一種那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，利用新型ARTP育種系統(tǒng)誘變那西肽活躍鏈霉菌，通過響應(yīng)面法優(yōu)化24深孔板發(fā)酵條件，并且利用24深孔板培養(yǎng)法建立高通量篩選突變體的方法，獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)那西肽突變株。本發(fā)明驗證24深孔板效價及搖瓶效價之間的相關(guān)性，使其篩選方法非常準(zhǔn)確快速，同時與傳統(tǒng)搖瓶發(fā)酵篩選相比，24深孔板法能顯著提高那西肽高產(chǎn)菌株的篩選效率。
【專利說明】一種那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物誘變育種、發(fā)酵工程領(lǐng)域，尤其涉及一種那西肽活躍鏈霉菌高 產(chǎn)菌株的高通量篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 那西肽（Nosih印tide)是種含硫多肽類抗生素，又稱諾西肽，主要有活躍鏈霉菌 產(chǎn)生。它具有促進(jìn)動物的生長、提高飼料利用率、增強(qiáng)動物的抗病能力，且在動物體內(nèi)無殘 留，對人畜安全，對環(huán)境污染小等優(yōu)點，是一種理想的飼用抗生素?fù)Q代品。
[0003] 目前，在歐盟、日本、臺灣等地區(qū)，那西肽作為唯一飼用抗生素在飼料添加。國內(nèi)的 科研工作者在那西肽活躍鏈霉菌種的選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面做了大量的研究，使那西 肽的生產(chǎn)技術(shù)得到很大提高。但目前工業(yè)發(fā)酵單位總體水平較低，生產(chǎn)菌種的性能仍有很 大的提升空間。
[0004] 利用新型ARTP育種方法誘變那西肽活躍鏈霉菌可以快速有效地獲得那西肽活躍 鏈霉菌突變庫。近年培養(yǎng)基優(yōu)化方法已由傳統(tǒng)的非統(tǒng)計優(yōu)化法逐漸轉(zhuǎn)向統(tǒng)計優(yōu)化法，即通 過實驗設(shè)計與結(jié)果分析，建立相關(guān)的數(shù)學(xué)模型，再求解模型的最優(yōu)值并進(jìn)行校驗。其中響應(yīng) 面優(yōu)化法在生物醫(yī)藥領(lǐng)域取得了一系列良好的效果。高通量篩選是獲得高產(chǎn)突變株的關(guān)鍵 步驟。
[0005] 目前關(guān)于高產(chǎn)那西肽活躍鏈霉菌株的篩選方法通常是隨機(jī)篩選法或抗性平板篩 選法，然后采用搖瓶逐個進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并測定菌株的目標(biāo)產(chǎn)量，該方法篩選工作量大、周期 長、效率低及成本高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對目前篩選那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的方法耗時、費力、低效率、成本較高， 本發(fā)明通過提供一種那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，可以有效地解決上述 存在的問題；同時優(yōu)化24深孔板的發(fā)酵條件，驗證24深孔板效價及搖瓶效價之間的相關(guān) 性。
[0007] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，包括 以下步驟：
[0008] (1)采用常壓室溫等離子體處理那西肽活躍鏈霉菌150s ;
[0009] (2)將誘變后待篩選的那西肽活躍鏈霉菌稀釋涂布于固體平板，在37±0. 5°C下 培養(yǎng)72h ;
[0010] (3)用牙簽挑取誘變后的單菌落孢子接入每孔裝有4?6mL固體培養(yǎng)基的24深孔 板中進(jìn)行固體培養(yǎng)，同時--對應(yīng)地用接種鏟挖0. 2?0. 3cm2的菌體接入裝有2. 55mL種 子培養(yǎng)基的24深孔板進(jìn)行液體培養(yǎng)；種子培養(yǎng)結(jié)束分別轉(zhuǎn)接裝有0. 93mL發(fā)酵培養(yǎng)基的24 深孔板，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束測效價，對應(yīng)的固體培養(yǎng)孔板菌落作保存，液體培養(yǎng)28 ±0. 5 °C，轉(zhuǎn)速 260r/min，種子培養(yǎng) 40h，發(fā)酵 120h，固體培養(yǎng) 37±0. 5°C，72h ;
[0011] (4)接種24深孔板固體培養(yǎng)的菌落于斜面試管培養(yǎng)好后用于搖瓶發(fā)酵，測效價。
[0012] 優(yōu)選地，在步驟（3)中，種子培養(yǎng)基（％)為：豆餅粉2.0,葡萄糖3.0,玉米漿2.0， MgSO4 · 7H20 0· 05,（NH4)2S04 0· 3,輕質(zhì)碳酸鈣 0· 5,115°C滅菌 25min。
[0013] 優(yōu)選地，在步驟（3)中，所述固體培養(yǎng)基（％)為：可溶性淀粉2,豆餅粉0· 5, KNO3 0· 1，NaCl 0· 05, MgSO4 · 7H20 0· 05, K2HPO4 · 3H20 0· 05, FeSO4 · 7H20 0· 001，瓊脂 2. 0-3. 0， 121°C滅菌20min ;步驟（3)中所述的種子培養(yǎng)基（％ ):豆餅粉2.0,葡萄糖3.0,玉米漿 2. 0, MgSO4 · 7H20 0· 05,（NH4)2SO4 0· 3,輕質(zhì)碳酸鈣 0· 5,115°C滅菌 25min。
[0014] 優(yōu)選地，在步驟⑶中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基（％)為：淀粉7.0,淀粉酶（淀粉的 〇· 1%)，葡萄糖 0.5,酵母粉 0.2,黃豆粉（含油）4.0,（NH4)2SO4 0· I，KN03 0.05，NaCl 0.4， 輕質(zhì)碳酸鈣〇. 4,115°C滅菌25min。
[0015] 本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選 方法，利用新型ARTP育種系統(tǒng)誘變那西肽活躍鏈霉菌，通過響應(yīng)面法優(yōu)化24深孔板發(fā)酵條 件，并且利用24深孔板培養(yǎng)法建立高通量篩選突變體的方法，獲得高產(chǎn)穩(wěn)定的那西肽突變 株。
[0016] 相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：利用新型ARTP育種方 法誘變那西肽活躍鏈霉菌，利用多孔板培養(yǎng)法建立高通量篩選突變體的方法，該方法驗證 24深孔板效價及搖瓶效價之間的相關(guān)性，使其篩選方法非常準(zhǔn)確快速，同時與傳統(tǒng)搖瓶發(fā) 酵篩選相比，24深孔板法能顯著提高那西肽高產(chǎn)菌株的篩選效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是本發(fā)明實施例1中種子培養(yǎng)基裝液量對24深孔板培養(yǎng)效價的影響；
[0018] 圖2本發(fā)明實施例2中發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量對24深孔板培養(yǎng)效價的影響；
[0019] 圖3本發(fā)明實施例3中發(fā)酵時間對24深孔板培養(yǎng)效價的影響；
[0020] 圖4是本發(fā)明實施例5中突變株24深孔板效價與搖瓶效價之間的相關(guān)性；
[0021] 圖5是本發(fā)明實施例6中突變株的相對效價；
[0022] 圖6本發(fā)明實施例7中孔板發(fā)酵后分光光度計與酶標(biāo)儀測孔板效價的相關(guān)性；
[0023] 圖7本發(fā)明實施例8中搖瓶發(fā)酵后分光光度計與酶標(biāo)儀測搖瓶效價的相關(guān)性。

【具體實施方式】
[0024] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0025] 菌株：那西肽產(chǎn)生菌活躍鏈霉菌（Streptomyces actuosu)NXT-NAlO菌株由安徽 工程大學(xué)實驗室保藏，該菌株已在文章"響應(yīng)面法優(yōu)化那西肽發(fā)酵條件"（中國抗生素雜 志，2013, 38(6) :430-433)中公開。
[0026] 儀器及試劑：ZHWY-C2112B恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造公司； HTS-T008恒溫振蕩器：上海甘薇生物技術(shù)有限公司；超凈臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司， Sorvall ST 16R離心機(jī)：賽默飛世爾，酶標(biāo)儀：賽默飛世爾；ARTP育種機(jī)：北京思清源生物 科技有限公司?；瘜W(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。
[0027] 那西肽的含量測定：723分光光度計比色法、96孔板酶標(biāo)儀比色法。
[0028] 實施例1 24深孔板種子培養(yǎng)基裝液量對那西肽效價的影響
[0029] 種子培養(yǎng)基分別選取初始裝液量為0· 7mL、l. 0mL、L 3mL、l. 6mL、l. 9mL、2. 2mL、 2. 5mL、2. 8mL、3. lmL，比較其對24深孔板中那西肽產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖I所示。由圖I可 看出，當(dāng)初始裝液量在2. 5mL時那西肽的產(chǎn)量最高。
[0030] 實施例2 24深孔板發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量對那西肽效價的影響
[0031] 按質(zhì)量百分比（％ )將淀粉7. 0,淀粉酶（淀粉的0· 1 % )，葡萄糖0· 5,酵母粉0· 2， 黃豆粉（含油）4.0,（NH4)2SO4 0·1，ΚΝ03 0.05，NaCl 0.4,輕質(zhì)碳酸鈣 0.4,115°C滅菌 25min 得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0032] 分別在 0· 7mL、I. OmL、I. 3mL、I. 6mL、I. 9mL、2. 2mL、2. 5mL、2. 8mL、3. lmL、3. 4mL 的 發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量下進(jìn)行發(fā)酵試驗，比較其對那西肽產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)24 深孔板中發(fā)酵培養(yǎng)基在I. OmL的條件下24深孔板發(fā)酵的產(chǎn)量最高。
[0033] 實施例3發(fā)酵時間對24深孔板培養(yǎng)效價的影響
[0034] 選擇不同的發(fā)酵時間測定那西肽的產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，在發(fā) 酵前期，隨著發(fā)酵時間的延長那西肽的產(chǎn)量在增大，但發(fā)酵120h后其產(chǎn)量有所下降，因此， 發(fā)酵時間選擇120h為宜。
[0035] 實施例4響應(yīng)面模型的建立及方差分析
[0036] 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計Box-Behnken中心組合實驗，以24深孔板發(fā)酵的 那西肽效價為響應(yīng)值，對種子培養(yǎng)基裝液量（A)、發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量（B)和發(fā)酵時間（C)設(shè) 計響應(yīng)面分析試驗。結(jié)果如表1所示：
[0037] 表I Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 采用常壓室溫等離子體處理那西肽活躍鏈霉菌150s ; (2) 將誘變后待篩選的那西肽活躍鏈霉菌稀釋涂布于固體平板，在37±0.5°C下培養(yǎng) 72h ； (3) 用牙簽挑取誘變后的單菌落孢子接入每孔裝有4?6mL固體培養(yǎng)基的24深孔板 中進(jìn)行固體培養(yǎng)，同時--對應(yīng)地用接種鏟挖0. 2?0. 3cm2的菌體接入裝有2. 55mL種子 培養(yǎng)基的24深孔板進(jìn)行液體培養(yǎng)；種子培養(yǎng)結(jié)束分別轉(zhuǎn)接裝有0. 93mL發(fā)酵培養(yǎng)基的24 深孔板，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束測效價，對應(yīng)的固體培養(yǎng)孔板菌落作保存，液體培養(yǎng)28 ±0. 5 °C，轉(zhuǎn)速 260r/min，種子培養(yǎng) 40h，發(fā)酵 120h，固體培養(yǎng) 37±0. 5°C，72h ; (4) 接種24深孔板固體培養(yǎng)的菌落于斜面試管培養(yǎng)好后用于搖瓶發(fā)酵，測效價。
2. 如權(quán)利要求1所述的那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于， 在步驟（3)中，種子培養(yǎng)基（％)為：豆餅粉2. 0,葡萄糖3. 0,玉米漿2. 0，MgS04*7H20 0. 05， (NH4)2SO4 0? 3,輕質(zhì)碳酸鈣 0? 5,115°C滅菌 25min。
3. 如權(quán)利要求2所述的那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于， 在步驟（3)中，所述固體培養(yǎng)基（％ )為：可溶性淀粉2,豆餅粉0.5，KN03 0? l，NaCl 0.05， MgS04.7H20 0.05 ,K2HPO4 .3H20 0.05 ,FeSO4 .7H20 0.001，瓊脂 2. 0-3.0,121 °C 滅菌 20min; 步驟（3)中所述的種子培養(yǎng)基（％):豆餅粉2.0,葡萄糖3.0,玉米漿2.0, MgSO4 ? 7H20 0.05,（NH4)2SO4 0.3,輕質(zhì)碳酸鈣 0.5,115°C滅菌 25min。
4. 如權(quán)利要求3所述的那西肽活躍鏈霉菌高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于， 在步驟（3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基（％ )為：淀粉7. 0,淀粉酶（淀粉的0. 1 % )，葡萄糖0. 5,酵 母粉 0.2,黃豆粉（含油）4.0,（NH4)2SO4 0. 1，KNO3 0.05, NaCl 0.4,輕質(zhì)碳酸鈣 0.4,115°C 滅菌25min。
【文檔編號】C12R1/46GK104313109SQ201410513049
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】薛正蓮, 周揚, 秦艷飛, 趙世光, 王洲 申請人:安徽工程大學(xué)