一種大腸桿菌色氨酸酶突變體及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明通過易錯(cuò)PCR的方法對(duì)野生型色氨酸酶基因進(jìn)行改造，得到了一種大腸桿菌色氨酸酶突變體，該色氨酸酶突變體的酶活力相對(duì)于出發(fā)菌株提高了120倍。
【專利說明】一種大腸桿菌色氨酸酶突變體及其編碼基因

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種大腸桿菌色氨酸酶突變體及其 編碼基因。

【背景技術(shù)】
[0002] L-色氨酸是人和動(dòng)物體內(nèi)的重要必需氨基酸，在醫(yī)藥、食品和飼料添加劑等方面 具有廣泛的用途。其生產(chǎn)方法主要有蛋白水解提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn) 化法四種，其中酶促轉(zhuǎn)化法是目前較為有效的工業(yè)化方法。轉(zhuǎn)化途徑主要涉及色氨酸合成 酶及色氨酸酶，二者均可催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸。但吲哚對(duì)前者具有強(qiáng)烈的 抑制作用，而色氨酸酶對(duì)吲哚具有良好的穩(wěn)定性，因此近年來人們更為關(guān)注色氨酸酶，并將 其用于L-色氨酸的生物合成。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明目的是提供一種大腸桿菌色氨酸酶突變 體及其編碼基因。
[0004] 本發(fā)明提供一種大腸桿菌色氨酸酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或 該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO. 1衍生的氨 基酸序列。
[0005] 所述色氨酸酶突變體與野生型的色氨酸酶相比，具體的氨基酸序列的改變是： T60A (第60位蘇氨酸變?yōu)楸彼幔?，V188Y (第188位纈氨酸變?yōu)槔野彼幔?，A272S (第272 位丙氨酸變?yōu)榻z氨酸），I348P (第348位異亮氨酸變?yōu)楦彼幔?br> [0006] 本發(fā)明還提供了編碼所述大腸桿菌色氨酸酶突變體的基因。
[0007] 進(jìn)一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了含有所述基因的載體。
[0009] 本發(fā)明還提供了含有所述基因或所述載體的宿主細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明還提供了前述大腸桿菌色氨酸酶突變體的篩選方法，包括以下步驟：
[0011] (1)從E. coli JM109基因組DNA中，利用引物擴(kuò)增色氨酸酶的編碼基因；
[0012] (2)采用易錯(cuò)PCR技術(shù)，以色氨酸酶的編碼基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增獲得色氨酸酶突變體 基因；
[0013] (3)將步驟（2)所得易錯(cuò)PCR產(chǎn)物及表達(dá)質(zhì)粒pET28a+用Sac I和Not I雙酶切 后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布至含卡那霉素的LB平板，將平板置 37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即得構(gòu)建好的重組色氨酸酶基因突變庫；
[0014] (4) LB平板上長出菌落，挑取其中的100個(gè)單克隆，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C 搖床培養(yǎng)，待菌液OD6c?長至0. 5時(shí)，加入終濃度為0. ImM的IPTG誘導(dǎo)，37°C搖床繼續(xù)培養(yǎng) 2h后，收集菌體，超聲破碎，測(cè)定色氨酸酶突變體酶活，挑選酶活力最高的一株，并測(cè)定其基 因序列，分別為SEQ ID NO. 2所不的基因序列和SEQ ID NO. 1所不的氣基酸序列。
[0015] 更進(jìn)一步地，所述步驟（1)中的引物為：
[0016] 正向引物：5 ' -GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3 ' ；
[0017] 反向引物：5 ' -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3 '。
[0018] 本發(fā)明還提供了前述色氨酸酶突變體的制備方法，包括以下步驟：
[0019] (1)利用引物PCR擴(kuò)增色氨酸酶突變體基因；
[0020] (2)將步驟（1)所得PCR產(chǎn)物連接表達(dá)載體pET_28a(+);
[0021] (3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)產(chǎn)物。
[0022] 進(jìn)一步地，所述步驟（1)中所用引物為：
[0023] 正向引物：5' -GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3' ；
[0024] 反向引物：5 ' -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3 '。
[0025] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0026] 本發(fā)明通過易錯(cuò)PCR的方法對(duì)野生型色氨酸酶基因進(jìn)行改造，并且構(gòu)建了高效表 達(dá)載體，重組表達(dá)的色氨酸酶活力達(dá)到了原始出發(fā)菌株色氨酸酶活力的約120倍,從而為 L-色氨酸的酶法生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若 未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0028] 實(shí)施例1色氨酸酶基因的獲得
[0029] 以E. coli JM109基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的E. coli K12 的色氨酸酶基因序列（序列號(hào)：EU569042. 1)，設(shè)計(jì)正向引物為5' -GATCGAGCTCATGGAAAACT TTAAACATCTCC-3'，反向引物為 5' -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3;。其中斜 體字母部分分別為酶切位點(diǎn)Sac I和Not LPCR反應(yīng)在50 μ 1總體積中進(jìn)行，反應(yīng)條件為 在94°C變性5min后開始循環(huán)，然后94°C變性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30個(gè) 循環(huán)后，再于72°C延伸lOmin。取3μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。取100μ 1 PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的步驟回收目的片段。
[0030] 實(shí)施例2易錯(cuò)PCR擴(kuò)增色氨酸酶基因
[0031] 利用Taq DNA聚合酶不具有3' -5'校對(duì)功能的性質(zhì)，在高鎂離子濃度（5-9mmol/ L)和不同濃度dNTP的濃度下（I. 5-3. 5mmol/L)，來控制隨機(jī)突變的頻率，向目的基因中引 入隨機(jī)突變，構(gòu)建突變庫。實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)的突變率約為〇. 5%。
[0032] 易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系（100 μ 1):
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種大腸桿菌色氨酸酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或該序列經(jīng)替換、 缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO. 1衍生的氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述大腸桿菌色氨酸酶突變體的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5. 含有權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞。
6. 權(quán)利要求1所述色氨酸酶突變體的篩選方法，其特征在于，具體包括以下步驟： (1) 從E. coli JM109基因組DNA中，利用引物擴(kuò)增色氨酸酶的編碼基因； (2) 采用易錯(cuò)PCR技術(shù)，以色氨酸酶的編碼基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增獲得色氨酸酶突變體基 因； (3) 將步驟（2)所得易錯(cuò)PCR產(chǎn)物及表達(dá)質(zhì)粒pET28a+用Sac I和Not I雙酶切后連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布至含卡那霉素的LB平板，將平板置37°C 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即得構(gòu)建好的重組色氨酸酶基因突變庫； (4) LB平板上長出菌落，挑取其中的100個(gè)單克隆，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床 培養(yǎng)，待菌液〇D6(?長至0. 5時(shí)，加入終濃度為0. ImM的IPTG誘導(dǎo)，37°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)2h后， 收集菌體，超聲破碎，測(cè)定色氨酸酶突變體酶活，挑選酶活力最高的一株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中的引物為： 正向引物：5' -GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3' ； 反向引物：5' -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGITTTGC-3'。
8. 權(quán)利要求1所述色氨酸酶突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 利用引物PCR擴(kuò)增色氨酸酶突變體基因； (2) 將步驟（1)所得PCR產(chǎn)物連接表達(dá)載體pET-28a(+); (3) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)產(chǎn)物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中所用引物為： 正向引物：5 ' -GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3 ' ； 反向引物：5 ' -GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGITTTGC-3 '。
【文檔編號(hào)】C12N15/60GK104263714SQ201410494789
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】徐斌, 楊為華, 鄧遠(yuǎn)德, 楊金環(huán) 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司