皮膚剝脫綜合征新的致病基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明鑒定了與皮膚剝脫綜合征相關(guān)的新的隱性致病基因。具體地，發(fā)明人以皮膚剝脫綜合征患病家系為研究對(duì)象，對(duì)該家系中的患病個(gè)體和非患病個(gè)體進(jìn)行了外顯子組測(cè)序和比較，在CAST基因中發(fā)現(xiàn)一個(gè)移碼突變(c.607_608insAfs)，該突變?cè)斐蒀AST蛋白質(zhì)翻譯提前中斷。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的CAST基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用，包含突變的CAST基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。利用該突變的CAST基因，可以對(duì)皮膚剝脫綜合征進(jìn)行分子診斷和患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。該突變基因及其編碼蛋白質(zhì)還可作為治療皮膚剝脫綜合征的藥物靶點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】皮膚剝脫綜合征新的致病基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人體變異的基因，尤其涉及一種皮膚剝脫綜合征新的致病基 因-CAST基因。本發(fā)明還涉及突變的CAST基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用，包含突變的CAST 基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚剝脫綜合征（peeling skin syndrome, PSS)是一組罕見(jiàn)的遺傳性皮膚病，臨 床表現(xiàn)以持續(xù)性皮膚角質(zhì)層或者表皮淺層剝脫、鱗屑、紅斑為主要特征，類似"蛻皮"現(xiàn)象。 PSS分為肢端型和系統(tǒng)型兩種不同類型，其中肢端型僅累及手、足末端，表現(xiàn)為手、足反復(fù)脫 屑及紅斑；系統(tǒng)型可累及全身皮膚，根據(jù)是否合并炎癥性改變及過(guò)敏性癥狀分為炎癥型及 非炎癥型。肢端型通常合并其他疾病，而系統(tǒng)型可以合并過(guò)敏性鼻炎、哮喘等其他疾病?；?者的"蛻皮"癥狀可以隨季節(jié)發(fā)生變化，夏重冬輕。組織病理學(xué)表現(xiàn)為角化過(guò)度，以及角質(zhì)層 與顆粒層，或者顆粒淺層出現(xiàn)裂隙。本病導(dǎo)致可患者皮膚出現(xiàn)明顯瘙癢、外觀嚴(yán)重受損，以 及合并各種過(guò)敏性疾病。既往研究認(rèn)為，PSS為常染色體隱性遺傳，主要致病基因?yàn)門GM5、 ⑶SN、CSTA或者CHST8,這些基因在表皮終末分化過(guò)程中起到重要的作用。
[0003] 最近，外顯子組測(cè)序（exome sequencing)被成功地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病的 致病基因，如Freeman - Sheldon綜合癥的MYH3基因，Schinzel-Giedion綜合征的SETBPl 基因，以及嚴(yán)重大腦畸形的WDR62突變等。全外顯子測(cè)序技術(shù)已被證明為降低稀有單基因 疾病候選基因甚至發(fā)現(xiàn)其致病基因的有力、有效手段，僅通過(guò)對(duì)幾個(gè)很少的個(gè)體（包括患 者及正常對(duì)照）的全外顯子進(jìn)行測(cè)序來(lái)篩選與疾病相關(guān)的變異，其成功率大為提升。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的主要目的在于鑒別皮膚剝脫綜合征（PSS)的新的致病基因，定位出該疾 病的基因突變位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，提供PSS致病基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用，包含PSS致病 基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒，以對(duì)皮膚剝脫綜合征進(jìn)行分子診斷和患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為 進(jìn)一步治療該病提供設(shè)計(jì)藥物的靶點(diǎn)，同時(shí)為闡明該病的致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
[0005] 因此，一方面，本發(fā)明提供了突變的CAST基因，所述突變的CAST基因序列與SEQ ID NO: 1相比具有至少1個(gè)非沉默突變，且所述突變的CAST基因?qū)е缕つw剝脫綜合征的發(fā) 生；所述非沉默突變選自插入、缺失和置換中的一種或多種。
[0006] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非沉默突變?yōu)镾EQ ID NO: 1的第607位和608位 之間插入A，其序列如SEQ ID N0:2所示。該突變屬于移碼插入突變，使得CAST基因編碼的 氨基酸序列第203位的異亮氨酸變成了天冬酰胺，第203位以后的氨基酸序列也發(fā)生改變， 直至第210位谷氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，使得多肽鏈合成中斷。
[0007] 第二方面，本發(fā)明還提供了 SEQ ID N0:2序列編碼的蛋白質(zhì)，該序列從203位發(fā)生 變化，到第210位出現(xiàn)終止，所述蛋白質(zhì)只有209個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。而野生型的CAST蛋白具有750個(gè)氨基酸，因此該突變型的CAST蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功 能不同于野生型的CAST蛋白，無(wú)法在機(jī)體中起到正常的作用
[0008] 在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述突變CAST基因的載體。
[0009] 在本發(fā)明的第四方面，提供了被上述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述突變 的CAST基因直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
[0010] 在本發(fā)明的第五方面，提供了上述的突變的CAST基因在作為治療皮膚剝脫綜合 征的藥物靶點(diǎn)或制備皮膚剝脫綜合征疾病診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種用于診斷皮膚剝脫綜合征的試劑盒，所述試劑 盒包含能夠特異性擴(kuò)增CAST基因的引物，或能夠特異性檢測(cè)CAST基因突變的探針。
[0012] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物或探針序列為SEQ ID NO: 1或2所示的序列 中第607位或第608位前后15?30bp長(zhǎng)的序列。
[0013] 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種抗體，所述抗體與上述突變型的CAST蛋白質(zhì)特 異性結(jié)合，且不作用于正常的CAST基因所編碼的蛋白質(zhì)。
[0014] 在本發(fā)明的第八方面，提供了一種皮膚剝脫綜合征治療劑，所述治療劑包含上述 所述的抗體。
[0015] 本發(fā)明通過(guò)外顯子組測(cè)序技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了 CAST基因突變可以導(dǎo)致皮膚剝脫綜合 征的發(fā)病。一方面，通過(guò)檢測(cè)受試者是否攜帶有CAST基因致病突變，可以早期篩查皮膚剝 脫綜合征突變基因攜帶者，提供優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)；也可為皮膚剝脫綜合征患者提供分子診斷 依據(jù)。特別地，本發(fā)明所提供的診斷試劑盒可用于快速、有效地預(yù)測(cè)或診斷皮膚剝脫綜合 征。另一方面，CAST基因首次在人類疾病中被認(rèn)識(shí)，為復(fù)雜的皮膚角質(zhì)化生理過(guò)程提供全 新通路；第三方面，本發(fā)明可以為治療皮膚剝脫綜合征提供可能的藥物靶點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是某六代常染色體皮膚剝脫綜合征家系圖，其中正方形表示男性，圓圈表示 女性；帶斜線為死亡,實(shí)心為患病個(gè)體,空心為正常個(gè)體。
[0017] 圖2是PSS患者癥狀圖。
[0018] 圖3是PSS患者CAST基因的突變位點(diǎn)序列圖。
[0019] 圖4為PSS患者和正常對(duì)照的CAST基因的mRNA表達(dá)qRT-PCR結(jié)果。
[0020] 圖5為透視電鏡法檢測(cè)鈣蛋白酶抑制蛋白結(jié)果。
[0021] 圖6為CAST基因在體內(nèi)的表達(dá)和功能研究分析結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的描述，但是以下描述僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn) 行解釋性說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行任何的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求 書(shū)限定的范圍為準(zhǔn)。
[0023] 在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)術(shù)語(yǔ) 和實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語(yǔ)和常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本 發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。
[0024] 在本發(fā)明中，"CAST(calpastatin)基因"為蛋白酶抑制蛋白的革巴基因，它是f丐蛋白 酶水解系統(tǒng)成員之一。其編碼的蛋白質(zhì)為鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST)是內(nèi)源性專一抑制鈣 蛋白酶（CAPN)活性的蛋白質(zhì)，可專一識(shí)別CAPN與鈣結(jié)合引起的構(gòu)象變化，并能與之結(jié)合。 活性CAST含有5個(gè)結(jié)構(gòu)域，第一個(gè)結(jié)構(gòu)域即L結(jié)構(gòu)域，其功能還不是很清楚。第2?5個(gè) 結(jié)構(gòu)域是4個(gè)結(jié)構(gòu)相似的重復(fù)單位。
[0025] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"外顯子"是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA對(duì) 應(yīng)于基因中的部分。內(nèi)含子是在mRNA加工過(guò)程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。 外顯子和內(nèi)含子都是對(duì)于基因而言的，編碼的部分為外顯子，不編碼的為內(nèi)含子，內(nèi)含子沒(méi) 有遺傳效應(yīng)。
[0026] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"外顯子捕獲"與"芯片雜交"可互換使用，指的是探針對(duì)文庫(kù)中 外顯子區(qū)域的DNA片段進(jìn)行特異性選擇和結(jié)合的過(guò)程。DNA分子正常情況下是雙鏈，因此捕 獲之前，DNA分子必須變?yōu)閱捂湥话闶峭ㄟ^(guò)加熱使其變性而達(dá)到解鏈目的，解鏈的DNA分 子被迅速冷卻，即保持單鏈狀態(tài)。文庫(kù)變性后在雜交平臺(tái)與芯片進(jìn)行捕獲雜交。含有外顯 子區(qū)域的DNA片段與固定在芯片上的探針之間在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行分子雜交。較佳地，芯 片上探針?lè)肿拥臐舛纫h(yuǎn)遠(yuǎn)高于靶分子濃度。待雜交完畢后，通過(guò)變性等方法收集捕獲的 序列并純化，得到來(lái)自捕獲后的序列混合物。
[0027] 在本發(fā)明中，"高通量測(cè)序"是指采用三種第二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序： 454FLX(Roche 公司）、Solexa Genome Analyzer(Illumina 公司）和 Applied Biosystems 公司的SOLID等。這些平臺(tái)共同的特點(diǎn)是極高的測(cè)序通量，相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序的96道毛細(xì)管 測(cè)序，高通量測(cè)序一次實(shí)驗(yàn)可以讀取40萬(wàn)到400萬(wàn)條序列，根據(jù)平臺(tái)的不同，讀取長(zhǎng)度從 25bp到450bp不等，因此不同的測(cè)序平臺(tái)在一次實(shí)驗(yàn)中，可以讀取IG到14G不等的堿基數(shù)。
[0028] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"DNA文庫(kù)"是指對(duì)基因組的目的片段進(jìn)行打斷，獲得一組具有一 定大小的DNA片段混合物。DNA文庫(kù)的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一個(gè)優(yōu)選例 中，還可以對(duì)打斷產(chǎn)物、末端修復(fù)產(chǎn)物、接頭產(chǎn)物和富集產(chǎn)物進(jìn)行純化。對(duì)反應(yīng)的條件進(jìn)行 一定的變化或優(yōu)化也在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。
[0029] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"突變"是指野生型的CAST多核苷酸序列發(fā)生改變，成為變異 體，變異體可以是天然發(fā)生的或非天然發(fā)生的。變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入 變異體。在本發(fā)明中，某一種變異體可以通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)，例如，要得到野生型基因編碼 不完全的變異體，可以通過(guò)在野生型基因序列中插入堿基，使某個(gè)密碼子變?yōu)榻K止密碼子， 或者直接缺失部分序列的方式實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"非沉默突變"是指除了沉默突變以 外的基因突變，包括但不限于錯(cuò)義突變、無(wú)義突變和移碼突變等。
[0030] 本發(fā)明還涉及與所述的CAST核苷酸雜交且兩個(gè)序列之間具有至少80%，較佳地 至少90%，更佳地至少95%，至少99 %同源性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下 與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。
[0031] 本發(fā)明野生型或突變型CAST核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重 組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤 其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方 法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組 法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從 增殖后的宿主細(xì)胞中分尚得到有關(guān)序列。
[0032] 本發(fā)明中，"載體"包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是 商購(gòu)可得的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體包含與上述突變的CAST基因可操作地連 接的表達(dá)控制序列，例如但不限于啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所 述載體任選地還包含選擇標(biāo)記。
[0033] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿 菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等）。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以是細(xì)胞系。
[0034] 本發(fā)明還涉及到CAST突變蛋白質(zhì)，由于在SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列中第607 位和第608位的核苷酸之間插入了 A (圖3)，使得CAST基因編碼的氨基酸序列第203位的 異亮氨酸變成了天冬酰胺，第203位后的氨基酸序列也發(fā)生改變，并致使第210位的谷氨酸 密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，本發(fā)明的CAST突變蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:3所示的序列，與野 生型CAST氨基酸序列的不同之處為：只有209個(gè)氨基酸，缺失了后部分的541個(gè)氨基酸， 因此不具有CAST蛋白質(zhì)正常的功能。本發(fā)明的CAST突變蛋白質(zhì)可以是重組蛋白質(zhì)、天然 蛋白質(zhì)、合成蛋白質(zhì)，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)，即使用重組技術(shù)從原核或真核宿主（例如，細(xì)菌、酵 母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）中產(chǎn)生。
[0035] 在本發(fā)明中，CAS T突變蛋白質(zhì)還涉及具有與CAST突變蛋白質(zhì)相同功能的、SEQ ID NO. 3序列的變異形式。變異形式包括：同源序列、保守性變異體、誘導(dǎo)突變體等。發(fā)明 還涉及CAST突變蛋白質(zhì)類似物。這些類似物膚與CAST突變蛋白質(zhì)的差別可以是氨基酸序 列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。
[0036] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本發(fā)明提供的突變CAST 基因的用途包括但不限于：用作治療皮膚剝脫綜合征的藥物靶點(diǎn)；制備皮膚剝脫綜合征的 診斷試劑盒中；用于產(chǎn)生疾病動(dòng)物模型；為治療皮膚剝脫綜合征提供新的藥物作用途徑。
[0037] 本發(fā)明所述的"試劑盒"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員以CAST野生型或突變型核苷酸為基 因探針，根據(jù)基因雜交的原理，可以檢測(cè)生物樣本中是否存在與該探針序列互補(bǔ)的核苷酸 序列，因此使用這種試劑盒可以檢測(cè)出樣本中是否存在著本發(fā)明的基因突變位點(diǎn)。試劑盒 一般包括：引物、探針、核酸芯片、說(shuō)明書(shū)等，還可能包括與活性成分相容的緩沖液、載體或 媒介等。
[0038] 在本發(fā)明中，"引物"指用于在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的多核苷酸片段，其通常為 寡核苷酸，例如含有至少 5 個(gè)堿基，例如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個(gè)或者更多個(gè)堿基的多核苷酸片段。引物不必與待擴(kuò)增 的目的基因或其互補(bǔ)鏈完全互補(bǔ)，只要其能夠特異性擴(kuò)增目的基因。如本文中所使用的，術(shù) 語(yǔ)"特異性擴(kuò)增"是指引物能夠通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因，而不擴(kuò)增其他基因。例如，特 異性擴(kuò)增CAST基因是指，在PCR反應(yīng)中引物只擴(kuò)增CAST基因，而不擴(kuò)增其他基因，此類引 物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0039] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"特異性檢測(cè)CAST基因突變的探針"是指探針能夠區(qū)分出含有 突變的CAST基因基因與不含有突變的CAST基因。一般而言，可以通過(guò)控制雜交條件的嚴(yán)緊 性，使得探針能夠區(qū)分出含有突變的基因與不含有突變的基因。例如，在高度嚴(yán)緊條件下， 與CAST基因精確互補(bǔ)的探針可以與不含有突變的CAST基因基因雜交，而不與甚至只包含 一個(gè)點(diǎn)突變的突變的CAST基因雜交，從而將二者區(qū)分開(kāi)。同樣，還可以設(shè)計(jì)與突變的CAST 基因基因精確互補(bǔ)的探針，從而其在高度嚴(yán)緊條件下與突變的CAST基因雜交，而不與不含 有突變的CAST基因雜交。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，探針的設(shè)計(jì)和雜交技術(shù)是熟知的。
[0040] 本發(fā)明涉及對(duì)突變的CAST蛋白質(zhì)具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其 是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于突變的CAST蛋白質(zhì)。較佳地，指那些能 與突變的CAST蛋白質(zhì)產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于野生型的CAST蛋白質(zhì)相關(guān)抗原分 子的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體 片段，如Fab，或（Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子或嵌合抗 體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
[0041] 本發(fā)明的突變的CAST蛋白質(zhì)抗體可以用來(lái)鑒定突變的CAST蛋白質(zhì)。例如，可以 用一種可檢測(cè)的分子例如熒光素異硫氰酸（FITC)來(lái)標(biāo)記突變的CAST蛋白質(zhì)特異抗體，然 后讓突變的CAST蛋白質(zhì)特異抗體與樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)出與突 變的CAST蛋白質(zhì)特異抗體結(jié)合的樣品，從而為預(yù)測(cè)或診斷患者是否存在特發(fā)性皮膚剝脫 綜合征提供依據(jù)和指導(dǎo)。
[0042] 本發(fā)明的突變的CAST蛋白質(zhì)抗體還可以用來(lái)中和突變的CAST蛋白質(zhì)。如果有足 夠的數(shù)據(jù)表明某個(gè)體的PSS與本發(fā)明突變CAST蛋白質(zhì)的存在相關(guān)，可以考慮用突變的CAST 蛋白質(zhì)特異性抗體中和這些致病突變CAST蛋白質(zhì)分子，從而緩解患者的病癥。
[0043] 實(shí)施例1 :樣本獲取
[0044] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個(gè)常染色體隱形遺傳的皮膚剝脫綜合征家系（如圖1所 示）。患者（圖1中黑色實(shí)心所示個(gè)體）來(lái)自近親婚育的家族中，父母表型正常，患者除了 典型PSS癥狀以外，患者還合并出現(xiàn)淺表性水皰、白甲、掌跖角化、干燥性唇炎以及指節(jié)墊 損害，組織病理學(xué)表現(xiàn)為表皮角化過(guò)度，顆粒層及棘細(xì)胞層上部角質(zhì)形成細(xì)胞松解（如圖2 所示）?；颊呶春喜⑵渌到y(tǒng)異常，神經(jīng)系統(tǒng)及智力發(fā)育正常。
[0045] 發(fā)明人以這位患者及其父母作為研究樣本，并采集每位研究對(duì)象的外周血作為研 究樣品，加入EDTA抗凝，-80°C保存。所有血樣均簽屬知情同意書(shū)，并獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
[0046] 實(shí)施例2 :樣本DNA制備
[0047] 采集皮膚剝脫綜合征患者及其父母的外周血，采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全 血DNA提取試劑盒從外周血樣品中提取DNA，提取步驟如下：
[0048] (1)取 2ml 全血樣本，加入 150ul OB Protease，2. Iml Buffer BL 和 20ul RNase A,最大速度漩渦1分鐘,徹底混勻。
[0049] ⑵65攝氏度水浴15-20分鐘，并在水浴過(guò)程中漩渦5次。
[0050] (3)加入2. 2ml無(wú)水乙醇，最大速度漩潤(rùn)30秒，徹底混勻。
[0051] (4)將3. 5ml裂解液移入帶過(guò)濾柱的15ml離心管，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過(guò)濾 柱,倒掉過(guò)濾液體,放回過(guò)濾柱。
[0052] (5)將第3步剩余裂解液加入帶過(guò)濾柱的15ml離心管，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出 過(guò)濾柱，倒掉過(guò)濾液體，放回過(guò)濾柱。
[0053] (6)加入3ml HB Buffer，洗滌過(guò)濾柱，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過(guò)濾柱，倒掉過(guò)濾 液體，放回過(guò)濾柱。
[0054] (7)加入3ml DNA Wash Buffer，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過(guò)濾柱，倒掉過(guò)濾液體， 放回過(guò)濾柱。
[0055] (8)再次加入3ml DNA Wash Buffer，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過(guò)濾柱，倒掉過(guò)濾液 體，放回過(guò)濾柱。
[0056] (9)4000轉(zhuǎn)離心15分鐘，甩干過(guò)濾柱。
[0057] (10)將過(guò)濾柱移至新的15ml離心管，加入500ul 70攝氏度的Elution Buffer， 室溫靜置5分鐘，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集含有DNA的過(guò)濾液。
[0058] (11)再次將過(guò)濾柱移至新的15ml離心管，加入500ul 70攝氏度的Elution Buffer，室溫靜置5分鐘，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集含有DNA的過(guò)濾液。
[0059] (12)利用分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度及純度，所得的每個(gè)標(biāo)本基因組DNA的 0D260/0D280均位于1. 7?2. 0之間，濃度不少于200ng/ul，總量不少于30μ g。
[0060] 實(shí)施例3 :外顯子捕獲與測(cè)序
[0061] 發(fā)明人用NimbleGen SeqCap EZ Exome (64M)結(jié)合Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)選取 的實(shí)施例1的患者的外顯子組序列進(jìn)行了測(cè)序，具體如下：
[0062] 1)將基因組DNA隨機(jī)打斷成200-300bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上 接頭制備雜交文庫(kù)（參見(jiàn)http://www. illumina.com/提供的Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù) 說(shuō)明書(shū)）。
[0063] 2)文庫(kù)經(jīng)純化后經(jīng)過(guò)連接介導(dǎo)PCR(ligation-mediated PCR(LM-PCR))的線性擴(kuò) 增與Biotinylated DNA Library進(jìn)行雜交富集，再經(jīng)過(guò)LM-PCR的線性擴(kuò)增后進(jìn)行上機(jī)測(cè) 序。測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2000,讀取長(zhǎng)度為90bp，每個(gè)樣本的平均測(cè)序深度最少為 50X〇
[0064] 3)測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)由 Illumina basecalling Software 1. 7 進(jìn) 行處理，經(jīng)過(guò)過(guò)濾去污染、使用SOAPaligner 2.20#比對(duì)參考基因組（可參考Li Rj Li Yj KristiansenKj et al，SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008,24(5):713-714 ；Li RjYu CjLi Yjet al,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009,25 (15):1966-1967， 通過(guò)參考的方式將其全文并入本文），以便獲得比對(duì)到基因組上的唯一比對(duì)序列。然后利 用 SOAP snp (可參見(jiàn)：Li R，Li Y，F(xiàn)ang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing· Genome Res 2009, 19(6) : 1124-1132,通過(guò)參考的 方式將其全文并入本文）確定革E區(qū)域的基因型。Indel (insertion-deletion，插入/缺失 標(biāo)記）米用BWA (通過(guò)Burrows-Wheeler變換比對(duì)）（version 0· 5. 9_r 16)比對(duì)到參考基因 組 Hgl9(snpl32)，然后利用 GATK (Genome Analysis Toolkit) (version vl. 0.4705)確定 indel 的類型。（可參見(jiàn) Li HjDurbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 2010 ;26(5) :589-595 ;McKenna，A，Hanna Mj Banks Ej et al. The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research 2010 ；20(9):1297-1303)〇
[0065] 結(jié)果，在樣本中分別發(fā)現(xiàn)患者有130437個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs)和10738處的 插入 / 缺失（indel);隨后通過(guò) dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/ SNP/snp_summary. cgi)，千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（www. IOOOgenomes. org/)、HapMap 數(shù)據(jù)庫(kù) (http://hapmap. ncbi. nlm. nih. gov/)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)的過(guò)濾，去掉所有已知的且在數(shù)據(jù)庫(kù) 中等位基因頻率大于0. 005的變異。通過(guò)比對(duì)正常樣本，去掉所有已知變異、同義突變以及 非編碼區(qū)的變異，影響蛋白功能較小的位點(diǎn)，包括intron、intergenic、UTR、同義突變，并利 用SIFT軟件進(jìn)行SNP功能預(yù)測(cè).
[0066] 然后根據(jù)遺傳模式是常染色體隱性且假設(shè)為全外顯率的情況，結(jié)合近親結(jié)婚純 合區(qū)域定位方法，發(fā)明人最終確定了該例患者的致病基因?yàn)镃 A S T基因，其突變位點(diǎn)為 c. 607_608insAfs，p. I203Nfs*8(如圖3所示），即在該基因的第607位和第608位之間插 入了一個(gè)堿基A，該位點(diǎn)在家族中符合與疾病共分離（父母為雜合子）。在定位方法中，利 用外顯子數(shù)據(jù)檢測(cè)純合片段區(qū)域，選擇在dbsnpl35中記錄的SNPs或者reference (參考位 點(diǎn)）作為makers (標(biāo)記），參考等位基因或者變異等位基因的reads支持率大于等于95% 的位點(diǎn)被考慮為純和markers,非參考等位基因 reads支持率在30?70%之間的位點(diǎn)考慮 為雜合markers,非參考等位基因 reads支持?jǐn)?shù)在5%?30%或者70%?95%的位點(diǎn)被丟 棄。對(duì)于純合markers,要求位點(diǎn)的覆蓋度大于等于10X，對(duì)于雜合markers要求位點(diǎn)的覆 蓋度大于等于5X。以上。我們采用包含500個(gè)markers作為一個(gè)滑動(dòng)窗口，每個(gè)滑動(dòng)窗口 允許2個(gè)以內(nèi)的雜合makers,允許makers間的最大間距為500Kb。合并所有合格的滑動(dòng) 窗口，如果該區(qū)段大于等于IM的長(zhǎng)度，則認(rèn)為該區(qū)域?yàn)榧兒蠀^(qū)域。通過(guò)real-time PCR方 法，發(fā)明人確定了患者的CAST基因的mRNA表達(dá)較正?；颊呙黠@減少（如圖4所示）。通過(guò) 透視電鏡法，發(fā)明人確定了患者缺乏鈣蛋白酶抑制蛋白（如圖5所示）。因此，發(fā)明人預(yù)測(cè) CAST是PSS的致病基因。
[0067] 實(shí)施例4 :致病突變基因 Sanger法驗(yàn)證
[0068] 由于外顯子組測(cè)序存在一定程度的假陽(yáng)性，因此我們進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)實(shí)施例1中 的PSS患者及其正常父母、另一家族的PSS患者和200位無(wú)關(guān)正常個(gè)體的CAST基因進(jìn)行檢 測(cè)，具體步驟如下：
[0069] I. DNA 提取
[0070] 根據(jù)實(shí)施例2中所述的方法分別采集實(shí)施例1中的患者及其父母、另一家族的PSS 患者和200位無(wú)關(guān)正常個(gè)體的外周血，提取基因組DNA。
[0071] 2.弓丨物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)
[0072] 引物設(shè)計(jì)參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)hgl9/build36. 3,具體見(jiàn)下。
[0073] 對(duì)步驟1所提取的樣本基因組DNA進(jìn)行CAST基因突變位點(diǎn)（c. 607_608insAfs，p. I203Nfs*8)檢測(cè)，針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)方案符合本領(lǐng)域引物設(shè)計(jì)的一般原則即 可，可采用Primer Premier或Oligo等常用引物設(shè)計(jì)軟件。
[0074] PCR反應(yīng)體系：
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 一種突變的CAST基因，其特征在于：所述突變的CAST基因序列與SEQ ID NO: 1相 比具有至少1個(gè)非沉默突變，且所述突變的CAST基因?qū)е缕つw剝脫綜合征的發(fā)生；所述非 沉默突變選自插入、缺失和置換中的一種或多種。
2. 如權(quán)利要求1所述的突變的CAST基因，其特征在于：所述非沉默突變?yōu)镾EQ ID NO: 1 的第607位和608位之間插入一個(gè)堿基A，其序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. -種如權(quán)利要求2所述的突變的CAST基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于：所述蛋白質(zhì) 的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4. 一種載體，其特征在于：所述載體含有如權(quán)利要求1或2所述的突變的CAST基因。
5. -種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為權(quán)利要求4所述的載體 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的突變的CAST基因在作為治療皮膚剝脫綜合征的藥物靶點(diǎn) 或制備皮膚剝脫綜合征疾病診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7. -種用于診斷皮膚剝脫綜合征的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含能夠特異性 擴(kuò)增CAST基因的引物，或能夠特異性檢測(cè)CAST基因突變的探針。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述引物或探針序列為SEQ ID NO: 1或2 所示的序列中第607位或第608位前后15?30bp長(zhǎng)的序列。
9. 一種抗體，其特征在于：所述抗體與權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，且不作用 于正常的CAST基因所編碼的蛋白質(zhì)。
10. -種皮膚剝脫綜合征治療劑，所述治療劑包含權(quán)利要求9所述的抗體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293813SQ201410510241
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】戴蘭蘭, 張建國(guó), 諶于藍(lán), 楊勇, 林志淼, 趙嘉惠, 汪慧君, 徐訊 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司