植物耐低溫基因AtLCBK1的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供植物耐低溫基因AtLCBK1的應(yīng)用，通過在植物中過表達(dá)AtLCBK1基因，可獲得耐低溫的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明提供的AtLCBK1基因?yàn)榕嘤偷蜏刂参镄缕贩N提供了基因資源，為研究植物應(yīng)答逆境信號(hào)的機(jī)制和耐受不利環(huán)境的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。
【專利說明】植物耐低溫基因AtLCBKI的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及植物耐低溫基因AtLCBKl 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 與動(dòng)物或微生物相比，植物由于其生長(zhǎng)的固著性，對(duì)環(huán)境的要求比較高。作為重要 的環(huán)境脅迫之一，溫度不僅能影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)也是限制作物產(chǎn)量的因素，很多農(nóng) 作物的大量減產(chǎn)就是由于低溫寒害造成的，從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失，也加劇了全球 的糧食危機(jī)。因此研究植物響應(yīng)低溫脅迫的生理生化反應(yīng)及其分子生物學(xué)機(jī)制，能夠?yàn)樘?高植物抵抗低溫寒害的能力創(chuàng)造條件，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 最近幾十年來，由于科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，各種植物基因組測(cè)序的陸續(xù)完成，大量 突變體的篩選克隆，相關(guān)遺傳和生化的分析，都使人們對(duì)植物冷適應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制有 了一定程度的了解。
[0004] 擬南芥屬于十字花科植物，由于其形態(tài)個(gè)體小，生長(zhǎng)周期快，基因組小，重復(fù)序列 少，并且全部基因組測(cè)序已經(jīng)完成，且容易被人工誘變產(chǎn)生大量不同基因位點(diǎn)遺傳變異的 突變植株，作為一種典型的模式植物，廣泛應(yīng)用于植物遺傳、發(fā)育和分子生物學(xué)的研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供植物耐低溫基因AtLCBKl的應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的植物耐低溫基因AtLCBKl的應(yīng)用，其是通過 在植物中過表達(dá)AtLCBKl基因，獲得耐低溫的轉(zhuǎn)基因植物。
[0007] 本發(fā)明中涉及的AtLCBKl基因的序列為：
[0008]i)SeqIDNo. 1所示的核苷酸序列；或
[0009]ii)SeqIDNo. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且 表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0010]iii)在嚴(yán)格條件下與SeqIDNo. 1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0011] 所述嚴(yán)格條件為在含0. 1 %SDS的0.IXSSPE或含0. 1 %SDS的0.IXSSC溶液中， 在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0012] AtLCBKl基因由4878個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?'端第626位到第4545 位堿基。AtLCBKl基因來源于哥倫比亞生態(tài)型的擬南芥，在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為 At5g23450。
[0013] 由AtLCBKl基因編碼的氨基酸序列如SeqIDNo. 2所示。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如，將第189位Arg替換為Val。
[0014] 應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。
[0015] 本發(fā)明還提供含有植物耐低溫的AtLCBKl基因序列或其片段的克隆載體或各類 表達(dá)載體，含有所述載體的宿主細(xì)胞，含有所述基因序列或其特異片段的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和 轉(zhuǎn)基因植物。
[0016] 前述應(yīng)用中，所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物，例如擬南芥等。將植物耐低 溫AtLCBKl基因在植物中過表達(dá)，包括利用任一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中過表達(dá)的載 體進(jìn)行。
[0017] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建耐低溫的轉(zhuǎn)基因擬南芥的方法，包括以下步驟：
[0018] 1)提取擬南芥總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物，擴(kuò)增 AtLCBKl基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建到表達(dá)載體pSuperl300上，獲得的重組表達(dá)載體命名為 AtLCBKl-pSuperl300 ；
[0019] 2)用AtLCBKl-pSuperl300轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，然后利用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌侵染擬南 芥花序，獲得耐低溫的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗。
[0020] 其中，步驟1)中所述引物F和R的核苷酸序列如SeqIDNo. 3和4所示。所述擬 南芥優(yōu)選為野生型擬南芥植株，即具有純合基因型的擬南芥植株。
[0021] 將本發(fā)明的AtLCBKl基因過表達(dá)后，擬南芥表現(xiàn)為耐低溫的表型。為了便于對(duì)轉(zhuǎn) 基因擬南芥植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記 或具有抗性的抗生素標(biāo)記物等。
[0022] 本發(fā)明通過對(duì)編碼植物內(nèi)鞘氨醇激酶的基因AtLCBKl(全稱為Sphingoid Long-ChainBasesKinasel)的研究，發(fā)現(xiàn)該基因的突變體具有低溫敏感的相關(guān)表型，而過 表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因植株能夠產(chǎn)生抗低溫的相關(guān)表型，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)該基因抗低溫的重 要功能。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0024] 本發(fā)明提供的AtLCBKl基因?yàn)榕嘤偷蜏刂参镄缕贩N提供了基因資源，為研究植 物應(yīng)答逆境信號(hào)的機(jī)制和耐受不利環(huán)境的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中含有AtLCBKl基因的pSuperl300載體質(zhì)粒酶切位點(diǎn)為 SmaI和KpnI的酶切圖；其中，1為Marker電泳條帶；2為含有AtLCBKl基因的pSuperl300 載體質(zhì)粒的電泳條帶。
[0026] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中過表達(dá)株系OE-I和0E-2的AtLCBKl基因相對(duì)表達(dá)量柱 狀圖。
[0027] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中過表達(dá)株系OE-I和0E-2低溫處理植株恢復(fù)情況照片。
[0028] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中過表達(dá)株系0E-3和0E-4低溫處理植株成活率統(tǒng)計(jì)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0030] 以下實(shí)施例中pBSK載體為常用的克隆載體，可市購(gòu)；pSuper1300載體是由 PCAMBIA1300改造而來，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院鞏志忠教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；擬南芥品種為 哥倫比亞生態(tài)型；農(nóng)桿菌GV3101菌株常用的克隆載體。
[0031] 以下實(shí)施例中的主要試劑為：各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4連接酶、 PyrobestTaq酶、K0D、購(gòu)自NEEkToyobo等生物公司；dNTPs購(gòu)自Genestar公司；質(zhì)粒小提 試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程公司；TRLzolRNA提取試劑盒購(gòu)自 Invitrogen公司；MS培養(yǎng)基、瓊脂粉、瓊脂糖、氨節(jié)青霉素（Amp)、卡那霉素（Kan)、硫酸慶大 霉素（Gen)、利福平（Rif)等抗生素以及DEPC、Galactose、Glucose、BSA、尼龍膜、硝酸纖維 素膜、LB培養(yǎng)基等購(gòu)自Sigma公司，硝酸纖維素膜購(gòu)自Amersham、Bio-Rad等公司；實(shí)施例 中所使用的各種其它化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> [0032] 實(shí)施例中所使用的引物由六合華大公司合成，并進(jìn)行相關(guān)測(cè)序。實(shí)施例IAtLCBKl 基因過表達(dá)載體的構(gòu)建和檢測(cè)
[0033] 為全面了解鞘磷脂蛋白對(duì)植物抗逆能力的影響，從擬南芥屬擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.)HEYNH.)中克隆了編編碼植物內(nèi)鞘氨醇激酶的基因AtLCBKl。根據(jù)編碼區(qū) 序列分析，設(shè)計(jì)引物將該基因的編碼區(qū)擴(kuò)增出來，連接到具有35S啟動(dòng)子的過表達(dá)載體 pSuperl300 上。
[0034] 所用的引物為：
[0035]上游引物F:5'-ATGCAGAAGAGTGGTGTTAATCGGA-3'（SeqIDNo. 3)
[0036]下游引物R:5, -TGAATGTCGTCCAGGAGCGTTACCG-3'（SeqIDNo. 4)
[0037] 將AtLCBKl基因連接到具有Super啟動(dòng)子的載體pSuperl300上的具體方法為：首 先以cDNA為模板，利用上、下游引物將AtLCBK1擴(kuò)增出來，將PCR產(chǎn)物與pBSK載體相連，連 接產(chǎn)物命名為AtLCBKl-pBSK;利用SmaI和KpnI將AtLCBKl從AtLCBKl-pBSK酶切后連入 pSuperl300 載體，連接產(chǎn)物命名為AtLCBKl-pSuperl300。
[0038] 將上一步所得的質(zhì)粒酶切后，進(jìn)行電泳檢測(cè)，具體的方法為：用SmaI和KpnI酶切 AtLCBKl_pSuperl300,用 1%瓊脂糖凝膠，120V，50mA電泳后，UVPGelDocumentation凝膠 分析系統(tǒng)掃描成像。
[0039] 圖1為含有AtLCBKl基因的pSuperl300載體質(zhì)粒酶切位點(diǎn)為SmaI和KpnI的酶 切圖，表明pSuperl300載體中已連入AtLCBKl基因。
[0040] 實(shí)施例2AtLCBKl基因過表達(dá)植物的構(gòu)建和檢測(cè)
[0041] 將實(shí)施例1所述含有AtLCBKl基因的pSuperl300載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株 中，再轉(zhuǎn)入野生型擬南芥植株中，得到擬南芥轉(zhuǎn)基因幼苗。具體方法為：將含有目的載體的 農(nóng)桿菌接種于IOOmLLB三抗液體培養(yǎng)液（Kan50yg/mL，Rif50yg/mL，Gen50yg/mL)中， 28°C振蕩培養(yǎng)過夜，待OD6c?值為I. 0-2. 0,以4000rpm，室溫離心15min，收集菌體；用200mL 轉(zhuǎn)化液（1/2MS，5%蔗糖，40yLSilwetL-77)懸浮菌體；將擬南芥花序浸泡在農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn) 化液中l(wèi)min，套上保鮮袋保濕并置于黑暗處使其溫度較低，第二天將植物從保鮮袋中取出， 放回光照培養(yǎng)架上正常生長(zhǎng)至收種。
[0042]pSuperl300載體所帶篩選抗性基因?yàn)槌泵顾?，用潮霉素抗性?duì)擬南芥轉(zhuǎn)基因幼苗 進(jìn)行篩選，獲得的T1代具有潮霉素素抗性的陽性苗進(jìn)行單株收種，再對(duì)T2代種子進(jìn)行潮霉 素抗性的測(cè)試，選擇3/4具有抗性而其余1/4沒有抗性的株系，說明在該株系中連有目的基 因的過表達(dá)載體以單拷貝形式插入。將這些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再進(jìn)行單 株收種，再進(jìn)行潮霉素抗性篩選，如果沒有分離，說明該轉(zhuǎn)基因株系為純合體，該純合體可 以用于繁種、低溫逆境處理實(shí)驗(yàn)。
[0043] 本實(shí)施例中分離得到過表達(dá)株系OE-I和0E-2。采用Trizol提取正常生長(zhǎng)條件下 野生型和過表達(dá)株系OE-I和0E-2的RNA。
[0044] 1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈（25μ1體系）
[0045]取 2μg上述RNA，加DEPC水至 12μL，加入 2μL(IOpmol)Oligo(dT) 18 混勻，37°C 反應(yīng)5分鐘，然后放在冰上3min，之后加入5Xbuffer5yL，2. 5mmoldNTP5yL，200U/yL反 轉(zhuǎn)錄酶HlμL。
[0046] 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（cDNA第一鏈合成）在PCR儀上進(jìn)行，使用如下程序：42 °C反應(yīng) 60分鐘；反應(yīng)結(jié)束之后取出，加入10mg/mllμLDNase，然后在37°C放置20分鐘，之后 65〇CIOmin0
[0047] 2)定量PCR(Real-time-PCR):儀器ABI PRISM7500Real-time PCR System(Applied BiosystemsjFoster City, CA, USA) ；ABI kit-POWER SYBR GREEN PCR MASTER MIX。
[0048] 檢測(cè)結(jié)果見圖2,由圖2可以看出OE-I和OE-2中AtLCBKl基因均有較大程度上 調(diào)。
[0049] 在其它植物中過表達(dá)AtLCBKl基因的方法可以參考本實(shí)施例進(jìn)行。
[0050] 實(shí)施例3過表達(dá)AtLCBKl基因植物的耐低溫能力檢測(cè)
[0051] 細(xì)胞膜被認(rèn)為對(duì)于植物感受外界的冷響應(yīng)至關(guān)重要，而脂類是細(xì)胞膜的重要組成 部分。擬南芥鞘氨醇激酶參與植物體內(nèi)鞘磷脂的代謝途徑，它的催化產(chǎn)物SIP可作為一種 信號(hào)分子參與植物的抗逆調(diào)控過程。因此，將鞘氨醇激酶過表達(dá)有可能增強(qiáng)植株對(duì)外界冷 信號(hào)及其它逆境的抗性。已有的文獻(xiàn)報(bào)道低溫響應(yīng)過程能夠激活植物冷響應(yīng)基因的表達(dá)， 在胞內(nèi)積累大量的滲透物質(zhì)和保護(hù)蛋白，促進(jìn)植物更好的適應(yīng)零下低溫。本實(shí)施例的冷響 應(yīng)條件設(shè)定為正常光照下4°C生長(zhǎng)4天。
[0052] 首先使野生型擬南芥幼苗和實(shí)施例2中獲得的AtLCBKl基因過表達(dá)株系OE-I和 0E-2在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。幼苗生長(zhǎng)2周后，對(duì)幼苗進(jìn)行低溫處理，處理時(shí)間為-1°C至_6°C 梯度降溫（每小時(shí)降低1°C)，并在-6°C條件下處理1小時(shí)。處理后的幼苗轉(zhuǎn)移至4°C黑暗 條件放置過夜，之后將其在正常光照條件下培養(yǎng)3-4天，低溫中受傷的組織會(huì)在培養(yǎng)過程 中黃化枯死,而能夠抵抗低溫傷害的組織逐漸變綠并恢復(fù)生長(zhǎng),拍照并統(tǒng)計(jì)成活率。
[0053] AtLCBKl基因過表達(dá)株系OE-I和0E-2及對(duì)照野生型株系，在冷馴化和非冷馴化 后低溫處理后的照片見圖3,冷馴化的恢復(fù)情況比非冷馴化要好，AtLCBKl基因過表達(dá)株系 OE-I和0E-2的恢復(fù)情況比對(duì)照均要好。
[0054] 對(duì)處理后的幼苗進(jìn)行存活率統(tǒng)計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)為生長(zhǎng)點(diǎn)能夠變綠并長(zhǎng)出新葉，統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見圖4,不經(jīng)冷馴化（不經(jīng)冷響應(yīng)），野生型幼苗植株在-6°C處理1小時(shí)后存活率僅為36 %， 而過表達(dá)植株OE-I和0E-2的存活率分別能夠達(dá)到55 %和52% ;而在冷馴化（經(jīng)冷響應(yīng)， 即讓植株預(yù)先在正常光照下4°C生長(zhǎng)4天，再進(jìn)行低溫處理）后，-8°C處理，野生型的存活 率為43%，而過表達(dá)植株OE-I和0E-2的存活率分別能夠達(dá)到59%和55%，抗低溫能力較 野生型也有顯著增強(qiáng)。
[0055] 這說明AtLCBKl基因過表達(dá)植株無論是否進(jìn)行冷馴化，都較野生型的抗低溫能力 有明顯增強(qiáng)。
[0056] 由此可見，擬南芥鞘氨醇激酶相關(guān)基因AtLCBKl過表達(dá)后能夠顯著提高植物對(duì)低 溫的耐受能力。
[0057] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 植物耐低溫基因 AtLCBKl的應(yīng)用，其特征在于，通過在植物中過表達(dá)AtLCBKl基因， 獲得耐低溫的轉(zhuǎn)基因植物； 其中，AtLCBKl基因的序列為： i) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；或 ii) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá) 相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 iii) 在嚴(yán)格條件下與Seq ID No. 1所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0. 1 X SSPE或含0. 1 % SDS的0. 1 X SSC溶液中，在 65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括但不限于擬南芥。
4. 一種構(gòu)建耐低溫的轉(zhuǎn)基因擬南芥的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取擬南芥總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物，擴(kuò)增 AtLCBKl基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建到表達(dá)載體pSuperl300上，獲得的重組表達(dá)載體命名為 AtLCBKl-pSuperl300 ； 2) 用AtLCBKl-pSuperl300轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，然后利用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌侵染擬南芥花 序，獲得耐低溫的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗； 其中，步驟1)中所述引物F和R的核苷酸序列如Seq ID No. 3和4所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/54GK104357465SQ201410510483
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】楊淑華, 張瑤, 張曉燕 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)