一種尿嘧啶-dna糖基化酶活性測(cè)定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方法，所述方法包括如下步驟：首先是PCR擴(kuò)增反應(yīng)：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)，進(jìn)行擴(kuò)增，生成含有dU的擴(kuò)增產(chǎn)物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反應(yīng)：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測(cè)定反應(yīng)體系中單鏈DNA產(chǎn)物或UDNA雙鏈的相對(duì)量，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果推導(dǎo)出尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應(yīng)體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單鏈DNA產(chǎn)物的量成正比。本發(fā)明方法無(wú)放射性污染，操作簡(jiǎn)單便捷，靈敏度高，可以定量檢測(cè)，并且穩(wěn)定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)涉及一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] UDG酶，即尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil-DNA GlycocasylaseXUDG的作用原理是 選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成有缺失堿基的DNA鏈， 在堿性介質(zhì)以及高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，從而被消除。UDG是細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中 一種重要的組分，在自然界廣泛存在，包括細(xì)菌、真核生物、人細(xì)胞中都有M)G酶表達(dá)。
[0003] UDG在PCR防污染方面具有非常重要的作用。PCR反應(yīng)最常見(jiàn)，最重要的污染物是 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。因?yàn)镻CR靈敏度非常高，可到單拷貝。因此如果即使痕量的擴(kuò)增產(chǎn)物污 染了模板，也會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)。目前常用的做法是在PCR反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)DG，并以dUTP 取代dTTP，這樣PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開(kāi)始前增加一步較低溫度的孵育步 驟，UDG酶即可將反應(yīng)體系中可能存在的上一輪的含有U-DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物中的尿嘧啶堿基 降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴(kuò)增，從而保證擴(kuò) 增結(jié)果的特異性，準(zhǔn)確性。同時(shí)UDG酶被滅活，不會(huì)再降解新擴(kuò)增的產(chǎn)物U-DNA。
[0004] 尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG)活性測(cè)定通常采用20世紀(jì)80年代初建立的同位素法， 其原理大致為：UDG可將同位素標(biāo)記的尿嘧啶從DNA或寡核苷酸上切下.當(dāng)DNA或寡核苷 酸用三氯醋酸沉淀時(shí)，切下的尿嘧啶仍然留在溶液中，用液閃計(jì)數(shù)。這種方法易產(chǎn)生放射性 污染，且步驟多、周期長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是建立一種簡(jiǎn)便、快速、非放射性的尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG)測(cè)活方 法。本發(fā)明原理如圖1所示。
[0006] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首先 是PCR擴(kuò)增反應(yīng)：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進(jìn)行 聚合反應(yīng)，進(jìn)行擴(kuò)增，生成含有dU的擴(kuò)增產(chǎn)物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反 應(yīng)：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測(cè)定反應(yīng) 體系中單鏈DNA產(chǎn)物或UDNA雙鏈的相對(duì)量，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果推導(dǎo)出尿嘧啶-DNA糖基化酶 活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應(yīng)體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單 鏈DNA產(chǎn)物的量成正比。
[0007] 優(yōu)選地，雙鏈UDNA或單鏈DNA的相對(duì)量是利用熒光染料，通過(guò)熒光法測(cè)得的，并且 雙鏈UDNA或單鏈DNA的相對(duì)量是以熒光強(qiáng)度表示的。更優(yōu)選，所采用的熒光染料是雙鏈 DNA特異性突光染料，例如可在市面上商購(gòu)獲得的picogreen染料。
[0008] 優(yōu)選地，所采用的雙鏈DNA模板是λ DNA，以便建立標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1. 無(wú)放射性污染； 2. 操作步驟簡(jiǎn)單快速，無(wú)需TCA沉淀、洗滌、干燥、洗脫步驟；可實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化的 活性測(cè)定。
[0010] 3.靈敏度高，可以定量檢測(cè)UDG酶的活性，并且穩(wěn)定。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1是本發(fā)明測(cè)定方法的原理圖。
[0012] 圖2是本發(fā)明測(cè)定方法獲得的酶活-熒光曲線(xiàn)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明的目的是建立一種簡(jiǎn)便、快速、非放射性的尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG)測(cè)活方 法。本發(fā)明原理如圖1所示。
[0014] 如圖1所示，入〇嫩可以在肋/^/6/0^存在的條件下被了&9酶聚合生成耶嫩， UDG酶可以水解斷裂含有dU的UDNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成有大量缺失堿基的DNA鏈， picogreen染料不能結(jié)合這種產(chǎn)物，從而不能產(chǎn)生突光；但是不經(jīng)過(guò)UDG酶作用的UDNA鏈， 則還是保持UDNA雙鏈結(jié)構(gòu)，它可以被picogreen染料結(jié)合，產(chǎn)生突光。
[0015] UDG酶的活性在一定范圍內(nèi)與單鏈DNA產(chǎn)物的量成正比，因此其活性就可以用 Picogreen熒光強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
[0016] 本發(fā)明的測(cè)定方法包含以下方面： I. UDNA的制備 弓I物 F :5' -cggatcgccacactcacaacaat-S' ; 弓I物 R :5，-aaaggccgggaaatacccagcc-3，; PCR 模板：λ DNA PCR反應(yīng)： _

【權(quán)利要求】
1. 一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首 先是PCR擴(kuò)增反應(yīng)：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進(jìn) 行聚合反應(yīng)，進(jìn)行擴(kuò)增，生成含有dU的擴(kuò)增產(chǎn)物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反 應(yīng)：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測(cè)定反應(yīng) 體系中單鏈DNA產(chǎn)物或UDNA雙鏈的相對(duì)量，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果推導(dǎo)出尿嘧啶-DNA糖基化酶 活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應(yīng)體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單 鏈DNA產(chǎn)物的量成正比。
2. 如權(quán)利要求1所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方法，其特征在于，雙鏈UDNA 或單鏈DNA的相對(duì)量是利用熒光染料，通過(guò)熒光法測(cè)得的，并且雙鏈UDNA或單鏈DNA的相 對(duì)量是以熒光強(qiáng)度表示的。
3. 如權(quán)利要求2所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的熒 光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權(quán)利要求3所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的染 料是pi cogreen染料。
5. 如權(quán)利要求1所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的雙 鏈DNA模板是λ DNA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/34GK104293927SQ201410502151
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】徐曉昱, 劉來(lái)花, 王靜 申請(qǐng)人:南京諾唯贊生物科技有限公司