檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的序列、技術(shù)平臺(tái)及其方法
【專利摘要】本發(fā)明有關(guān)于檢測(cè)艱難梭狀桿菌(Clostridium difficile)核糖分型027的序列、技術(shù)平臺(tái)及其方法；此技術(shù)平臺(tái)包括有與艱難梭狀桿菌核糖分型027具有特異性，可用以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物對(duì)，以及多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需的引物組及檢測(cè)材料；其方法是先取得檢體DNA，于活體外以引物組進(jìn)行擴(kuò)增檢體DNA，再檢測(cè)檢體是否含有符合目標(biāo)序列SEQ ID NO：1的特征，若符合此特征則表示檢體含有艱難梭狀桿菌核糖分型027；藉此達(dá)到快速確認(rèn)檢體中有無(wú)包含核糖分型027菌株的目的。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的序列、技術(shù)平臺(tái)及其方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明有關(guān)于一種檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的序列、技術(shù)平臺(tái)及其方法， 于活體外進(jìn)行艱難梭狀桿菌的流行病學(xué)檢測(cè)與基因分型，尤其指針對(duì)檢測(cè)艱難梭狀桿菌核 糖分型027特有的目標(biāo)序列SEQ ID N0 :1所設(shè)計(jì)出的#1與#2引物對(duì)，并發(fā)展出一個(gè)單一 步驟、快速且靈敏的技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方式，即可檢測(cè)檢體是否具有目標(biāo)序列 的特征，藉此達(dá)到快速確認(rèn)檢體中有無(wú)包含核糖分型027菌株的目的。

【背景技術(shù)】
[0002] 由Holdeman于1977年首度發(fā)表的艱難梭狀桿菌（Clostridium difficile)，屬于 芽孢桿菌科（Bacillaceae)梭孢桿菌屬（clostridium)，其屬名來(lái)自希臘文，意指梭狀物 (spindle)，種名源自拉丁文difficile,是艱難的意思，表示其在分離和研究上都比較艱難； 艱難梭狀桿菌是一種厭氧性革蘭氏陽(yáng)性桿菌，在人體外環(huán)境或醫(yī)療環(huán)境中，會(huì)形成孢子體， 常透過(guò)醫(yī)療照護(hù)行為而傳播。艱難梭狀桿菌尚有不同分型的菌株，其具有不同的毒性能力， 其中有些亦為人體腸道中的正常菌群（normal flora)之一，由于其他腸道菌的競(jìng)爭(zhēng)壓抑才 使其不易致??；但于醫(yī)院里，有些病患會(huì)因?yàn)榭股厥褂枚种企w內(nèi)的正常菌群，導(dǎo)致艱難 梭狀桿菌伺機(jī)性感染，引起艱難梭狀桿菌大量增生，由于艱難梭狀芽孢桿菌主要的致病力 來(lái)自于分泌的毒素A與毒素B，毒素會(huì)引發(fā)腸黏膜發(fā)炎及受損，因此會(huì)引起病人偽膜性結(jié)腸 炎（pseudomembranous colitis)或嚴(yán)重腹瀉等，并可能引起病人敗血癥，甚至死亡。另外， 曾有研究針對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)所爆發(fā)艱難梭狀桿菌相關(guān)疾病的臨床菌株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些類似 的菌株皆會(huì)分泌一種二元毒素⑶T (binary toxin⑶T)，并且于其致病基因tcdC上都有缺 失（deletion),如此的基因改變推測(cè)與毒素A與毒素B分泌增加相關(guān)。
[0003] 近年來(lái)，艱難梭狀桿菌感染癥（Clostridium difficile infection,0)1)流行病學(xué) 的改變與一株艱難梭狀桿菌核糖分型（rib〇type)027流行性菌株的出現(xiàn)有關(guān)，已知核糖分 型027菌株具有高度毒性，并且由核糖分型027菌株引起的群體性突發(fā)事件中，常具有高致 死率與高復(fù)發(fā)率的情形，因此分析艱難梭狀桿菌分型將有助于了解其感染癥的流行病學(xué)信 息；現(xiàn)有艱難梭狀桿菌首要的分型方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核糖分型（PCR ribotyping)， 然全球卻沒(méi)有一套簡(jiǎn)易標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)法可遵照。
[0004] 目前艱難梭狀桿菌診斷技術(shù)中無(wú)法直接以細(xì)菌基因分子診斷方式直接判讀是否 為核糖分型027,必須以傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)核糖分型方式，同時(shí)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因指紋 圖譜才能獲得解答。請(qǐng)參閱圖7,為現(xiàn)有艱難梭狀桿菌核糖分型檢測(cè)分析圖，以現(xiàn)有方法進(jìn) 行核糖分型分析時(shí)，其缺點(diǎn)為需要大量已知核糖分型的菌株作為分型的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，并需要 強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)分析，才有辦法作標(biāo)準(zhǔn)化分析，實(shí)驗(yàn)室的再現(xiàn)性低，具有標(biāo)準(zhǔn)菌株是否購(gòu)足的 限制且程序較為繁瑣。
[0005] 因此，如何發(fā)展出可專一性且快速檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027菌株的方式， 找到一個(gè)特定的基因片段并發(fā)展成為單一步驟、快速且靈敏的診斷替代法，便成為此相關(guān) 領(lǐng)域發(fā)明人關(guān)注的焦點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明人即是鑒于上述現(xiàn)有的檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型的方法于實(shí)際實(shí)施使用 時(shí)仍具有多處缺失，于是本著孜孜不倦的精神，并通過(guò)其豐富專業(yè)知識(shí)及多年的實(shí)務(wù)經(jīng)驗(yàn) 所輔佐，而加以改善，并據(jù)此研創(chuàng)出本發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明主要目的為提供一種可專一性檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的序列、技 術(shù)平臺(tái)及其方法，利用#1引物以及#2引物于活體外以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方式，檢測(cè)檢體是 否具有目標(biāo)序列特征，藉此達(dá)到快速確認(rèn)檢體中有無(wú)包含艱難梭狀桿菌核糖分型027的目 的。
[0008] 為了達(dá)到上述實(shí)施目的，本發(fā)明人提出一種活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型 027的技術(shù)平臺(tái)及其方法，用以檢測(cè)經(jīng)過(guò)純化和分離的目標(biāo)序列；其中，目標(biāo)序列可為脫氧 核糖核酸（DNA)序列，其具有與SEQ ID N0 :1至少85%的序列同一性，較佳是具有至少90% 的序列同一性，更佳是具有至少95%的序列同一性，或可為SEQ ID N0 :1序列。
[0009] -種活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的技術(shù)平臺(tái)，其包括：（1)對(duì)于艱難梭 狀桿菌核糖分型027具有特異性，用以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物對(duì)，其包含#1引物及#2 引物，其中#1引物包含SEQ ID N0:2,而#2引物包含SEQ ID N0:3,此引物對(duì)是針對(duì)艱難梭 狀桿菌核糖分型027的SEQ ID N0 :1序列區(qū)域所設(shè)計(jì)；以及（2)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需 的引物組及檢測(cè)材料。
[0010] 本發(fā)明的又一目的為提供一種活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌及其核糖分型027的方 法，其包括下列步驟：先取得檢體DNA;再于活體外以對(duì)艱難梭狀桿菌毒素基因及核糖分 型027基因具專一性的引物組進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增檢體DNA，以檢測(cè)檢體是否含 有符合目標(biāo)序列SEQ ID N0 :1的特征，若符合特征則表示檢體含有艱難梭狀桿菌核糖分型 027,其中，上述的特征是包括序列或序列的長(zhǎng)度。
[0011] 于本發(fā)明之一實(shí)施例中，檢體選自受感染的糞便或艱難梭狀桿菌。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1 :本發(fā)明較佳實(shí)施例的檢測(cè)方法步驟流程圖；
[0013] 圖2a :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的其中三十一種標(biāo)準(zhǔn)菌株核糖分型檢測(cè)分析圖；
[0014] 圖2b :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的其中二十種標(biāo)準(zhǔn)菌株核糖分型檢測(cè)分析圖；
[0015] 圖3a :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第1至41號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0016] 圖3b :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第42至73號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0017] 圖3c :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第74至119號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0018] 圖3d :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第120至149號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0019] 圖3e :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第150至210號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0020] 圖3f :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第211至273號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0021] 圖3g :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第274至334號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0022] 圖3h :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第335至380號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0023] 圖3i :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的第381至414號(hào)臨床菌株檢測(cè)分析圖；
[0024] 圖4 :本發(fā)明其一具體實(shí)施例的核糖分型檢測(cè)分析圖；
[0025] 圖5 :本發(fā)明具體實(shí)施例的艱難梭狀桿菌毒素檢測(cè)分析圖；
[0026] 圖6 :本發(fā)明具體實(shí)施例的艱難梭狀桿菌毒素及核糖027分型檢測(cè)分析圖；
[0027] 圖7 :現(xiàn)有艱難梭狀桿菌核糖分型檢測(cè)分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明的目的及其結(jié)構(gòu)功能上的優(yōu)點(diǎn)，將依據(jù)以下附圖所示的結(jié)構(gòu)，配合具體實(shí) 施例予以說(shuō)明，使審查員能對(duì)本發(fā)明有更深入且具體的了解。
[0029] 本發(fā)明提供一種經(jīng)過(guò)純化和分離于活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的目 標(biāo)序列，其脫氧核糖核酸序列可例如為具有與SEQ ID N0 :1(請(qǐng)參閱序列表所示）至少85% 的序列同一性，較佳為具有至少90%的序列同一性，更佳為具有至少95%的序列同一性或 可為SEQ ID N0 :1核苷酸序列。
[0030] 首先，本發(fā)明提出一種活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的技術(shù)平臺(tái)，其主 要包括有：
[0031] (1)對(duì)于艱難梭狀桿菌核糖分型027具有特異性，用以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 的引物對(duì)，其包含#1引物及#2引物，其中#1引物包含SEQ ID N0 :2以及#2引物包含SEQ ID N0 :3,且#1引物與#2引物是針對(duì)艱難梭狀桿菌核糖分型027的目標(biāo)序列SEQ ID N0 :1 序列區(qū)域所設(shè)計(jì)；以及
[0032] (2)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需的引物組及檢測(cè)材料。
[0033] 請(qǐng)參閱圖1所示，為本發(fā)明較佳實(shí)施例的檢測(cè)方法步驟流程圖，其檢測(cè)方法主要 包括有：
[0034] 步驟一（S1):取得檢體DNA，其中此檢體選自受感染的糞便或艱難梭狀桿菌，且為 艱難梭狀桿菌或其毒素或兩者組合已被確認(rèn)的檢體；以及
[0035] 步驟二（S2):于活體外以對(duì)艱難梭狀桿菌毒素基因及核糖分型027具專一性的引 物組進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增（amplification)檢體DNA，并以上述技術(shù)平臺(tái)（可例如 但不限定為一套件）檢測(cè)檢體是否含有符合目標(biāo)序列SEQ ID N0 :1的特征，可例如為序列 或序列的長(zhǎng)度（2, 981bp)與SEQ ID N0 :1相符合者，若符合特征則表示檢體含有艱難梭狀 桿菌核糖分型027。
[0036] 此外，通過(guò)下述具體實(shí)施例，可進(jìn)一步證明本發(fā)明可實(shí)際應(yīng)用的范圍，但不以任何 形式限制本發(fā)明的范圍。
[0037] 簡(jiǎn)言之，本發(fā)明有關(guān)于艱難梭狀桿菌（Clostridium difficile)核糖分型027菌株 所特有的專一序列作為檢測(cè)依據(jù)的技術(shù)平臺(tái)；此技術(shù)平臺(tái)包括：專一性檢測(cè)艱難梭狀桿菌 核糖分型027的特異性序列的引物設(shè)計(jì)，及應(yīng)用于進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物組，以 及此技術(shù)平臺(tái)的檢測(cè)流程。本發(fā)明人發(fā)展出一套多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測(cè)法，其方法是 先從臨床糞便樣本分離出DNA，于活體外進(jìn)行艱難梭狀桿菌的流行病學(xué)檢測(cè)與基因分型，并 同時(shí)篩選出臨床上是否存在艱難梭狀桿菌核糖分型027菌株。其中，毒素基因分型的引物 設(shè)計(jì)是以毒基因型的艱難梭狀桿菌致病基因座作為依據(jù)；另外還有一組引物利用核糖分型 菌株所特有的序列作為檢測(cè)依據(jù)，可用以專一性的結(jié)合在標(biāo)的序列SEQ ID N0 :1上。藉此 達(dá)到快速確認(rèn)檢體中有無(wú)包含核糖分型027菌株的目的。因此，本發(fā)明人找到一個(gè)具有專 一性的基因位點(diǎn)，并發(fā)展出一個(gè)單一步驟、快速且靈敏的技術(shù)平臺(tái)用于臨床檢測(cè)艱難梭狀 桿菌核糖分型027菌株存在與否。
[0038] 實(shí)驗(yàn)一：取得檢體DNA
[0039] 菌株來(lái)源是由美國(guó)加州大學(xué)洛杉肌分校（University of California, Los Angeles, UCLA)Prof. Goldstein實(shí)驗(yàn)室購(gòu)得40株已知核糖分型的標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及由瑞典 CCUG 種源庫(kù)（Culture Collection, University of G^tebofg，Sweden)購(gòu)得 11 株標(biāo)準(zhǔn)菌 株；另外，404株艱難梭狀桿菌臨床菌株取自署立臺(tái)南醫(yī)院病人的臨床分離菌株；將上述菌 株皆保存于_80°C。
[0040] 于菌株培養(yǎng)時(shí)，直接自凍管取菌涂布于瓊脂培養(yǎng)基（⑶C anaerobe 5 % sheep blood agar),并置于培養(yǎng)箱中的厭氧缸內(nèi)，以37°C培養(yǎng)48小時(shí)；再取其中單一菌落接種到 50ml培養(yǎng)液（brain heart infusion(BHI)broth)內(nèi)，密封后置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，以37°C培 養(yǎng)48小時(shí)，上述培養(yǎng)液包含有37g/L的腦心浸液（brain heart infusion)、5g/L的酵母提 取物（yeast extraction)和 lg/L 的 L_ 半胱氨酸（L-cysteine)。
[0041] 接著，將培養(yǎng)于50mL離心管內(nèi)的菌株以2, 500g離心10分鐘，并去除上清液留下 沉淀物（pellet)，再以lmL PBS緩沖液回溶沉淀物后，取出200 y L，利用套件（Genomic DNA Mini Kit, Geneaid)所指示的步驟進(jìn)行DNA萃取。
[0042] 進(jìn)一步地，本發(fā)明利用六組引物（如表一）所建立的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (multiplex-PCR)來(lái)檢測(cè)艱難梭狀桿菌的 16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及 tcdC 等 六個(gè)基因，作為艱難梭狀桿菌菌株毒素分型（toxin genotyping)的依據(jù)。基因擴(kuò)增的反 應(yīng)條件為：（1)DNA變性步驟（denaturation) :94°C，5分鐘；（2)接合步驟（annealing):以 94°C，1分鐘，接著55°C，1分鐘，再72°C，1分鐘為一循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)；以及（3)延展步 驟（extension或elongation) :72°C，5分鐘，并將產(chǎn)物保存在4°C環(huán)境。接著，利用2%瓊 脂凝膠（agarose gel)進(jìn)行電泳反應(yīng)（100伏特，40分鐘）后，再以溴化乙菲陡（ethidium bromide, EtBr)染色以進(jìn)行產(chǎn)物分析。
[0043] 表一
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種經(jīng)過(guò)純化和分離于活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的目標(biāo)序列，其脫氧 核糖核酸序列具有與SEQ ID NO :1至少85%的序列同一性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)過(guò)純化和分離于活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的 目標(biāo)序列，其中脫氧核糖核酸序列具有與SEQ ID NO :1至少90%的序列同一性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)過(guò)純化和分離于活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的 目標(biāo)序列，其中脫氧核糖核酸序列具有與SEQ ID NO :1至少95%的序列同一性。
4. 一種活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的技術(shù)平臺(tái)，其包括： (1) 對(duì)于艱難梭狀桿菌核糖分型027具有特異性、用以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物對(duì)， 其包含#1引物及#2引物；以及 (2) 多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需的引物組及檢測(cè)材料。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的技術(shù)平臺(tái)，其中#1 引物包含SEQ ID NO :2以及#2引物包含SEQ ID NO :3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的技術(shù)平臺(tái)，其中#1 引物以及#2引物是針對(duì)艱難梭狀桿菌核糖分型027的SEQ ID NO :1序列區(qū)域所設(shè)計(jì)。
7. -種活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的方法，其包括下列步驟： 步驟一：取得檢體DNA ;以及 步驟二：于活體外以對(duì)艱難梭狀桿菌毒素基因及核糖分型027具專一性的引物組進(jìn)行 多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增檢體DNA，并檢測(cè)檢體是否含有符合目標(biāo)序列SEQ ID NO: 1的特 征，若符合特征則表示檢體含有艱難梭狀桿菌核糖分型027。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的方法，其中步驟一 的檢體為艱難梭狀桿菌或其毒素或兩者的組合已被確認(rèn)的檢體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的方法，其中檢體選 自受感染的糞便或艱難梭狀桿菌。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的活體外檢測(cè)艱難梭狀桿菌核糖分型027的方法，其中目標(biāo)序 列SEQ ID NO :1的特征包括序列或序列的長(zhǎng)度。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104450879SQ201410494105
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】蔡佩珍, 蔡博仰, 洪元斌, 柯文謙 申請(qǐng)人:蔡佩珍