重組酰胺酶Dt-Ami 2、編碼基因、載體、工程菌及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組酰胺酶Dt-Ami 2、編碼基因、載體、工程菌及應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種來源于代爾夫特菌Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的酰胺酶基因及其編碼的重組酰胺酶WB；該酰胺酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有重組酰胺酶，可以利用重組酰胺酶為催化劑催化系列酰胺化合物的水解。
【專利說明】重組酰胺酶Dt-Ami 2、編碼基因、載體、工程菌及應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酰胺酶及應(yīng)用，特別涉及一種重組酰胺酶Dt-Ami 2、編碼基因、含 有該基因的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及該酰胺酶或含有該酶的重組細(xì)胞為催化 劑在在催化一系列酰胺中的應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 酰胺酶（Amidase，EC 3. 5. 1. 4)能夠催化酰胺C-N鍵水解生成相應(yīng)的羧酸和氨。 當(dāng)反應(yīng)體系中存在比水更強(qiáng)的?；荏w如羥胺或肼時，則生成相應(yīng)的氧肟酸和酰肼。酰 胺酶底物范圍廣，對α位含手性中心的底物具有優(yōu)良的立體選擇性，在制備羧酸和酰胺 衍生物等手性化合物中具有巨大應(yīng)用潛力。酰胺酶已成功用于多個手性藥物中間體如 (S)-哌嗪-2-甲酸（US5945534)，（R)-3, 3, 3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸（US7553652)和 (5)-2,2-二甲基環(huán)丙甲酰胺（21^200510061680)的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0003] 根據(jù)氨基酸序列特征，酰胺酶可分為酰胺酶標(biāo)簽家族（Amidase Signature Family, AS)和腈水解酶家族（Nitrilase Family, NF)兩大類。AS家族酰胺酶的氨基酸 序列含有130個左右高度保守氨基酸區(qū)域，并含有催化三聯(lián)體Lys-Ser-Ser，作用底物范 圍較廣，可水解脂肪族、芳香族及雜環(huán)類酰胺，如來自Stenotrophomonas maltophilia和 Rattus norvegicus的酰胺酶。NF家族酰胺酶同源性很高，并含有Lys-Ser-Glu催化三聯(lián) 體，通常水解脂肪族醜胺，如來自 Pseudomonas aeruginosa，Bacillus stearothermophilu 和 Rhodococcus erythropolis 醜胺酶。
[0004] 生物催化劑的多樣性是生物催化反應(yīng)多樣性的前提和基礎(chǔ)。但是，目前已報道的 酰胺酶十分有限，這極大限制了酰胺酶在生物合成中的應(yīng)用。因此，挖掘和篩選底物譜廣、 立體選擇性嚴(yán)格的酰胺酶具有十分重要的意義。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種來源于代爾夫特菌Delftia tsuruhatensis ZJB-05174 的酰胺酶Dt-Ami 2基因及其重組酰胺酶Dt-Ami 2,以及含有該基因的重組表達(dá)載體，重組 表達(dá)轉(zhuǎn)化體，該重組酶Dt-Ami 2的制備方法及該酰胺酶Dt-Ami 2的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明涉及一種來源于代爾夫特菌（Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174的重組 酰胺酶Dt-Ami 2,所述酰胺酶Dt-Ami 2的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明所述酰胺酶Dt-Ami 2通過基因挖掘的方法獲得，所設(shè)計的挖掘方法具體 為根據(jù)AS家族及NF家族酰胺酶保守序列，有針對性地尋找NCBI收錄的基因編碼的氨基酸 序列，進(jìn)一步篩選可匹配催化三聯(lián)體的蛋白。選定一批預(yù)測的酰胺酶，將所選的酰胺酶進(jìn)行 克隆表達(dá)，構(gòu)建重組大腸桿菌細(xì)胞。通過本實(shí)驗室發(fā)明的方法（ZL200510062182)進(jìn)行酰胺 酶活力的篩選，最終獲得催化性能較佳的重組酰胺酶Dt-Ami 2。
[0009] 本發(fā)明所述重組酰胺酶Dt-Ami 2來源于代爾夫特菌（Delftia tsuruhatensis) ZJB-05174,該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No. M 205115,保藏 日期為2005年10月10日，已在先前的專利申請（申請?zhí)枮镃N 200510061680)中披露。 [0010] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO :2所示氨基酸序列的多肽的片段或 其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨 基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基 酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有 與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改 變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0011] 本發(fā)明提供一種所述重組酰胺酶Dt-Ami 2在水解酰胺制備羧酸中的應(yīng)用，所述 的應(yīng)用為：將含重組酰胺酶Dt-Ami 2基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液（優(yōu)選Tris-HCl緩沖液（20 mM咪唑，pH 8.0))懸浮后進(jìn)行超聲破碎，取 上清液提取純酶作為催化劑，以式（I )所示化合物、式（II )所示化合物、2, 2-二甲基環(huán) 丙甲酰胺、色氨酰胺或2-氨基-4-甲硫基丁酰胺為底物，以pH 6?9的Tris-HCl緩沖液 作為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在25?45°C下進(jìn)行水解反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液分離純 化，獲得羧酸產(chǎn)物；
[0012]

【權(quán)利要求】
1. 一種來源于代爾夫特菌（Delftia tsuruhatensis)ZJB_05174的重組酰胺酶Dt-Ami 2,其特征在于所述酰胺酶Dt-Ami 2的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
2. -種權(quán)利要求1所述重組酰胺酶Dt-Ami 2在水解酰胺制備羧酸中的應(yīng)用，其特征在 于所述的應(yīng)用為：將含重組酰胺酶Dt-Ami 2基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液懸浮后進(jìn)行超聲破碎，取上清液提取純酶作為催化劑，以式（I )所示 化合物、式（II )所示化合物、2, 2-二甲基環(huán)丙甲酰胺、色氨酰胺或2-氨基-4-甲硫基丁酰 胺為底物，以pH 6?9的Tris-HCl緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在25?45°C下進(jìn)行 水解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得羧酸產(chǎn)物；
式（I )中札為C1?C4烷基，R2為氫、羥基或甲基；式（II )中R3為苯基、芐基、對 羥基芐基或苯乙基。
3. 如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述催化劑的用量以破碎前濕菌體重量計為 0. 08?8 g/L反應(yīng)體系，所述底物初始濃度為20 mmol/L反應(yīng)體系。
4. 如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述底物為丙酰胺、正丁酰胺、異丁酰胺、戊酰 胺、己酰胺、（S)-乳酰胺、（R)-乳酰胺、苯甲酰胺、苯乙酰胺、4-羥基苯乙酰胺、苯丙酰胺、 2, 2-二甲基環(huán)丙甲酰胺、色氨酰胺或2-氨基-4-甲硫基丁酰胺。
5. 如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：將含重組酰胺酶 Dt-Ami 2的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體用pH 8. 0 Tris-HCl緩沖液懸浮后進(jìn)行超聲 破碎，將破碎混合液離心，取上清液進(jìn)行Ni-NTA柱層析，以洗脫緩沖液洗脫，收集目標(biāo)蛋 白，將收集的目標(biāo)蛋白在20 mM，pH8. 0的Tris-HCl中透析過夜，取透過液即獲得催化劑；所 述洗脫緩沖液為含終濃度500 mM咪唑和終濃度500 mM NaCl的20 mM、pH 8. 0 Tris-HCl 的緩沖液。
6. -種編碼權(quán)利要求1所述重組酰胺酶Dt-Ami 2的基因。
7. 如權(quán)利要求6所述編碼基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
8. -種由權(quán)利要求6所述編碼基因構(gòu)建的重組載體。
9. 一種含權(quán)利要求6所述編碼基因或權(quán)利要求8所述重組載體的基因工程菌。
10. -種權(quán)利要求6所述編碼基因在構(gòu)建能夠生物催化酰胺制備羧酸的重組酰胺酶 Dt-Ami 2中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有所述重組酰胺酶Dt-Ami 2基因的 重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng) 液分離純化獲得含有重組酰胺酶Dt-Ami 2的菌體細(xì)胞。
【文檔編號】C12P7/44GK104293752SQ201410481925
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】鄭裕國, 吳哲明, 鄭仁朝, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)