一株中華鱉氣單胞菌噬菌體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種中華鱉氣單胞菌噬菌體，保藏號為CGMCC：No.9623,該噬菌體核酸部分序列片段與氣單胞菌噬菌體同源性達(dá)到75%以上,能對中華鱉嗜水氣單胞菌形成噬菌斑,對致病性氣單胞菌具有裂解作用,可用于對氣單胞菌所導(dǎo)致的疾病采用生物療法治療和預(yù)防。本發(fā)明的有益效果在于：特異性強、副作用小、增殖能力強、不易產(chǎn)生抗性、病原菌依賴性、使用方便，對中華鱉爛脖子病和白點病等具有顯著的治療作用。采用本發(fā)明治療中華鱉爛脖子病和白點病等能達(dá)到特異性強、副作用小、增殖能力強、不易產(chǎn)生抗性、病原菌依賴性、使用方便的目的。
CGMCC No9623
20140828
【專利說明】一株中華鱉氣單胞菌噬菌體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種中華鱉氣單胞菌噬菌體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 中華鳘（Trionyx sinensis)是我國淡水養(yǎng)殖名優(yōu)產(chǎn)品中的主要種類，病害一直是 鱉養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的重要限制因素，其中細(xì)菌性疾病是我國中華鱉養(yǎng)殖的主要疾病。 目前已經(jīng)報道了氣單胞菌、愛德華氏菌、變形桿菌等致病細(xì)菌，可引起腹水病、紅底板病、白 斑（點）病、紅脖子病、腐皮穿孔病、白底板病、胃腸炎病、癤瘡病、爛尾（爪、頸）病等。其 中以氣單胞菌最多，可引起甲魚腸道出血性敗血癥、鱉穿孔病(癤瘡病)、紅脖子紅底板病等 疾病，是迄今為止對中華鱉養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病原菌。這類細(xì)菌可長期潛伏在鱉體內(nèi)而不 致病，但當(dāng)環(huán)境突變或受污染、鱉體抵抗力下降時則可迅速導(dǎo)致疾病發(fā)生或流行。目前龜鱉 病害防控主要采用抗生素、消毒劑等，雖能在一定程度上起到防治作用，但用藥量大、有效 期短，特別是抗生素的長期使用存在誘導(dǎo)耐藥菌、引發(fā)水產(chǎn)品質(zhì)量安全和產(chǎn)生環(huán)境污染等 問題。
[0003] 噬菌體是細(xì)菌的病毒，其中的烈性噬菌體可在敏感菌細(xì)胞內(nèi)增殖并使之裂解，是 細(xì)菌的"天然殺手"，噬菌體也因此成為細(xì)菌性病害的防治途徑之一。與抗生素相比，噬菌體 還具有特異性強、副作用小、增殖能力強、不易產(chǎn)生抗性、病原菌依賴性以及使用方便等特 點，是一種綠色的生物防治措施。
[0004] 文獻(xiàn)《中華鱉嗜水氣單胞菌病的研究》（陳建酬，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2000)指 出隨著中華鱉集約化養(yǎng)殖規(guī)模的發(fā)展，由氣單胞菌引起的中華鱉疾病也日益成為中華鱉養(yǎng) 殖的主要病害，其中以嗜水氣單胞菌引起的病害較為常見。文獻(xiàn)《不同來源嗜水氣單胞菌 的抗菌素耐藥性及耐藥機制分析》（宋鐵英，福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008)對分離到12株具有1個 以上多拷貝質(zhì)粒的菌株中，有11株呈現(xiàn)高度耐藥性，多次使用抗生素會大幅加強菌株的耐 藥強度而使抗生素失去藥效。文獻(xiàn)《中華鱉致病性嗜水氣單胞菌分離鑒定與藥敏試驗》采 用K-B法藥敏試驗和96孔微型板二倍稀釋法測定9種抗菌藥物對該菌的最低抑菌濃度 (MIC)來分析抗菌效果，發(fā)現(xiàn)該菌對其中5種頭孢類藥物、加替沙星和惡喹酸等藥物表現(xiàn) 高度敏感，對磷霉素和氟甲喹中度敏感，頭孢類藥物優(yōu)于喹諾酮類藥物，鋒哌螂磕抗菌 效果最好，而長期使用抗菌藥物會污染水質(zhì)，同時增強嗜水氣單胞菌的耐藥性。文獻(xiàn)《嗜 水氣單胞菌感染現(xiàn)狀及耐藥分析》（童照威，中國微生態(tài)學(xué)雜志，2008)分離到34株嗜水氣 單胞菌，發(fā)現(xiàn)其對哌拉西林、替卡西林、阿莫西林/克拉維酸、妥布霉素、頭孢呋辛、頭孢噻 肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明耐藥率為52. 9%?73. 5%。文獻(xiàn)《谷氨酰胺對嗜水氣 單胞菌致病中華鱉的保護(hù)作用》（杜宗君，四川動物，2014)發(fā)現(xiàn)注射Gin可緩解嗜水氣單 胞菌對中華鱉的致病作用，有效恢復(fù)機體抗氧化及非特異免疫力，降低死亡率，但是并不 能治愈被嗜水氣單胞菌感染致病的中華鱉，僅起到緩解作用。中國專利CN1112022公開了 一種治療嗜水氣單胞菌病的高免血清及制備方法，通過菌種提取、抗原制備、動物免疫、采 血制備血清、配制等過程制造出的高免血清，可對嗜水氣單胞菌病有較好療效，但是制作過 程復(fù)雜，成本極高，不適用于大規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)。中國專利CN102240323A公開了一種用于防控 水生動物嗜水氣單胞菌病的中藥及其使用方法，以適當(dāng)中藥配比制成提取物計量入藥，可 提高水生動物的免疫力，對致病性嗜水氣單胞菌有明顯抑制功效，但是長久使用會產(chǎn)生病 菌耐藥性，且制藥成本較高，不利于大規(guī)模養(yǎng)殖行業(yè)。中國專利CN103320365A公開了一株 魚源嗜水氣單胞菌拮抗菌株及其應(yīng)用，將一株魚源嗜水氣單胞菌拮抗菌株通過培養(yǎng)作為益 生菌添加制劑添加入飼料或藥物中，可防治大宗大水魚類養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌引起的爆發(fā) 性出血病，但是其工藝復(fù)雜，普適性差，特別是對于中華鱉的治療效果較差，且暫不明其毒 副作用。美國專利US20100221286A1公開了一種對水生動物嗜水氣單胞菌活體疫苗的修 飾（Modified live aeromonas hydrophila vaccine for aquatic animals),通過將突變 株NRRL-B-50040和NRRL-B-50041 -定質(zhì)量配比后作為新的嗜水氣單胞菌疫苗，可以有 效治療嗜水氣單胞菌病，但是其生產(chǎn)工藝非常復(fù)雜，對生產(chǎn)要求極高，且國內(nèi)無法市購，不 能用于大規(guī)模養(yǎng)殖。美國專利US20040077067A1公開了一種從嗜水氣單胞菌表面蛋白中 分離得至丨J的治療藥（Therapeutic and prophylactic agents derived from aeromonas hydrophila bacterial surface proteins),可通過與嗜水氣單胞菌表面蛋白拮抗來抑制 嗜水氣單胞菌，但是生產(chǎn)工藝復(fù)雜，對生產(chǎn)要求高，僅適用于小規(guī)模實驗，而無法用于大規(guī) 模生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決養(yǎng)殖過程中由于中華鱉氣單胞菌病常引起多種中華鱉病害，從而導(dǎo)致養(yǎng) 殖戶大量用藥，引發(fā)食品安全和生態(tài)安全的問題，我們提出了一種中華鱉氣單胞菌噬菌體 及其應(yīng)用，本發(fā)明的噬菌體對多個中華鱉氣單胞菌臨床分離株均有良好的裂解能力，對中 華鱉爛脖子病和白點病等具有良好的治療作用。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種中華鱉氣單胞菌噬菌體，命名為NTHP01，屬于細(xì)菌病 毒雙股DNA病毒（dsDNA virus, no RNA stage)群尾病毒目（Caudovirales)肌尾噬菌體 科(Myoviridae) T4樣噬菌體屬（T4-like viruses),保藏于：中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日2014 年8月28日，保藏號：CGMCC :No. 9623,分類命名為Jerofflmas phage)〇
[0007] 本發(fā)明提供的中華鱉氣單胞菌噬菌體是通過以下步驟獲得的： (1)采用隨機引物擴增法獲得中華鱉氣單胞菌噬菌體DNA序列。
[0008] (i)取中華鱉肝、脾、腎、肺、腸組織勻漿，12000rpm/min離心20min ; (ii )取上清液0. 22 y m過濾，從濾液中提取DNA。
[0009] (iii)以該DNA為模板，94°C變性3 min，冰上冷卻退火延伸2 min，加入0? L 3'_5'exo-Klenow DNA Polymerase后置于37°C水浴lh，重復(fù)一次上述變性、退火及延伸 過程，將DNA末端補平。反應(yīng)體系如下表：

【權(quán)利要求】
1. 一種中華鱉氣單胞菌噬菌體，其特征在于，中華鱉氣單胞菌噬菌體命名為NTHP01， 屬于細(xì)菌病毒雙股DNA病毒（dsDNA virus, no RNA stage)群尾病毒目（Caudovirales)肌 尾噬菌體科(myoviridae) T4樣噬菌體屬（T4-1 ike viruses),保藏于：中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏日2014年8月28日，保藏號：CGMCC:No. 9623。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種中華鱉氣單胞菌噬菌體，其特征在于，該噬菌體核酸部分 序列片段與氣單胞菌噬菌體同源性達(dá)到75%以上。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種中華鱉氣單胞菌噬菌體，其特征在于，該噬菌體能對中華 鱉嗜水氣單胞菌形成噬菌斑，步驟如下： (1) 配制2%LB瓊脂培養(yǎng)基和0. 7%半固體LB培養(yǎng)基，將融化后的2% LB瓊脂培養(yǎng)基傾 注培養(yǎng)皿底層，凝固后為底層培養(yǎng)基，將〇. 7%半固體LB培養(yǎng)基融化后于48°C保溫； (2) 將噬菌體與中華鱉嗜水氣單胞菌混合，吸附15-30min ; (3) 將噬菌體與中華鱉嗜水氣單胞菌混合液體與0. 7%半固體LB培養(yǎng)基混合，傾注在底 層培養(yǎng)基上； (4) 28°C培養(yǎng)8小時，可見透亮的噬菌斑，其直徑約為l-2mm，周圍無暈環(huán)。
4. 一種中華鱉氣單胞菌噬菌體的應(yīng)用，其特征在于，對致病性氣單胞菌具有裂解作用。
5. 如權(quán)利要求4所述的一種中華鱉氣單胞菌噬菌體的應(yīng)用，其特征在于，可用于對氣 單胞菌所導(dǎo)致的疾病采用生物療法治療和預(yù)防。
6. 如權(quán)利要求4和5所述的一種中華鱉氣單胞菌噬菌體的應(yīng)用，其特征在于，所述氣單 胞菌所導(dǎo)致的疾病為中華鱉爛脖子病和白點病。
7. 如權(quán)利要求4、5和6所述的一種中華鱉氣單胞菌噬菌體的應(yīng)用，其特征在于，所述對 中華鱉爛脖子病和白點病治療方法如下： (a) 將已患爛脖子病或白點病的中華鱉放入水中； (b) 每升水中潑灑IX 109噬菌體液0. f 10mL，每2日潑灑1次； (c) 潑灑3-4次，7天左右痊愈。
【文檔編號】C12R1/93GK104450629SQ201410506817
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】劉莉, 曹錚, 許怡, 林鋒, 葉雪平 申請人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所