一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的培養(yǎng)基、制備方法及篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的培養(yǎng)基，配方包括如下組分：酵母提取物、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化鈣、硫酸銨、葡萄糖、氯化血紅素、輔酶I、和或瓊脂；制備用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株培養(yǎng)基的方法包括稱量、制備A液、制備B液和混合；通過多次在固體和液體培養(yǎng)基上傳代生長篩選具有莢膜的高產(chǎn)菌株。本發(fā)明培養(yǎng)基不含有動物血液和動物來源的蛋白成分，避免了潛在的風(fēng)險，提高了疫苗的安全性；培養(yǎng)基的制備方法具有操作簡單、制備方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明的篩選方法解決了Hib疫苗規(guī)?；a(chǎn)的菌種篩選問題，大大提高了Hib莢膜多糖產(chǎn)量，提高了工作效率、降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】-種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的培養(yǎng)基、制備方法及篩 選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的培養(yǎng)基、 制備方法及篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] B型流感嗜血桿菌（Hib)是流感嗜血桿菌中具有極強(qiáng)侵襲力的一種，在流感嗜血 桿菌引起的嚴(yán)重感染中，幾乎90%是由B型引起的，主要引起腦膜炎、肺炎、心包炎、關(guān)節(jié) 炎、菌血癥、會厭炎等疾病，該病使15%至35%的存活者患有終身殘疾，典型的病癥有精神 發(fā)育遲滯或耳聾。B型流感嗜血桿菌引起的腦膜炎、肺炎是導(dǎo)致精神發(fā)育遲滯或耳聾。B型 流感嗜血桿菌引起的腦膜炎、肺炎是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的主要原因。多年流行病學(xué)研究表明， 使用Hib疫苗是控制Hib侵襲性疾病的有效措施。
[0003] 莢膜是B型流感嗜血桿菌菌株的毒性的主要因素，它是由一系列的核糖基核糖 醇磷酸酯（PRP)的重復(fù)單元組成的多糖。B型流感嗜血桿菌群落（Population)常常是 不均質(zhì)的，有莢膜的細(xì)菌與無莢膜的細(xì)菌菌株共存。有莢膜的B型流感嗜血桿菌會在自 發(fā)地發(fā)生遺傳突變后喪失了表達(dá)該莢膜的能力。根據(jù)Hoiseth等人（Infectious and Immunity (1985) ,49:389-395)的研究，在每一細(xì)菌代中以0. 1-0. 3%的頻率發(fā)生莢膜表達(dá) 的缺失。以PRP或通過共價健連接于載體蛋白質(zhì)上的PRP為基礎(chǔ)的疫苗用于防止b型流感 嗜血桿菌感染。為了制造這些疫苗，需要在大體積的培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量的細(xì)菌，從該發(fā)酵液 分離，純化PRP。然而，有莢膜的b型流感嗜血菌株突變到無莢膜形式的容易性可構(gòu)成了 PRP 產(chǎn)生的難題，因此，如何篩選出高產(chǎn)Hib疫苗菌株成為本領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含有動物血液和動物來源的蛋白成分，避免了潛在的風(fēng)險，提高了疫苗 的安全性；
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的培養(yǎng)基的制備方 法，該方法具有操作簡單、制備方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)；
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用此培養(yǎng)基篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的方法，該 方法解決了 Hib疫苗規(guī)?；a(chǎn)的菌種篩選問題，大大提高了 Hib莢膜多糖產(chǎn)量，提高了工 作效率、降低了生產(chǎn)成本。
[0007] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的培養(yǎng) 基，所述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基，其中，固體培養(yǎng)基的配方包括如下組分：相對 于溶劑用量為IOOOml的量，還含有酵母提取物10?20g、磷酸氫二鈉3?28. 65g、磷酸二 氫鈉0? 94?3. 12g、60%乳酸鈉溶液0? 5?I. 5ml、氯化鎂0? 2?0? 6g、二水氯化鈣0? 01? 0? 04g、硫酸銨0? 5?lg、葡萄糖10?20g、氯化血紅素10?20mg、輔酶IlO?20mg、瓊脂 10?15g，調(diào)pH至6. 5?7. 5,所述溶劑為水；
[0008] 液體培養(yǎng)基的配方包括如下組分：相對于溶劑用量為IOOOml的量，還含有酵母提 取物10?20g、磷酸氫二鈉3?28. 65g、磷酸二氫鈉0. 94?3. 12g、60%乳酸鈉溶液0. 5? I. 5ml、氯化鎂0. 2?0. 6g、二水氯化鈣0. 01?0. 04g、硫酸銨0. 5?lg、葡萄糖10?20g、 氯化血紅素10?20mg、輔酶IlO?20mg，調(diào)pH至6. 5?7. 5,所述溶劑為水。
[0009] -種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株培養(yǎng)基的制備方法，所述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基， 制備方法包括以下步驟：
[0010] SI.稱量：按上述固體培養(yǎng)基配方比例稱取各組分原料，備用；
[0011] S2.制備 A 液：
[0012] S21.超濾：將酵母提取物、葡萄糖用蒸餾水稀釋，用截留分子量為IOKD的膜包進(jìn) 行超濾，收集超濾液；
[0013] S22.除菌：超濾液中加入氯化血紅素和輔酶I，用孔徑為0. 2i!m的膜過濾除菌，除 菌后置于2?8°C的溫度下保存；
[0014] S3.制備B液：將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化鈣、 硫酸銨和瓊脂混合均勻后高溫高壓滅菌；
[0015] S4.混合：待B液冷卻至55?60°C時加入A液，制得固體培養(yǎng)基；
[0016] 所述培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，制備方法包括以下步驟：
[0017] (1)稱量：按上述液體培養(yǎng)基配方比例稱取各組分原料，備用；
[0018] ⑵制備A液：
[0019] A.超濾：將酵母提取物、葡萄糖用蒸餾水稀釋后，用截留分子量為IOKD的膜包進(jìn) 行超濾，收集超濾液；
[0020] B.除菌：超濾液中加入氯化血紅素和輔酶I，用孔徑為0. 2i!m的膜過濾除菌，除菌 后置于2?8°C的溫度下保存；
[0021] (3)制備B液：將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化鈣 和硫酸銨混合均勻后高溫高壓滅菌；
[0022] (4)混合：使用前，將制備的A液、B液混合均勻即可。
[0023] 進(jìn)一步地，所述酵母提取物稀釋液的濃度為90?110g/L，葡萄糖稀釋液的濃度為 180 ?220g/L。
[0024] 進(jìn)一步地，所述高溫高壓滅菌的滅菌溫度為118?125 °C，壓強(qiáng)為0.09? 0? 12MPa，滅菌時間為28?35min。
[0025] 利用上述培養(yǎng)基篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的方法，它包括以下步驟：
[0026] SI.將Hib主種子菌種開啟，吸取菌液3ml，接種于液體培養(yǎng)基中，36?37°C、 120?240rpm的條件下培養(yǎng)14?20h ;
[0027] S2.將SI的培養(yǎng)基靜置26?35min，吸取上清液至液體培養(yǎng)基中，36?37°C、 120?240rpm的條件下培養(yǎng)8?IOh ;
[0028] S3.將S2的培養(yǎng)基靜置26?35min，吸取上清液劃線接種于固體培養(yǎng)基上，在濃 度為10%的二氧化碳環(huán)境下36?37°C培養(yǎng)14?20h ;
[0029] S4.挑取固體培養(yǎng)基上的單顆菌落，分別接種于液體培養(yǎng)基中，36?37°C、120? 240rpm的條件下培養(yǎng)14?20h ;
[0030] S5.選擇S4中固體培養(yǎng)基上的零散菌體，再次接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為 10%的二氧化碳環(huán)境下36?37°C培養(yǎng)14?20h ;
[0031] S6.采集經(jīng)S5培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)基上的菌苔，懸浮于20?30 %的甘油生理鹽水， 懸浮后分裝，置于液氮中保存。
[0032] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的培養(yǎng)基，該培 養(yǎng)基不含有動物血液和動物來源的蛋白成分，避免了潛在的風(fēng)險，提高了疫苗的安全性；該 培養(yǎng)基的制備方法具有操作簡單、制備方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)；無莢膜的Hib菌株在本發(fā)明的 培養(yǎng)基中生長后會發(fā)生聚集沉淀，有莢膜的菌株在液體培養(yǎng)基中均勻生長，通過傳代達(dá)到 篩選具有莢膜的高產(chǎn)菌株，此篩選方法解決了 Hib疫苗規(guī)?；a(chǎn)的菌種篩選問題，大大 提高了 Hib莢膜多糖產(chǎn)量，提高了工作效率、降低了生產(chǎn)成本。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。
[0034] 實(shí)施例1 :制備培養(yǎng)基
[0035] -種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的固體培養(yǎng)基，配方包括如下組分：相對于溶劑 用量為IOOOml的量，還含有酵母提取物10g、磷酸氫二鈉3g、磷酸二氫鈉0. 94g、60%乳酸鈉 溶液0. 5ml、氯化鎂0. 2g、二水氯化I丐0. Olg、硫酸銨0. 5g、葡萄糖10g、氯化血紅素10mg、輔 酶IlOmg、瓊脂10g，調(diào)pH至6. 5,所述溶劑為水；
[0036] 上述固體培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：
[0037] SI.稱量：按上述固體培養(yǎng)基配方比例稱取各組分原料，備用；
[0038] S2?制備 A 液：
[0039] S21.超濾：將酵母提取物用蒸餾水稀釋至濃度為100g/L，葡萄糖用蒸餾水稀釋至 濃度為190g/L，用截留分子量為10KD的膜包進(jìn)行超濾，收集超濾液；
[0040] S22.除菌：超濾液中加入氯化血紅素和輔酶I，用孔徑為0. 2i!m的膜過濾除菌，除 菌后置于2°C的溫度下保存；
[0041] S3.制備B液：將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化鈣、 硫酸銨和瓊脂混合均勻后高溫高壓滅菌，所述滅菌的溫度為118°C，壓強(qiáng)為0. IMPa，滅菌 28min ；
[0042] S4.混合：待B液冷卻至55°C時加入A液，制得固體培養(yǎng)基；
[0043] 實(shí)施例2 :制備培養(yǎng)基
[0044] 一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的固體培養(yǎng)基，配方包括如下組分：相對于溶劑 用量為1000ml的量，還含有酵母提取物20g、磷酸氫二鈉28. 65g、磷酸二氫鈉3. 12g、60%乳 酸鈉溶液I. 5ml、氯化鎂0. 6g、二水氯化興0. 04g、硫酸銨lg、葡萄糖20g、氯化血紅素20mg、 輔酶I20mg、瓊脂15g，調(diào)pH至7. 5,所述溶劑為水；
[0045] 上述固體培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：
[0046] SI.稱量：按上述固體培養(yǎng)基配方比例稱取各組分原料，備用；
[0047] S2?制備 A 液：
[0048] S21.超濾：將酵母提取物用蒸餾水稀釋至濃度為90g/L，葡萄糖用蒸餾水稀釋至 濃度為180g/L，用截留分子量為10KD的膜包進(jìn)行超濾，收集超濾液；
[0049] S22.除菌：超濾液中加入氯化血紅素和輔酶I，用孔徑為0. 2pm的膜過濾除菌，除 菌后置于8°C的溫度下保存；
[0050] S3.制備B液：將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化鈣、 硫酸銨和瓊脂混合均勻后高溫高壓滅菌，所述滅菌的溫度為125°C，壓強(qiáng)為0. 09MPa，滅菌 35min ；
[0051] S4.混合：待B液冷卻至60°C時加入A液，制得固體培養(yǎng)基；
[0052] 實(shí)施例3 :制備培養(yǎng)基
[0053] -種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的液體培養(yǎng)基，配方包括如下組分：酵母提取物 14g、磷酸氫二鈉10g、磷酸二氫鈉I. 83g、60%乳酸鈉溶液0. 8ml、氯化鎂0. 3g、二水氯化鈣 0. 02g、硫酸銨0. 72g、葡萄糖14g、氯化血紅素12mg、輔酶I13mg，調(diào)pH至7,所述溶劑為水。
[0054] 上述液體培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：
[0055] (1)稱量：按上述液體培養(yǎng)基配方比例稱取各組分原料，備用；
[0056] (2)制備 A 液：
[0057] A.超濾：將酵母提取物用蒸餾水稀釋至濃度為110g/L，葡萄糖用蒸餾水稀釋至濃 度為220g/L，用截留分子量為IOKD的膜包進(jìn)行超濾，收集超濾液；
[0058] B.除菌：超濾液中加入氯化血紅素和輔酶I，用孔徑為0. 2pm的膜過濾除菌，除菌 后置于4°C的溫度下保存；
[0059] (3)制備B液：將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化 鈣和硫酸銨混合均勻后高溫高壓滅菌，所述滅菌的溫度為121°C，壓強(qiáng)為0. 12MPa，滅菌 30min ；
[0060] (4)混合：使用前，將制備的A液、B液混合均勻即可。
[0061] 實(shí)施例4:制備培養(yǎng)基
[0062] 一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的液體培養(yǎng)基，配方包括如下組分：酵母提取物 18g、磷酸氫二鈉22. 3g、磷酸二氫鈉2. 58g、60 %乳酸鈉溶液lml、氯化鎂0. 4g、二水氯化鈣 0. 03g、硫酸銨0. 8g、葡萄糖18g、氯化血紅素17mg、輔酶I18mg，調(diào)pH至7. 0,所述溶劑為水。
[0063] 上述液體培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟：
[0064] (1)稱量：按上述液體培養(yǎng)基配方比例稱取各組分原料，備用；
[0065] (2)制備 A 液：
[0066] A.超濾：將酵母提取物用蒸餾水稀釋至濃度為105g/L，葡萄糖用蒸餾水稀釋至濃 度為200g/L，用截留分子量為IOKD的膜包進(jìn)行超濾，收集超濾液；
[0067] B.除菌：超濾液中加入氯化血紅素和輔酶I，用孔徑為0. 2pm的膜過濾除菌，除菌 后置于6°C的溫度下保存；
[0068] (3)制備B液：將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化 鈣和硫酸銨混合均勻后高溫高壓滅菌，所述滅菌的溫度為118°C，壓強(qiáng)為0. llMPa，滅菌 32min ；
[0069] (4)混合：使用前，將制備的A液、B液混合均勻即可。
[0070] 實(shí)施例5 :篩選菌株
[0071] 培養(yǎng)基為實(shí)施例1-4制備的固體和液體培養(yǎng)基，篩選方法包括以下步驟：
[0072] SI.將Hib主種子菌種開啟，吸取菌液3ml，接種于液體培養(yǎng)基中，36°C、120rpm的 條件下培養(yǎng)14h ;
[0073] S2.將SI的培養(yǎng)基靜置26min，吸取上清液至液體培養(yǎng)基中，36°C、120rpm的條件 下培養(yǎng)8h ;
[0074] S3.將S2的培養(yǎng)基靜置26min，吸取上清液劃線接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為 10%的二氧化碳環(huán)境下36°C培養(yǎng)14h ;
[0075] S4.挑取固體培養(yǎng)基上的單顆菌落，分別接種于液體培養(yǎng)基中，36°C、120rpm的條 件下培養(yǎng)14h ;
[0076] S5.選擇S4中固體培養(yǎng)基上的零散菌體，再次接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為 10%的二氧化碳環(huán)境下36°C培養(yǎng)14h ;
[0077] S6.采集經(jīng)S5培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)基上的菌苔，懸浮于20%的甘油生理鹽水，懸浮 后分裝，置于液氮中保存。
[0078] 實(shí)施例6 :篩選菌株
[0079] 培養(yǎng)基為實(shí)施例1-4制備的固體和液體培養(yǎng)基，篩選方法包括以下步驟：
[0080] SI.將Hib主種子菌種開啟，吸取菌液3ml，接種于液體培養(yǎng)基中，37°C、240rpm的 條件下培養(yǎng)20h ;
[0081] S2.將SI的培養(yǎng)基靜置35min，吸取上清液至液體培養(yǎng)基中，37°C、240rpm的條件 下培養(yǎng)IOh ;
[0082] S3.將S2的培養(yǎng)基靜置35min，吸取上清液劃線接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為 10%的二氧化碳環(huán)境下37°C培養(yǎng)20h ;
[0083] S4.挑取固體培養(yǎng)基上的單顆菌落，分別接種于液體培養(yǎng)基中，37°C、240rpm的條 件下培養(yǎng)20h ;
[0084] S5.選擇S4中固體培養(yǎng)基上的零散菌體，再次接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為 10%的二氧化碳環(huán)境下37°C培養(yǎng)20h ;
[0085] S6.米集經(jīng)S5培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)基上的菌苔，懸浮于30%的甘油生理鹽水，懸浮 后分裝，置于液氮中保存。
[0086] 實(shí)施例7 :篩選菌株
[0087] 培養(yǎng)基為實(shí)施例1-4制備的固體和液體培養(yǎng)基，篩選方法包括以下步驟：
[0088] SI.將Hib主種子菌種開啟，吸取菌液3ml，接種于液體培養(yǎng)基中，36. 5°C、200rpm 的條件下培養(yǎng)18h ;
[0089] S2?將SI的培養(yǎng)基靜置30min，吸取上清液至液體培養(yǎng)基中，36. 5°C、200rpm的條 件下培養(yǎng)9h ;
[0090] S3.將S2的培養(yǎng)基靜置30min，吸取上清液劃線接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為 10%的二氧化碳環(huán)境下36. 5°C培養(yǎng)16h ;
[0091] S4.挑取固體培養(yǎng)基上的單顆菌落，分別接種于液體培養(yǎng)基中，36. 5°C、200rpm的 條件下培養(yǎng)18h ;
[0092] S5.選擇S4中固體培養(yǎng)基上的零散菌體，再次接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為 10%的二氧化碳環(huán)境下36. 5°C培養(yǎng)18h ;
[0093] S6.米集經(jīng)S5培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)基上的菌苔，懸浮于26%的甘油生理鹽水，懸浮 后分裝，置于液氮中保存。
[0094] 以下通過實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明的有益效果：
[0095] 一、制備Hib莢膜多糖
[0096] 將實(shí)施例7中篩選的菌落選取10個，分別標(biāo)記為D1-D10,將Dl-DlO分別開啟于固 體培養(yǎng)基，再傳到液體培養(yǎng)基，最后接種30L發(fā)酵罐中（發(fā)酵量為18L)，36?37°C，180rpm， 通氣培養(yǎng)8?10小時。加入甲醛0.5 % (v/v)，緩慢攪拌2小時。離心收集上清液，加入 0. 1 %十六烷基三甲基溴化銨，2?8°C，放置5小時，離心收集沉淀，為復(fù)合多糖。采用本行 業(yè)熟知的技術(shù)，通過酒精沉淀去除核酸，苯酚萃取去除蛋白和細(xì)菌內(nèi)毒素。再超濾去除小分 子物質(zhì)，在0. 3mol/L的NaCl存在下70%乙醇沉淀，離心收集多糖，用無水乙醇和丙酮洗多 糖各三遍。4°C條件下，干燥，得到精制Hib莢膜多糖，結(jié)果如表1所示。
[0097] 表I :D1_D10制備的Hib莢膜多糖的量
[0098]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基 或液體培養(yǎng)基，其中，固體培養(yǎng)基的配方包括如下組分：相對于溶劑用量為l〇〇〇ml的量，含 有酵母提取物10?20g、磷酸氫二鈉3?28. 65g、磷酸二氫鈉0. 94?3. 12g、60%乳酸鈉溶 液0. 5?1. 5ml、氯化鎂0. 2?0. 6g、二水氯化鈣0. 01?0. 04g、硫酸銨0. 5?lg、葡萄糖 10?20g、氯化血紅素10?20mg、輔酶I 10?20mg、瓊脂10?15g，調(diào)pH至6. 5?7. 5， 所述溶劑為水； 液體培養(yǎng)基的配方包括如下組分：相對于溶劑用量為1000ml的量，含有酵母提取物 10?20g、磷酸氫二鈉3?28. 65g、磷酸二氫鈉0· 94?3. 12g、60%乳酸鈉溶液0· 5?1. 5ml、 氯化鎂0. 2?0. 6g、二水氯化鈣0. 01?0. 04g、硫酸銨0. 5?lg、葡萄糖10?20g、氯化 血紅素10?20mg、輔酶I 10?20mg，調(diào)pH至6. 5?7. 5,所述溶劑為水。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株培養(yǎng)基的制備方法，其特征在 于，所述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，制備方法包括以下步驟：
51. 稱量：按上述固體培養(yǎng)基配方比例稱取各組分原料，備用；
52. 制備A液：
521. 超濾：將酵母提取物、葡萄糖用蒸餾水稀釋，用截留分子量為10KD的膜包進(jìn)行超 濾，收集超濾液；
522. 除菌：超濾液中加入氯化血紅素和輔酶I，用孔徑為0. 2μπι的膜過濾除菌，除菌 后置于2?8°C的溫度下保存；
53. 制備B液：將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化鈣、硫酸 銨和瓊脂混合均勻后高溫高壓滅菌；
54. 混合：待B液冷卻至55?60°C時加入A液，制得固體培養(yǎng)基； 所述培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，制備方法包括以下步驟： (1) 稱量：按上述液體培養(yǎng)基配方比例稱取各組分原料，備用； (2) 制備A液： A. 超濾：將酵母提取物、葡萄糖用蒸餾水稀釋后，用截留分子量為10KD的膜包進(jìn)行超 濾，收集超濾液； B. 除菌：超濾液中加入氯化血紅素和輔酶I，用孔徑為0. 2μπι的膜過濾除菌，除菌后 置于2?8°C的溫度下保存； (3) 制備B液：將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、60%乳酸鈉溶液、氯化鎂、二水氯化鈣和硫酸 銨混合均勻后高溫高壓滅菌； (4) 混合：使用前，將制備的A液、B液混合均勻即可。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株培養(yǎng)基的制備方法，其特征在 于，所述酵母提取物稀釋液的濃度為90?110g/L，葡萄糖稀釋液的濃度為180?220g/L。
4. 如權(quán)利要求2所述的一種用于篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株培養(yǎng)基的制備方法，其特征 在于，所述高溫高壓滅菌的滅菌溫度為118?125°C，壓強(qiáng)為0.09?0. 12MPa，滅菌時間為 28 ?35min。
5. 利用如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基篩選高產(chǎn)Hib疫苗菌株的方法，其特征在于，它包括 以下步驟： S1.將Hib主種子菌種開啟，吸取菌液3ml，接種于液體培養(yǎng)基中，36?37°C、120? 240rpm的條件下培養(yǎng)14?20h ;
52. 將S1的培養(yǎng)基靜置26?35min，吸取上清液至液體培養(yǎng)基中，36?37°C、120? 240rpm的條件下培養(yǎng)8?10h ;
53. 將S2的培養(yǎng)基靜置26?35min，吸取上清液劃線接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為 10%的二氧化碳環(huán)境下36?37°C培養(yǎng)14?20h ;
54. 挑取固體培養(yǎng)基上的單顆菌落，分別接種于液體培養(yǎng)基中，36?37°C、120? 240rpm的條件下培養(yǎng)14?20h ;
55. 選擇S4中固體培養(yǎng)基上的零散菌體，再次接種于固體培養(yǎng)基上，在濃度為10%的 二氧化碳環(huán)境下36?37°C培養(yǎng)14?20h ;
56. 米集經(jīng)S5培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)基上的菌苔，懸浮于20?30%的甘油生理鹽水，懸浮 后分裝，置于液氮中保存。
【文檔編號】C12R1/21GK104293704SQ201410488008
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】陳道遠(yuǎn), 朱沖, 陳元芬 申請人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司