一種基于丙烯酰胺凝膠芯片檢測核酸分子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于丙烯酰胺凝膠芯片檢測核酸分子的方法，組織或細胞按常規(guī)的核酸原位雜交方法進行固定、切片后，把含有閉環(huán)的單鏈DNA分子經(jīng)堿基配對原則與待檢測核分子雜交，同時把一個經(jīng)丙烯酰胺修飾的擴增引物與閉環(huán)的單鏈DNA的另一位點結(jié)合；結(jié)合有閉環(huán)的單鏈DNA和擴增引物的切片粘貼到丙烯酰胺修飾的玻片上，在切片上方加入丙烯酰胺溶液，讓其凝固；加入滾環(huán)擴增體系，讓結(jié)合到切片的閉環(huán)上的引物沿著閉環(huán)分子進行滾環(huán)擴增；擴增完成后可通過探針分子進行檢測、計算、定位待測核酸分子數(shù)量以及表達位置。該方法實現(xiàn)對核酸分子的數(shù)字化定量分析，為核酸分子定量分析提供一種新方法，建立快速，準(zhǔn)確，便宜的核酸檢測技術(shù)。
【專利說明】
—種基于丙烯酰胺凝膠芯片檢測核酸分子的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于丙烯酰胺凝膠芯片檢測核酸分子的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]突光原位雜交(fluorescencein situ hybridizat1n, FISH)是在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。FISH的基本原理是將DNA (或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記，所用的核酸探針是與被檢測核酸是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測核酸進行定性、定量或相對定位分析。
[0003]目前已經(jīng)有對組織中目的基因mRNA水平的定位及表達差異變化的研究方面應(yīng)用，在以往的FISH研究中，由于探針自身信號的強弱不同，雜交信號的顯示存在不足。盡管采用的熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡對雜交結(jié)果進行觀察，仍然不能很好地克服雜交信號顯示不清楚的問題。盡管目前已經(jīng)一些對過信號放大的方法進行FISH檢測，然而，面臨的問題要么是需要多種不同的探針，導(dǎo)致成本過高；要么是通過原位擴增的辦法進行信號放大，比如最近已有在原來滾環(huán)擴增進行信號放大，然而，其過程過于復(fù)雜:需要先對靶標(biāo)mRNA進行原位反轉(zhuǎn)錄，然后進行原位連接，接著才是原位滾環(huán)擴增，整個過程不但操作復(fù)雜，而且在進行過程中，容易導(dǎo)致信號丟失，同時由于擴增產(chǎn)物不能很好地固定在原始mRNA的位置上，容易導(dǎo)致后繼實驗過程產(chǎn)物的丟失。因此，減少原位滾環(huán)擴增過程的操作步驟以及對擴增產(chǎn)物進行固定顯得特別重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種基于丙烯酰胺凝膠芯片的原位滾環(huán)擴增定量檢測核酸分子的方法，核酸分子經(jīng)過芯片上固相擴增后形成一個單克隆擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)過微測序或熒光探針分子檢測后，便可讀出每一個克隆點的信號，每個信號點就代表原始目標(biāo)DNA分子的數(shù)量，達到數(shù)字化檢測目標(biāo)核酸分子的目的。為核酸分子定量分析提供一種新方法，建立快速，準(zhǔn)確，便宜的核酸檢測技術(shù)。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0006]一種基于丙烯酰胺凝膠芯片檢測核酸分子的方法，組織或細胞按常規(guī)的核酸原位雜交方法進行固定、切片后，把含有閉環(huán)的單鏈DNA分子經(jīng)堿基配對原則與待檢測核分子雜交，同時把一個經(jīng)丙烯酰胺修飾的擴增引物與閉環(huán)的單鏈DNA的另一位點結(jié)合；結(jié)合有閉環(huán)的單鏈DNA和擴增引物的切片粘貼到丙烯酰胺修飾的玻片上，在切片上方加入丙烯酰胺溶液，讓其凝固；加入滾環(huán)擴增體系，讓結(jié)合到切片的閉環(huán)上的引物沿著閉環(huán)分子進行滾環(huán)擴增；擴增完成后可通過探針分子進行檢測、計算、定位待測核酸分子數(shù)量以及表達位置。
[0007]本發(fā)明檢測核酸分子的方法，檢測對像為細胞或組織的核酸包括脫氧核糖核酸DNA及核糖核酸RNA分子。
[0008]本發(fā)明檢測核酸分子的方法，所述的閉環(huán)的單鏈DNA分子是一個環(huán)狀的單鏈DNA分子，該分子可分為三個主要序列區(qū)域:含有一段能與待測核酸分子相互配對的結(jié)合序列，一段與丙烯酰胺修飾的擴增引物3未端多于15個堿基相互配對序列，以及一段能被檢測的序列。
[0009]本發(fā)明檢測核酸分子的方法，所述單鏈環(huán)狀的單鏈DNA分子中的一段序列與待測核酸分子有部分或全部序列是反向互補關(guān)系，用于待測核酸結(jié)合該環(huán)狀單鏈DNA，而未結(jié)合的環(huán)狀單鏈DNA會在后繼清洗過程中去除。
[0010]本發(fā)明檢測核酸分子的方法，所述的丙烯酰胺引物可以在滾環(huán)擴增體系以該單鏈環(huán)狀DNA為模板進行滾環(huán)擴增。
[0011]本發(fā)明檢測核酸分子的方法，所述環(huán)狀單鏈DNA分子中的一段能被檢測的序列是指該序列可以被標(biāo)記探針或微測序的方法檢測。
[0012]本發(fā)明所述的標(biāo)記探針是指能被儀器直接或間接檢測的熒光分子、量子點。
[0013]本發(fā)明所述的環(huán)狀單鏈DNA分子可以是針對一個待測核酸分子一個或多個位點，即多個環(huán)狀單鏈DNA檢測同一個待測分子，也可以是多個環(huán)狀單鏈DNA分子檢測多個待測核酸分子，即同時檢測多種不同的核酸分子。
[0014]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明是在進行原位滾環(huán)擴增之前，已經(jīng)先把用于信號擴大的單鏈DNA檢測環(huán)進行環(huán)化，然后用此環(huán)與待測細胞、組織進行雜交，同時對用于擴增該環(huán)狀DNA的引物是經(jīng)過丙烯酰胺修飾，因此被丙烯酰胺凝膠固定引物擴增出的產(chǎn)物不會在后繼實驗過程丟失，因此該新方法是快速，準(zhǔn)確，便宜的原位核酸定量定性分析技術(shù)；實現(xiàn)了對核酸分子的數(shù)字化定量分析，同時所需要的試劑和儀器均為常用，無需特殊購買，簡單方便實用。

【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0016]實例I基于丙烯酰胺凝膠芯片檢測核酸分子的方法結(jié)合熒光探針雜交檢測脊髓組織BDNF的表達
[0017]設(shè)計以下序列和探針:
[0018]Probel:5’ cy3_CTATAGTGTCACC3’ ；
[0019]Acr-primer:5’ Acr_TTTTTTTTTTTTTCATACGATTTAGGTGACGTA3’ ；
[0020]Bdnfl:p-CTATAGTGTCACCTCATGTGAGAAGTTCGGCTTTGCTCAGTACGTCACCTAAATCGTATG ；
[0021 ] Bdnf2:p-CTATAGTGTCACCGACCGCTGGGGAACTTGTTGCTTTTCTGTACGTCACCTAAATCGTATG ；
[0022]Bdnf3:p-CTATAGTGTCACCGGGAGTTTCAGAGTACCCCCATAAAAATTACGTCACCTAAATCGTATG ；
[0023]Lig=GGTGACACTATAGCATACGATTTAGttttt0
[0024]具體操作步驟如下:
[0025]I)按常規(guī)RNA原位雜交方法獲得組織切片；2)在taqDNA連接酶及其反應(yīng)體系中加入Bdnfl、Bdnf2、Bdnf3和Lig，Bdnf K Bdnf2和Bdnf3會以Lig為模板進行連接反應(yīng)，形成環(huán)狀單鏈DNA形式的Bdnfl、Bdnf2和Bdnf3 ;經(jīng)過DNA外切酶作用后去除未環(huán)化Bdnfl、Bdnf2,Bdnf3和單鏈形式存在的Lig，就可獲得純凈的環(huán)狀單鏈DNA形式的Bdnfl、Bdnf2和Bdnf3 ；3)在FISH雜交緩沖液(可商品化獲得)中加上第2步所得的環(huán)狀單鏈DNA形式的Bdnf UBdnf2和Bdnf3，并與第I步所得的切片一起哺育，使環(huán)化的Bdnf l、Bdnf2和Bdnf3與與細胞中的目標(biāo)BDNFmRNA結(jié)合；4)清洗掉未雜交的Bdnf l、Bdnf2和Bdnf3 ；5)制備丙烯酰胺修飾的DNA芯片；6)配置3%丙烯酰胺溶液，把第4步所得到的切片固定在第5步的DNA芯片上；7)加入等溫擴增反應(yīng)體系，在37度進行過夜擴增；8)溶解Probel于雜交液中，并與第7步所得的芯片進行雜交過夜；9)清洗未雜交探針，并在共聚焦顯微鏡上觀察信號；計算熒光信號點數(shù)，可知Bdnf的表達量。
[0026]實例2基于丙烯酰胺凝膠芯片檢測核酸分子的方法結(jié)合連接微測序檢測脊髓組織BDNF和NNAT的表達
[0027]設(shè)計以下序列和探針:
[0028]Acr-primer:5’ Acr_TTTTTTTTTTTTTCATACGATTTAGGTGACGTA3’ ；
[0029]Bdnf3:p_ATCGTATGCTATAGTGTCACCTCATGTGAGAAGTTCGGCTTTGCTCAGTACGTCACCTAA；
[0030]Bdnf4:p-ATCGTATGCTATAGTGTCACCGACCGCTGGGGAACTTGTTGCTTTTCTGTACGTCACCTAA；
[0031 ] Bdnf5:p-ATCGTATGCTATAGTGTCACCGGGAGTTTCAGAGTACCCCCATAAAAATTACGTCACCTAA；
[0032]Nnat1:p_ATCGTATGCTATCCTATCACCGCTGCCACTGCGGCCATGGTTCCGAAATACGTCACCTAA；
[0033]Nnat2:p-ATCGTATGCTATCCTATCACCTTGGCAAGTGCTCCTCTGACGAGGGAACATACGTCACCTAA；
[0034]Nnat3:p-ATCGTATGCTATCCTATCACCGGCTGAGATGGTACTGTTCCGACTTGGTCTACGTCACCTAA；
[0035]Lig2 =ATAGCATACGATTTAGGTGACGTAttttt
[0036]Seq-Primer:ATCGTATGCTAT ；
[0037]Pl:cy3-p-AGTGTCACC ；
[0038]P2:cy3-p-CCTATCACC。
[0039]操作步驟與實施例1相同，不同之處在于步驟2的反應(yīng)體系是加入Bdnf3, Bdnf4,Bdnf5, NnatI, Nnat2, Nnat3和Lig2進行連接反應(yīng)。第8步是利用連接微測序法進行檢測:在連接酶反應(yīng)體系中加入Seq-primer，Pl和P2，檢測Pl信號代表Bdnf，P2信號代表Nnat表達。
【權(quán)利要求】
1.一種基于丙烯酰胺凝膠芯片檢測核酸分子的方法，其特征在于:組織或細胞按常規(guī)的核酸原位雜交方法進行固定、切片后，把含有閉環(huán)的單鏈DNA分子經(jīng)堿基配對原則與待檢測核分子雜交，同時把一個經(jīng)丙烯酰胺修飾的擴增引物與閉環(huán)的單鏈DNA的另一位點結(jié)合；結(jié)合有閉環(huán)的單鏈DNA和擴增弓I物的切片粘貼到丙烯酰胺修飾的玻片上，在切片上方加入丙烯酰胺溶液，讓其凝固；加入滾環(huán)擴增體系，讓結(jié)合到切片的閉環(huán)上的引物沿著閉環(huán)分子進行滾環(huán)擴增；擴增完成后可通過探針分子進行檢測、計算、定位待測核酸分子數(shù)量以及表達位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸分子的方法，其特征在于:該方法檢測對像為細胞或組織的核酸包括脫氧核糖核酸DNA及核糖核酸RNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸分子的方法，其特征在于:所述的閉環(huán)的單鏈DNA分子是一個環(huán)狀的單鏈DNA分子，該分子可分為三個主要序列區(qū)域:含有一段能與待測核酸分子相互配對的結(jié)合序列，一段與丙烯酰胺修飾的擴增引物3未端多于15個堿基相互配對序列，以及一段能被檢測的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸分子的方法，其特征在于:所述單鏈環(huán)狀的單鏈DNA分子中的一段序列與待測核酸分子有部分或全部序列是反向互補關(guān)系。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸分子的方法，其特征在于:所述的丙烯酰胺引物可以在滾環(huán)擴增體系以該單鏈環(huán)狀DNA為模板進行滾環(huán)擴增。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸分子的方法，其特征在于:所述環(huán)狀單鏈DNA分子中的一段能被檢測的序列是指該序列可以被標(biāo)記探針或微測序的方法檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸分子的方法，其特征在于:所述的標(biāo)記探針是指能被儀器直接或間接檢測的熒光分子或量子點。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸分子的方法，其特征在于:所述的環(huán)狀單鏈DNA分子檢測一個待測核酸分子一個或多個位點，即多個環(huán)狀單鏈DNA檢測同一個待測分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測核酸分子的方法，其特征在于:所述的多個環(huán)狀單鏈DNA分子檢測多個待測核酸分子，即同時檢測多種不同的核酸分子。
【文檔編號】C12Q1/68GK104263830SQ201410500118
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】李燕強, 尹翠, 楊俊霞, 徐超, 孟慶祥 申請人:徐州醫(yī)學(xué)院