yán)格對應(yīng)模版的 數(shù)量,非累積信號,可以用于做Tm曲線進(jìn)行SNP檢測。優(yōu)點(diǎn):一個SNP位點(diǎn)基因型,只需要 一管PCR完成檢測;缺點(diǎn):根據(jù)HRM溶解曲線Tm值差異不容易判讀,不同基因型溶解曲線峰 圖差異不明顯。
      [0011] MGB-Taqman探針法:Taqman探針是一種經(jīng)典的定量PCR技術(shù),現(xiàn)階段得到廣泛應(yīng) 用,在PCR反應(yīng)體系中加入一對引物的和一個特異性熒光探針,探針只與兩條引物之間特 異性模板結(jié)合,利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR過程。探針的5'端連接報告熒光,3' 端連接淬滅熒光,隨后進(jìn)行實(shí)時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交,則在PCR用引物延伸 時,TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下,淬滅 熒光不再能對報告熒光進(jìn)行抑制,使得報告熒光發(fā)光。針對SNP位點(diǎn)分別設(shè)計兩個不同熒 光標(biāo)記突變探針、野生探針,根據(jù)突變探針、野生探針熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行SNP位點(diǎn)基因型判 讀。缺點(diǎn)=Taqman探針需要采用MGB-Taqman探針,當(dāng)SNP位點(diǎn)的上游和下游含有大量GC或 AT堿基時,MGB-Taqman探針的設(shè)計和合成非常困難,且價格非常昂貴。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0012] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,目的在于提供一種用于快速檢測人類CYP2C19基因 多態(tài)性的試劑盒及其使用方法,本發(fā)明提供的是一種基于PNA-PCR方法的基因多態(tài)性檢測 試劑盒,該試劑盒成本低廉、操作簡單、特異性和敏感性好,能夠快速靈敏地檢測待測位點(diǎn) 基因類型,從而準(zhǔn)確對人類CYP2C19基因多態(tài)性進(jìn)行基因分型。
      [0013] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
      [0014] 一種用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒,包括3對引物、3條探針、6 條PNA序列,1對P-Actin內(nèi)標(biāo)引物及1條內(nèi)標(biāo)探針序列,具體的包括:
      [0015] 用于檢測CYP2C19基因681G的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示,探針序列如 SEQ NO. 7所示,PNA序列如SEQ NO. 10所示;
      [0016] 用于檢測CYP2C19基因681A的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示,探針序列如 SEQ NO. 7所示,PNA序列如SEQ NO. 11所示;
      [0017] 用于檢測CYP2C19基因836G的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示,探針序列如 SEQ NO. 8所示,PNA序列如SEQ NO. 12所示;
      [0018] 用于檢測CYP2C19基因836A的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示,探針序列如 SEQ NO. 8所示,PNA序列如SEQ NO. 13所示;
      [0019] 用于檢測CYP2C19基因-806C的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示,探針序列 如SEQ NO. 9所示,PNA序列如SEQ NO. 14所示;
      [0020] 用于檢測CYP2C19基因-806T的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示,探針序列 如SEQ NO. 9所示,PNA序列如SEQ NO. 15所示;
      [0021] 用于P -Actin內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增的引物序列如SEQ NO. 16、SEQ NO. 17所示,內(nèi)標(biāo)探針序列 如SEQ NO. 18所示。
      [0022] 按上述方案,所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒還包括Mg2+ 的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和CldH 2O。
      [0023] 按上述方案,所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒還包括6個 陽性對照品和1個陰性對照品,所述陽性對照品為包含有CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)681G、 681A、836G、836A、-806C或-806T的重組質(zhì)粒和包含有內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒的混合物,所述 陰性對照品為不包含內(nèi)標(biāo)基因和目的基因位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
      [0024] 按上述方案,所述3條探針為Taqman探針,探針5'端的熒光基團(tuán)為FAM,3'端的 淬滅基團(tuán)為BHQl。
      [0025] 按上述方案,所述1條內(nèi)標(biāo)探針為Taqman探針,探針5'端的突光基團(tuán)為R0X,3' 端的淬滅基團(tuán)為BHQl。
      [0026] 一種用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法,包括如下步 驟:(1)提取待測人的基因組DNA作為檢測樣品;
      [0027] (2)取1個PCR8聯(lián)管,在其中A?F 6個管中分別加入檢測樣品,另取一個PCR8 聯(lián)管,在A?F 6個管中分別加入6個不同的陽性對照品,再取一個PCR8聯(lián)管,在A?F 6 個管中分別加入陰性對照品;
      [0028] (3)將PCR8聯(lián)管置于熒光PCR儀器中進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng),采集FAM和ROX熒 光信號;
      [0029] (4)結(jié)果判斷:a.當(dāng)陽性對照管均有FAM和ROX熒光信號起線,陰性對照管均無 FAM和ROX熒光信號起線,檢測樣品管均有ROX熒光信號起線時,判斷試驗成功;b.根據(jù)檢 測樣品管A和B的FAM熒光信號是否起線判斷CYP2C19基因681的分型,根據(jù)檢測樣品管 C和D的FAM熒光信號是否起線判斷CYP2C19基因836的分型,根據(jù)檢測樣品管E和F的 FAM熒光信號是否起線判斷CYP2C19基因-806的分型。
      [0030] 按上述方案,所述PCR8聯(lián)管中A和B管內(nèi)含有與檢測人類CYP2C19基因681分型 相關(guān)的PCR反應(yīng)液,所述C管和D管內(nèi)含有與檢測人類CYP2C19基因836分型相關(guān)的PCR反 應(yīng)液,所述E管和F管中含有與檢測人類CYP2C19基因-806分型相關(guān)的PCR反應(yīng)液,所述 PCR反應(yīng)液包含與檢測基因位點(diǎn)相對應(yīng)的引物、探針、PNA序列、內(nèi)標(biāo)引物及內(nèi)部探針、Taq 酶、dNTP混合液、Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液和ddH20。
      [0031] 按上述方案,所述陽性對照品為包含有CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)681G、681A、 836G、836A、-806C或-806T的重組質(zhì)粒和包含有內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒的混合物,所述陰性 對照品為不包含內(nèi)標(biāo)基因和目的基因位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
      [0032] 本發(fā)明試劑盒是基于PNA-PCR方法的基因多態(tài)性檢測試劑盒,其技術(shù)原理是:肽 核酸是(peptide nucleic acids,PNA) -類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它 是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上,通過計算機(jī)設(shè)計構(gòu)建并最終人工合成的第三代反 義試劑,是一種全新的DNA類似物,即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了 DNA 中的戊糖磷酸二酯鍵骨架,其余的與DNA相同,PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形 式識別并結(jié)合DNA或RNA序列,形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷,與DNA和 RNA之間不存在靜電斥力,因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高;不同于DNA或DNA、RNA 間的雜交,PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響,與DNA或RNA分子的雜 交能力遠(yuǎn)優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA,表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識別能力、 不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補(bǔ)DNA具有1個堿基不匹配時,其溶解溫度會下 降8°C?20°C,2個堿基不匹配時則完全不能雜交,當(dāng)PNA與互補(bǔ)DNA完全匹配時,因其PNA 為肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵,所以能夠阻止DNA擴(kuò)增。本試劑盒利用PNA的這些特性 進(jìn)行CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)分型,此處以CYP2C19基因681分型為例說明本發(fā)明試劑盒 的工作原理:首先根據(jù)CYP2C19基因681G設(shè)計PNA序列1 (序列如SEQ ID NO. 10所示), 根據(jù)CYP2C19基因681A設(shè)計PNA序列2(序列如SEQ ID NO. 11所示),然后對待測基因同 時進(jìn)行兩管PNA-PCR熒光PCR反應(yīng)(即在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時加入PNA序列),其中一管 PNA-PCR熒光PCR反應(yīng)中加入PNA序列1,另一管PNA-PCR熒光PCR反應(yīng)中加入PNA序列2, 當(dāng)PNA與待測基因的DNA序列相匹配時,熒光PCR反應(yīng)被阻斷,熒光PCR反應(yīng)無起線;當(dāng)PNA 與待測基因的DNA序列不相匹配時,熒光PCR反應(yīng)順利進(jìn)行,熒光PCR反應(yīng)有起線),因此可 以根據(jù)兩管熒光PCR反應(yīng)是否起線來判斷CYP2C19基因681的分型,所述分型為純合野生 型(僅一管PCR反應(yīng)起線)、雜合型(二管PCR反應(yīng)同時起線)或純合突變型(僅一管PCR 反應(yīng)起線)。
      [0033] 本發(fā)明的有益效果:
      [0034] (1)利用本發(fā)明試劑盒能夠?qū)YP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行定性檢測,根據(jù)SNP位 點(diǎn)進(jìn)行兩孔PNA-PCR熒光擴(kuò)增反應(yīng),只需根據(jù)兩孔熒光曲線是否起線就能進(jìn)行結(jié)果判斷, 不會產(chǎn)生人為誤差,假陽性和假陰性率低,避免了傳統(tǒng)ARMS-PCR方法需要根據(jù)A ct值進(jìn)行 結(jié)果判斷,結(jié)果判定困難的缺點(diǎn);
      [0035] (2)本發(fā)明試劑盒所使用的熒光檢測探針為Taqman探針,該探針費(fèi)用低廉;同時 本發(fā)明所有的反應(yīng)全程閉管操作,PCR反應(yīng)后不需要進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化、電泳、酶切、雜交 等,在節(jié)省了檢測成本的同時,大大縮短了檢測周期,提高了檢測的效率,另外降低了 PCR 產(chǎn)物污染引起假陽性的風(fēng)險。
      [0036] (3)本發(fā)明試劑盒中包括內(nèi)標(biāo)引物和探針,通過檢測內(nèi)標(biāo)基因,減少了因樣本提取 問題導(dǎo)致的假陰性。
      [0037] (4)本發(fā)明中使用的PNA設(shè)計簡單,不需要進(jìn)行特殊的修飾就可以滿足CYP2C19基 因多態(tài)性檢測分析。
      [0038] (5)本發(fā)明試劑盒是采用PNA鉗夾熒光定量PCR技術(shù)平臺,相對于測序法、 PCR-RFLP、芯片法更容易實(shí)現(xiàn)高通量檢測,更能滿足臨床使用。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0039] 附圖1是CYP2C19基因681純合野生型擴(kuò)增曲線;
      [0040] 附圖2是CYP2C19基因681雜合型擴(kuò)增曲線;
      [0041] 附圖3是CYP2C19基因681純合突變型擴(kuò)增曲線;
      [0042] 附圖4是CYP2C19基因836純合野生型擴(kuò)增曲線;
      [0043] 附圖5是CYP2C19基因836雜合型擴(kuò)增曲線;
      [0044] 附圖6是CYP2C19基因836純合突變型擴(kuò)增曲線;
      [0045] 附圖7是CYP2C19基因-806純合野生型擴(kuò)增曲線;
      [0046] 附圖8是CYP2C9基因-806雜合型擴(kuò)增曲線;
      [0047] 附圖9是CYP2C9基因-806純合突變型擴(kuò)增曲線;
      [0048] 附圖10是內(nèi)標(biāo)P -Actin基因擴(kuò)增曲線。 具體實(shí)施方案
      [0049] 下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明,本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施,給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
      [0050] -種用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒,試劑盒中包括以下多態(tài)性 檢測的3對引物,3條探針、6條PNA序列、1對P-Actin內(nèi)標(biāo)引物和1條內(nèi)標(biāo)探針。

      【權(quán)利要求】
      1. 一種用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒,其特征在于,包括 3對引物、3條探針、6條PNA序列,1對P -Actin內(nèi)標(biāo)引物及1條內(nèi)標(biāo)探針,所述3對 引物的序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 6所示,所述3條探針的序列如SEQ ID NO. 7?SEQ ID NO. 9所示,所述6條PNA序列如SEQ ID NO. 10?15所示,所述1對0-Actin內(nèi)標(biāo)引物的 序列如SEQ ID NO. 16?SEQ ID NO. 17所示,所述1條內(nèi)標(biāo)探針的序列如SEQ ID NO. 18所 /Jn 〇
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒,其特征在 于,還包括Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH 20。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒,其特征在 于,還包括6個陽性對照品和1個陰性對照品,所述陽性對照品為包含有CYP2C19基因多態(tài) 性位點(diǎn)681G、681A、836G、836A、-806C或-806T的重組質(zhì)粒和包含有內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒的 混合物,所述陰性對照品為不包含內(nèi)標(biāo)基因和CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
      4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒,其特征在 于,所述3條探針為Taqman探針,探針5'端的熒光基團(tuán)為FAM,3'端的淬滅基團(tuán)為BHQl。
      5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒,其特征 在于,所述1條內(nèi)標(biāo)探針為Taqman探針,探針5'端的突光基團(tuán)為R0X,3'端的洋滅基團(tuán)為 BHQl 0
      6. 權(quán)利要求1所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法,其 特征在于,包括如下步驟: (1) 提取待測人的基因組DNA作為檢測樣品; (2) 取1個PCR8聯(lián)管,在其中A~F 6個管中分別加入檢測樣品,另取一個PCR8聯(lián)管, 在A~F 6個管中分別加入6個不同的陽性對照品,再取一個PCR8聯(lián)管,在A~F 6個管中分 別加入陰性對照品; (3) 將PCR8聯(lián)管置于熒光PCR儀器中進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng),采集FAM和ROX熒光信 號; (4) 結(jié)果判斷:a.當(dāng)陽性對照管均有FAM和ROX熒光信號起線,陰性對照管均無FAM和 ROX熒光信號起線,檢測樣品管均有ROX熒光信號起線時,判斷試驗成功;b.根據(jù)檢測樣品 管A和B的FAM熒光信號是否起線判斷CYP2C19基因681的分型,根據(jù)檢測樣品管C和D 的FAM熒光信號是否起線判斷CYP2C19基因836的分型,根據(jù)檢測樣品管E和F的FAM熒 光信號是否起線判斷CYP2C19基因-806的分型。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒的使用方 法,其特征在于,所述PCR8聯(lián)管中A和B管內(nèi)含有與檢測人類CYP2C19基因681分型相關(guān) 的PCR反應(yīng)液,所述C管和D管內(nèi)含有與檢測人類CYP2C19基因836分型相關(guān)的PCR反應(yīng) 液,所述E管和F管中含有與檢測人類CYP2C19基因-806分型相關(guān)的PCR反應(yīng)液,所述PCR 反應(yīng)液包含與檢測基因位點(diǎn)相對應(yīng)的引物、探針、PNA序列、內(nèi)標(biāo)引物及內(nèi)部探針、Taq酶、 dNTP混合液、Mg 2+的PCR反應(yīng)緩沖液和ddH20。
      8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于快速檢測人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒的使用 方法,其特征在于,所述陽性對照品為包含有CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)681G、681A、836G、 836A、-806C或-806T的重組質(zhì)粒和包含有內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒的混合物,所述陰性對照品 為不包含內(nèi)標(biāo)基因和目的基因位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
      【文檔編號】C12Q1/68GK104212904SQ201410473101
      【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
      【發(fā)明者】葉倫, 王寧, 劉金水, 李雪梅, 李倩, 陳剛 申請人:武漢康錄生物技術(shù)有限公司
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