一種糖尿病視網(wǎng)膜病變代謝記憶檢測(cè)試劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種糖尿病視網(wǎng)膜病變代謝記憶檢測(cè)試劑及其應(yīng)用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，PGCl-a基因中位點(diǎn)（+214)的甲基化是DR代謝記憶的早期診斷標(biāo)志?；谏鲜鲅芯?，本發(fā)明提供用于檢測(cè)診斷標(biāo)志的檢狽B式劑，制備了相應(yīng)的檢狽B式劑盒。本發(fā)明提供甲基化檢測(cè)試劑，可以定性或定量的檢測(cè)被測(cè)試對(duì)象PGC1-a基因位點(diǎn)+214是否發(fā)生了甲基化及甲基化程度，從而預(yù)測(cè)被測(cè)試對(duì)象是否有DR代謝記憶及患病風(fēng)險(xiǎn)，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種糖尿病視網(wǎng)膜病變代謝記憶檢測(cè)試劑及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種DR代謝記憶檢測(cè)試劑及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR)是糖尿?。―iabetes mellitus， DM)最常見和最嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥，是工作年齡段人群最主要的致盲原因。目前全球DM患 者人數(shù)高達(dá)3. 47億，近30%的DM患者有不同程度的DR，3730萬(wàn)DR患者的視力受到威脅。 若不立即采有效措施，預(yù)估至2030年全球DR患者將增至1. 9億，而視力受到威脅的DR患 者將增至5630萬(wàn)。因此，研究DR的發(fā)生發(fā)展，尋求有效控制DR的新手段，具有重要意義也 刻不容緩。
[0003] "代謝記憶（Metabolic memory,MM) "現(xiàn)象是指，糖尿病患者發(fā)病時(shí)，早期高血糖的 環(huán)境能夠被糖尿病機(jī)體靶器官（如眼、心臟、腎臟、四肢）長(zhǎng)時(shí)間的所"記憶"，如果高血糖不 能及時(shí)調(diào)整到正常，即使后來(lái)血糖持續(xù)穩(wěn)定在正常
[0004] 水平，其慢性并發(fā)癥（包括視網(wǎng)膜病變）仍然會(huì)發(fā)生發(fā)展，難以逆轉(zhuǎn)。代謝記憶現(xiàn) 象的提出標(biāo)志著對(duì)糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了一個(gè)突破性的進(jìn)展，同時(shí)也對(duì)其防治 提出了新的挑戰(zhàn)。DR發(fā)病機(jī)制的研究是糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制研究的重要內(nèi)容，代謝記憶 也同樣指導(dǎo)著DR發(fā)病機(jī)制及其防治的研究，兩者是不可分割的統(tǒng)一整體。
[0005] 隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)與糖尿病病變關(guān)系的深人研究，表觀遺傳修飾作為代謝記憶效 應(yīng)產(chǎn)生的可能機(jī)制已得到廣泛論證。表觀遺傳修飾主要包括影響基因表達(dá)的DNA甲基化和 組蛋白乙酞化修飾。如何找到參與DR代謝記憶的關(guān)鍵酶，在DR的發(fā)生與發(fā)展及代謝記憶 的產(chǎn)生過(guò)程中起重要作用的物質(zhì)，能夠預(yù)測(cè)DR代謝記憶的指標(biāo)成為廣大科研工作者共同 奮斗的目標(biāo)。
[0006] 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體Y輔助激活因子I a (peroxisome proliferator-activated receptor Y coactivator I a，PGCl_a)，由PPARGC1A基因編 碼，是轉(zhuǎn)錄輔助激活因子PGCl家族中最出名的成員。PGCl-a -方面能增強(qiáng)線粒體的合成 功能；另一方面能夠減少線粒體代謝副產(chǎn)物的堆積，它可通過(guò)調(diào)控許多ROS清除酶的活性 而減少ROS的毒性作用。因而，PGCl- a對(duì)整個(gè)線粒體代謝發(fā)揮了積極的調(diào)節(jié)作用。PGCl- a 已成為治療DM等代謝疾病的新靶點(diǎn)，但是，目前PGCl-a在DR及其代謝記憶中發(fā)揮的作用 尚不明確，有待進(jìn)一步研究。
[0007] 本發(fā)明研究了 PGCl-a及其表觀遺傳修飾在DR代謝記憶中的作用。研究在體 外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中PGCl-a和S0D2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，分析高糖 對(duì)PGCl-a和S0D2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響以及是否具有代謝記憶現(xiàn)象。同時(shí)檢測(cè)編碼 PGCl-a的PPARGC1A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)，找到了一個(gè)與代謝記憶效應(yīng)相 關(guān)的甲基化位點(diǎn)。進(jìn)一步的，本發(fā)明還根據(jù)該甲基化位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成了其甲基化檢測(cè)引物 并制備了適用于該甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)試劑，所述檢測(cè)試劑檢測(cè)靈敏度高達(dá)5% ;操作簡(jiǎn)單、 穩(wěn)定性好，為DR代謝記憶的早期診斷及防治提供了有力的技術(shù)支持，給臨床實(shí)踐以指導(dǎo)作 用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，PGCl-a基因的一個(gè)位點(diǎn)（+214位點(diǎn)，具體見序列 表中SEQ ID NO 1，所述+214位點(diǎn)位于SEQ ID NO 1第502個(gè)堿基處）在高糖引起的代謝 記憶細(xì)胞中高度甲基化，而在正常對(duì)照中均處于非甲基化狀態(tài)，提示PGCl-a基因中位點(diǎn) (+214)的甲基化是糖尿病代謝記憶的早期診斷標(biāo)志。
[0009] 本發(fā)明的目的在于證實(shí)PGCl- a基因及其表觀遺傳修飾在DR代謝記憶中的作用。 所述的對(duì)PGCl- a基因及其表觀遺傳修飾的檢測(cè)可用于DR代謝記憶早期診斷。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)試劑，采用所述的檢測(cè)試劑組分中的一種 或幾種可以檢測(cè)PGCl-a基因位點(diǎn)+214的甲基化程度。
[0011] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)試劑可用于DR代謝記憶的早期診斷、篩查和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)。
[0012] 進(jìn)一步，所述的檢測(cè)試劑是用于檢測(cè)PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化的檢測(cè)試劑。
[0013] 進(jìn)一步，所述的檢測(cè)試劑包括DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒和PGCl-a基因位點(diǎn) +214甲基化檢測(cè)試劑盒。
[0014] 所述的PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化檢測(cè)可以是現(xiàn)有甲基化檢測(cè)技術(shù)中任意一 種能檢測(cè)PGCl-a基因位點(diǎn)+214是否甲基化的檢測(cè)方法。已知現(xiàn)有常用的CpG島甲基化 檢測(cè)方法有甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法、NaHSO 3法（Sodium bisulfite法）、芯片技術(shù) 方法。NaHSO3法包括BSP測(cè)序法（BSP sequencing)、聯(lián)合NaHSO3限制性分析法（COBRA)、 甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)、熒光定量法（Methylight)。芯片技術(shù) 方法包括甲基化高密度芯片（CpG Islands microarray)、差異甲基化雜交（Differential Methylation Hybridization，DMH)、甲基化特異性寡核苷酸芯片（methylation specific oligonucleotide microarray, MSO microarray)。
[0015] 甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法是經(jīng)典的甲基化分析方法，主要根據(jù)一些限制性 內(nèi)切酶不能切開甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳動(dòng)物DNA中，只有CG相連的 胞嘧啶能夠被甲基化，因此，在酶切位點(diǎn)內(nèi)包含CG序列的限制性內(nèi)切酶就會(huì)遇到問題。這 種方法所使用的兩個(gè)經(jīng)典酶對(duì)是HPa II-Msp I(CCGG)和SmaI-Xma I (CCCGGG)。由于第二 對(duì)限制酶識(shí)別序列非常罕見，所以一般都用HPa II-Msp I (CCGG)。兩個(gè)酶都識(shí)別CCGG序 列，而當(dāng)其中的胞嘧啶甲基化時(shí)，HPaII不能夠?qū)⑵淝虚_，利用Hpa II-Msp工的這種屬性處 理DNA，這就使得HPa II-Msp I能夠作為快速甲基化分析的工具，隨后進(jìn)行Southern或PCR 擴(kuò)增分離立物，明確甲基化狀態(tài)。
[0016] NaHSO3可將非甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，后者經(jīng)PCR擴(kuò)增變成T而產(chǎn)生T:A配對(duì)，但甲 基化的C則能抵抗NaHSO 3的修飾，這樣DNA包含的甲基化信息就可轉(zhuǎn)化為DNA序列的差異。 由此發(fā)展了多種CpG島甲基化檢測(cè)方法，如BSP測(cè)序、PCR(C0BRA，MSP，Methelight等）、芯 片雜交技術(shù)（microarray)，此類方法適應(yīng)于檢測(cè)己知基因中一個(gè)或多個(gè)CpG島的幾個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化，屬位點(diǎn)特異性DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)。
[0017] 芯片技術(shù)的發(fā)展為高通量研究DNA甲基化提供了新的方法。它的方法原理大致可 分為3種：（1)基于亞硫酸氫鹽處理后C/T轉(zhuǎn)變的原理，（2)基于甲基化敏感性內(nèi)切酶或者 甲基化依賴性內(nèi)切酶的方法，（3)基于5-甲基胞嘧啶抗體或者M(jìn)BD的免疫撲獲方法富集甲 基化的DNA片段。
[0018] 進(jìn)一步，所述的PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化檢測(cè)試劑盒采用BSP測(cè)序法對(duì) PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化進(jìn)行檢測(cè)。所述的試劑盒包括一對(duì)BSP檢測(cè)引物。進(jìn)一步， 所述BSP檢測(cè)引物采用序列表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3。
[0019] 進(jìn)一步，所述的PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化檢測(cè)試劑盒采用MSP測(cè)序法對(duì) PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化進(jìn)行檢測(cè)。所述的試劑盒包括一對(duì)甲基化檢測(cè)引物和一對(duì)非 甲基化檢測(cè)引物。進(jìn)一步，所述甲基化檢測(cè)引物采用序列表SEQ ID N04和SEQ ID N05;所 述的非甲基化檢測(cè)引物采用序列表SEQ ID N06和SEQ ID N07。所述的甲基化檢測(cè)試劑盒 還包括全甲基化基因組DNA陽(yáng)性對(duì)照、非甲基化基因組DNA陰性對(duì)照以及PCR擴(kuò)增體系所 需的其他常用試劑，如dNTP、DNA聚合酶、緩沖液等。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供PGCl- a基因位點(diǎn)+214在制備一種DR代謝記憶診 斷試劑中的應(yīng)用。
[0021] 進(jìn)一步，所述的診斷試劑通過(guò)檢測(cè)PGCl-a基因位點(diǎn)+214是否發(fā)生甲基化來(lái)確定 被檢測(cè)對(duì)象是否存在DR代謝記憶。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 本發(fā)明制備的PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化檢測(cè)系統(tǒng)，可以定性或定量的檢測(cè)被 測(cè)試對(duì)象PGCl- a基因位點(diǎn)+214是否發(fā)生了甲基化及甲基化程度，從而預(yù)測(cè)被測(cè)試對(duì)象是 否有DR代謝記憶及患病風(fēng)險(xiǎn)，能夠做出早期、快速的診斷，給臨床實(shí)踐以指導(dǎo)作用。利用本 發(fā)明引物、反應(yīng)體系及其條件檢測(cè)PGCl-a基因DNA甲基化其檢測(cè)靈敏度高，可達(dá)5% ;操 作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好。本發(fā)明為DR記憶代謝的早期診斷及防治提供了有力的技術(shù)支持，具有 很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1?各組HRMECs細(xì)胞活力；
[0025] 圖2.高糖對(duì)HRMEC中S0D2轉(zhuǎn)錄水平的影響；
[0026] 圖3.高糖對(duì)HRMEC中PGCl-a轉(zhuǎn)錄水平的影響；
[0027] 圖4.第1天時(shí)各組細(xì)胞S0D2和PGCl-a蛋白表達(dá)量灰度圖；
[0028] 圖5.第7天時(shí)各組細(xì)胞S0D2和PGCl-a蛋白表達(dá)量灰度圖；
[0029] 圖6. BSP-PCR產(chǎn)物鑒定圖。
[0030] 圖7. PPARGC1A基因啟動(dòng)子區(qū)待測(cè)CpG位點(diǎn)示意圖及編號(hào)

【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
[0032] 實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)分組
[0033] 實(shí)驗(yàn)材料與試劑：
[0034] 正常人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs，cAP-OOlOTM)，美國(guó) Angio-Proteomie 公司；內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (ENDO-Basal medium) ,ScienCell ;胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS) ,ScienCell;內(nèi)皮 細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Endothelial cell growth supplement，ECGS)，ScienCell ;青霉素-鏈霉素 雙抗（Penicillin-Streptomycin)，ScienCell ;牛血楽纖維粘連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N)， ScienCell ;0? 25%膜蛋白酶（Trypsin) ,Poputech ;D_ 葡萄糖（D-Glucose)，Sigma ;D_ 甘露 醇（D-Mannitol), Sigma。
[0035] 將HRMECs根據(jù)干預(yù)處理因素分為5組，具體分組及處理方法見表1。
[0036] 表1?實(shí)驗(yàn)分組及處理

【權(quán)利要求】
1. 一種糖尿病視網(wǎng)膜病變代謝記憶檢測(cè)試劑，其特征在于，采用所述檢測(cè)試劑組分中 的一種或幾種檢測(cè)PGCl-a基因位點(diǎn)+214的甲基化程度，所述PGCl-a基因位點(diǎn)+214位 于SEQ ID NO 1第502個(gè)堿基處。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑，其特征在于，所述檢測(cè)試劑包括采用下列方法中 任意一種或幾種的組合對(duì)PGCl-a基因位點(diǎn)+214的甲基化程度進(jìn)行檢測(cè)所需的試劑：甲基 化敏感的限制性內(nèi)切酶方法、NaHSO 3法、芯片技術(shù)方法；所述NaHSO3法包括BSP測(cè)序法、聯(lián) 合NaHSO3限制性分析法、甲基化特異性PCR、熒光定量法；所述芯片技術(shù)方法包括甲基化高 密度芯片、差異甲基化雜交、甲基化特異性寡核苷酸芯片。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑，其特征在于，所述檢測(cè)試劑包括DNA亞硫酸氫鹽修 飾試劑盒和PGCl-a基因甲基化檢測(cè)試劑盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)試劑，其特征在于，所述甲基化檢測(cè)試劑盒采用BSP測(cè)序 法對(duì)PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化進(jìn)行檢測(cè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑，其特征在于，所述的甲基化檢測(cè)試劑 盒包括一對(duì)BSP檢測(cè)引物，檢測(cè)引物序列為SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)試劑，其特征在于，其特征在于，所述甲基化檢測(cè)試劑盒 采用MSP測(cè)序法對(duì)PGCl-a基因位點(diǎn)+214甲基化進(jìn)行檢測(cè)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或6任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑，其特征在于，所述的甲基化檢測(cè)試劑 盒包括一對(duì)甲基化檢測(cè)引物和一對(duì)非甲基化檢測(cè)引物，所述甲基化檢測(cè)引物序列為SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示，所述非甲基化檢測(cè)引物序列為SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所 /Jn 〇 8. PGCl-a基因位點(diǎn)+214在制備一種診斷試劑中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的診斷試劑通過(guò)檢測(cè)PGCl-a基因位 點(diǎn)+214是否發(fā)生甲基化來(lái)確定被檢測(cè)對(duì)象是否有糖尿病代謝記憶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，采用權(quán)利要求1-7任意一 項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑檢測(cè)PGCl-a基因位點(diǎn)+214是否發(fā)生甲基化。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104212908SQ201410504888
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】陳有信, 張古沐陽(yáng), 馬楠, 田蓉, 張辰茜, 張夢(mèng)雨 申請(qǐng)人:陳有信