trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用及鑒定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用及鑒定方法，所述鑒定方法包括以下步驟：利用PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品的trnH-psbA序列并進(jìn)行測(cè)序，如果trnH-psbA序列的278bp堿基為A、308bp堿基為T(mén)，則判定待測(cè)樣品為南湖菱。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法和DNA指紋標(biāo)記相比，本發(fā)明利用trnH-psbA序列作為DNA條形碼鑒定南湖菱，可通過(guò)對(duì)trnH-psbA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，直接獲得鑒定結(jié)果，檢測(cè)準(zhǔn)確性高、可重復(fù)性高，鑒定時(shí)間短。
【專(zhuān)利說(shuō)明】trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用及 鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定 南湖菱中的應(yīng)用及鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 南湖菱（Trapa acornis Nakano)為菱科菱屬植物，又名無(wú)角菱、和尚菱等，因主產(chǎn) 浙江嘉興南湖而得名，是我國(guó)特產(chǎn)的水生經(jīng)濟(jì)作物，2009年獲得國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品稱(chēng) 號(hào)。南湖菱果實(shí)無(wú)角、殼薄，富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和抗癌活性成分，具有重要的 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。
[0003] 目前，尚無(wú)關(guān)于南湖菱分子鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道。關(guān)于菱屬植物的分類(lèi)學(xué)研究多集中 在常規(guī)的形態(tài)分類(lèi)學(xué)以及數(shù)量分類(lèi)學(xué)、細(xì)胞分類(lèi)學(xué)、花粉形態(tài)學(xué)等方面，對(duì)菱各品種的聚類(lèi) 分析存在一定差異。由于菱的株葉形態(tài)及去除菱殼后的果肉等營(yíng)養(yǎng)形態(tài)基本相同，依靠傳 統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)學(xué)方法在南湖菱的鑒別上存在局限性。近年來(lái)已有應(yīng)用分子生物學(xué)方法研究 菱屬植物親緣關(guān)系及分子鑒別的研究報(bào)道，研究結(jié)果多集中在應(yīng)用DNA指紋標(biāo)記對(duì)菱屬植 物進(jìn)行分類(lèi)及系統(tǒng)進(jìn)化方面。鑒于菱在農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域的重要作用，針對(duì)其種質(zhì)混亂及鑒 別方法的不統(tǒng)一性，對(duì)單一品種菱建立一套可靠的分子鑒別方法勢(shì)在必行。
[0004] DNA條形碼（DNA barcoding)技術(shù)是利用標(biāo)準(zhǔn)的、具有足夠變異的、易擴(kuò)增且相 對(duì)較短的DNA片段在物種內(nèi)的特異性和物種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別 系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速自動(dòng)鑒定。DNA條形碼技術(shù)研究中常用的DNA序列有marK、 trnH-psbA、rbcL和ITS等。該技術(shù)已被成功應(yīng)用于生物物種分類(lèi)和鑒定等領(lǐng)域，并成為進(jìn) 展最迅速的學(xué)科前沿之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)南湖菱的trnH-psbA序列的278bp和308bp堿基與其它品種 存在差異，基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了 trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的 應(yīng)用。
[0006] trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明還提供了 trnH-psbA序列作為DNA條形碼在制備鑒定南湖菱試劑盒中的應(yīng) 用。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種鑒定南湖菱的方法，包括以下步驟：
[0009] 利用PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品的trnH-psbA序列并進(jìn)行測(cè)序，如果trnH-psbA序列的 278bp堿基為A、308bp堿基為T(mén)，則判定待測(cè)樣品為南湖菱。
[0010] 鑒定范圍為菱角，可以包括浙江嘉興南湖菱、浙江溫州二角菱、江蘇南京二角菱、 浙江嘉興四角紅菱及江蘇南京四角菱。
[0011] 南湖菱中所述trnH-psbA序列的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，278bp堿基為A， 308bp堿基為T(mén)，如序列滿足該條件，說(shuō)明樣品為南湖菱。
[0012] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：
[0013] 10XPCRbuffer，2y L ;dNTP mixture，?！?5μ L ;10μΜ 上游引物，0· 5μ L ;10μΜ 下 游引物，〇. 5 μ L ;樣品DNAl μ L ;Taq DNA聚合酶，0. 2 μ L ;補(bǔ)充無(wú)菌水至20 μ L。
[0014] 所述PCR擴(kuò)增的引物對(duì)為：
[0015] 上游引物：5, -TCCGCCCCTTACTTTCTTCC-3，
[0016] 下游引物：5 ' -CGTAATGCTCACAACTTCCCT-3 '。
[0017] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：
[0018] 94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 36 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 IOmin ;4°C保溫 5min。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種鑒定南湖菱的DNA條形碼，堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0020] 與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法和DNA指紋標(biāo)記相比，本發(fā)明利用trnH-psbA序列作為 DNA條形碼鑒定南湖菱，可通過(guò)對(duì)trnH-psbA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，直接獲得鑒定結(jié)果， 檢測(cè)準(zhǔn)確性高、可重復(fù)性高，鑒定時(shí)間短。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是南湖菱果實(shí)照片。
[0022] 圖2是本發(fā)明的南湖菱及其他品種菱trnH-psbA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖，其 中，泳道1?5分別為：浙江嘉興南湖菱（Tl-I)、浙江溫州二角菱（T2-1)、江蘇南京二角菱 (T2-2)、浙江嘉興四角紅菱（T3-1)、江蘇南京四角菱（T3-2)，M為DL2000plus DNAmarker。
[0023] 圖3是南湖菱及其他品種菱trnH-psbA序列的比對(duì)，黑色箭頭分別標(biāo)注南湖菱 trnH-psbA序列的序列特異位點(diǎn)，第278bp堿基為"A"、308bp堿基為"T"。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。
[0025] 實(shí)施例1南湖菱的分子鑒定
[0026] 分別從浙江、江蘇等地采集菱屬三個(gè)類(lèi)別的5個(gè)居群的菱角果實(shí)，其中南湖菱分 別從浙江省嘉興市南湖區(qū)和秀洲區(qū)共4個(gè)地點(diǎn)取樣。5個(gè)鑒定樣品分別為浙江嘉興南湖菱、 浙江溫州二角菱、江蘇南京二角菱、浙江嘉興四角紅菱及江蘇南京四角菱。南湖菱果實(shí)照片 參見(jiàn)附圖1。
[0027] 利用CTAB法提取上述菱角果肉的基因組DNA，利用Trapa-Fl及Trapa-Rl引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增使用rTaq (Takara，大連，中國(guó)）。
[0028] Trapa-Fl :5, -TCCGCCCCTTACTTTCTTCC-3，
[0029] Trapa-Rl :5, -CGTAATGCTCACAACTTCCCT-3，
[0030] PCR 擴(kuò)增體系為：10XPCRbuffer，2y L ;dNTP mixture，?！?5μ L ;10μΜ Trapa-Fl 引物，0· 5μ L ;10μΜ Trapa-Rl 引物，0· 5μ L ;樣品 DNAly L ;Taq DNA聚合酶，0· 2μ L ;補(bǔ)充 無(wú)菌水至20 μ L。
[0031] PCR 擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 共36個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保溫5min。
[0032] 使用I. 5%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，鑒定。電泳圖譜參見(jiàn)附圖2。
[0033] 將PCR產(chǎn)物送由生物公司純化后測(cè)序（測(cè)序所用引物與PCR所用引物相同），所得 基因序列經(jīng)校正后即為目的基因序列。用DNAMN序列比對(duì)軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)。序列 比對(duì)結(jié)果見(jiàn)附圖3。南湖菱的trnH-psbA序列在278bp堿基為"A"、308bp堿基為"T"。
【權(quán)利要求】
1. trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用。 2. trnH-psbA序列作為DNA條形碼在制備鑒定南湖菱試劑盒中的應(yīng)用。
3. -種鑒定南湖菱的方法，包括以下步驟： 利用PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品的trnH-psbA序列并進(jìn)行測(cè)序，如果trnH-psbA序列的278bp 喊基為A、308bp喊基為T(mén)，則判定待測(cè)樣品為南湖菱。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為： 10XPCRbuffer，2y L ;dNTP mixture，。· 5μ L ;10μΜ 上游引物，0· 5μ L ;10μΜ 下游引 物，〇· 5 μ L ;樣品DNA1 μ L ;Taq DNA聚合酶，0· 2 μ L ;補(bǔ)充無(wú)菌水至20 μ L。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的引物對(duì)為： 上游引物：5' -TCCGCCCCTTACTTTCTTCC-3' 下游引物：5' -CGTAATGCTCACAACTTCCCT-3'。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為： 94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，共36個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin ;4。。保溫 5min。
7. -種鑒定南湖菱的DNA條形碼，其特征在于，堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293935SQ201410509124
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】李軍, 李白, 高廣春, 黃嬛 申請(qǐng)人:浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所）