一種高效生產(chǎn)n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高效生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述基因工程菌是將大腸桿菌的染色體缺失nagDCABE基因簇并整合分別由T7啟動(dòng)子和Trc啟動(dòng)子介導(dǎo)的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突變基因和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因串聯(lián)基因表達(dá)盒獲得，其中，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突變基因是由大腸桿菌W3110菌株來(lái)源的野生型6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因突變成A38T/R249C/G471S突變體獲得。本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌具有N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)量高、菌種穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。
CCTCC NO.M 2014383
2014.08.14
【專利說(shuō)明】一種高效生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種高效生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的 基因工程菌。

【背景技術(shù)】
[0002] N-乙酰氨基葡萄糖（N-Acetylglucosamine，GlcNAc),又名 2-乙酰胺-2-脫 氧-D-葡萄糖（2-Acetamido_2-Deoxy-D-Dlucose)，分子式：C8H 15N06,分子量：221. 0,烙點(diǎn)： 205°C，白色結(jié)晶粉末，易溶于水，結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0003]

【權(quán)利要求】
1. 一種高效生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是將 大腸桿菌的染色體缺失nagDCABE基因簇并整合分別由T7啟動(dòng)子和Trc啟動(dòng)子介導(dǎo)的6-磷 酸氨基葡萄糖合成酶突變基因和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因串聯(lián)基因表達(dá)盒獲得，其 中，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶突變基因是由大腸桿菌W3110菌株來(lái)源的野生型6-磷 酸氨基葡萄糖合成酶基因突變成A38T/R249C/G471S突變體獲得。
2. 如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌 W3110(DE3)菌株。
3. 如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因 來(lái)源自釀酒酵母。
4. 如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述T7啟動(dòng)子來(lái)源自pET-28a (+)質(zhì) 粒，所述Trc啟動(dòng)子來(lái)源自pTrc99a質(zhì)粒。
5. 如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述T7啟動(dòng)子介導(dǎo)的6-磷酸氨基葡 萄糖合成酶突變基因和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因串聯(lián)基因表達(dá)盒整合于大腸桿菌染 色體的fuel基因內(nèi)。
6. 如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述Trc啟動(dòng)子介導(dǎo)的6-磷酸氨基 葡萄糖合成酶突變基因和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因串聯(lián)基因表達(dá)盒整合于大腸桿菌 染色體的yabp基因內(nèi)。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的保藏 號(hào)為 CCTCC M2014383。
8. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的基因工程菌的應(yīng)用，其特征在于，用于發(fā)酵生產(chǎn) N-乙酰氨基葡萄糖。
9. 如權(quán)利要求7所述的基因工程菌的應(yīng)用，其特征在于，用于發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰氨基葡 萄糖。
10. 如權(quán)利要求8所述的基因工程菌的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵的條件如下： 種子培養(yǎng)基：ΚΗ2Ρ04 0· 6% (w/v)，Κ2ΗΡ04 · 3Η203· 145% (w/v)，檸檬酸鈉· 2Η200· 1 % (w/v)，硫酸銨 1 % (w/v)，MgS04 .71^00.061% (w/v)，CaCl2 0.003% (w/v)，葡萄糖 2 % (w/ v)，微量元素母液0.01% (v/v); 發(fā)酵培養(yǎng)基：ΚΗ2Ρ04 0· 667% (w/v)，一水檸檬酸 0· 355% (w/v)，MgS04 ·7Η200· 25% (w/ v)，CaCl2 · Η200· 0025% (w/v)，葡萄糖 0· 5% (w/v)，消泡劑 0· 025% (w/v)，微量元素母液 0. 01 % (v/v)； 其中，所述微量元素母液：CoCl2 · 6Η200· 1% (w/v)，Η3Β03 (λ 1% (w/v)，F(xiàn)eS04 · 7H205% (w/v), MnS04 · H200. 33 % (w/v), ZnS04 · 7H203. 8 % (w/v), NaMo04 2H20. 0. 1 % (w/v), C〇S04 · 5H200. 1 % (w/v)； 發(fā)酵溫度37°C，攪拌速度300?800rpm，通氣量1?3V/V. M。
11. 如權(quán)利要求9所述的基因工程菌的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵的條件如下： 種子培養(yǎng)基：ΚΗ2Ρ04 0· 6% (w/v)，Κ2ΗΡ04 · 3Η203· 145% (w/v)，檸檬酸鈉· 2Η200· 1 % (w/v)，硫酸銨 1 % (w/v)，MgS04 .71^00.061% (w/v)，CaCl2 0.003% (w/v)，葡萄糖 2 % (w/ v)，微量元素母液0.01% (v/v); 發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2P04 0· 667% (w/v)，一水檸檬酸 0· 355% (w/v)，MgS04 ·7Η200· 25% (w/ V)，CaCl2 · Η200· 0025% (w/v)，葡萄糖 0· 5% (w/v)，消泡劑 0· 025% (w/v)，微量元素母液 0. 01 % (v/v)； 其中，所述微量元素母液：CoCl2 · 6Η200· 1% (w/v)，Η3Β03 (λ 1% (w/v)，F(xiàn)eS04 · 7H205% (w/v), MnS04 · H200. 33 % (w/v), ZnS04 · 7H203. 8 % (w/v), NaMo04 · 2H200. 1 % (w/v), C〇S04 · 5H200. 1 % (w/v)； 發(fā)酵溫度37°C，攪拌速度300?800rpm，通氣量1?3V/V. M。
【文檔編號(hào)】C12P19/26GK104293724SQ201410486778
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】陶榮盛, 朱傅赟, 楊晟, 范文超, 柳鵬福, 陳成, 王祎, 沈正權(quán), 丁鵬, 蔣宇 申請(qǐng)人:上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心, 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心