一種非病毒基因載體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種非病毒基因載體的制備方法，該方法是利用原生細(xì)胞模型protocell的技術(shù)與方法，用中性脂質(zhì)囊泡包裹PCR組分液(pDNA模板、聚合酶、引物、dNTPs)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到內(nèi)部包裹大量DNA片段的protocell液。本發(fā)明的在脂質(zhì)囊泡中擴(kuò)增DNA片段，使載體中包載的基因拷貝數(shù)大大增加，基因轉(zhuǎn)染效率也顯著提高；制備脂質(zhì)載體采用中性磷脂，無(wú)正電荷成分，使其毒性明顯降低。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，制備工藝簡(jiǎn)單，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一種非病毒基因載體的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于非病毒基因載體的制備【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種以脂質(zhì)為材料的原生細(xì)胞(protocell)模型作為基因載體的制備方法。經(jīng)配體修飾后，這種基因載體可用作靶向基因傳遞系統(tǒng)。
技術(shù)背景
[0002]隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是人類基因庫(kù)的建立和人類疾病相關(guān)基因的闡明，疾病的基因治療應(yīng)運(yùn)而生，并已發(fā)展為當(dāng)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，被認(rèn)為是治療遺傳性先天疾病、惡性腫瘤、傳染病等最有希望的治療方案之一。
[0003]轉(zhuǎn)染載體可分為兩類:病毒載體與非病毒載體。非病毒基因載體能夠克服病毒基因載體的許多棘手問(wèn)題，如無(wú)免疫原性、無(wú)遺傳毒性、細(xì)胞毒性低、成本低等等，是治療基因體內(nèi)給藥不可替代的傳遞系統(tǒng)，具有重要的臨床實(shí)用潛力。目前，非病毒基因載體的研究主要集中在陽(yáng)離子聚合物或陽(yáng)性脂質(zhì)體上，這些正電荷載體能夠有效吸附負(fù)電性的基因物質(zhì)。但是，正電荷載體進(jìn)入體內(nèi)后，很容易被血液中的吞噬細(xì)胞識(shí)別、吸附并迅速清除。同時(shí)，正電荷會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞膜去穩(wěn)定化，造成嚴(yán)重毒性，這都限制了非病毒基因載體的發(fā)展。
[0004]磷脂分子能夠在水中自發(fā)組裝成閉合的圓形囊泡，雙層膜厚度為4_5nm。磷脂囊泡已經(jīng)被廣泛用于制備protocell模型系統(tǒng)，其與細(xì)胞膜非常相似，在不同的pH值與溫度下都相對(duì)穩(wěn)定，并且將磷脂制備成細(xì)胞大小囊泡的技術(shù)很成熟。
[0005]Protocell就是用脂質(zhì)制備一個(gè)閉合囊泡，在其內(nèi)部包裹生物反應(yīng)物質(zhì)，在適合的條件下大量增殖，得到內(nèi)部濃集核酸或蛋白等生物活性物質(zhì)的protocell囊泡。并且原生細(xì)胞模型(protocell)使用中性磷脂制備，其理化性質(zhì)與細(xì)胞接近，具有良好的生物相容性，將其作為納米工廠，在內(nèi)部大量擴(kuò)增所需的基因物質(zhì)，并用于靶向基因傳遞，能同時(shí)解決轉(zhuǎn)染效率和毒性問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)非病毒載體的高效基因傳遞。此外，如果用配體對(duì)protocell進(jìn)行修飾，使其具有靶向性，用于基因的靶向傳遞，在生物醫(yī)學(xué)中將有更廣泛運(yùn)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種非病毒基因載體的制備方法，具體是指以原生細(xì)胞模型P1tocell作為基因載體的制備方法。先用脂質(zhì)制備囊泡，將pDNA模板、聚合酶、引物、dNTPs等PCR(Polymerase Chain React1n,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))各組分包裹在囊泡中，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在囊泡內(nèi)擴(kuò)增目的DNA片段，使其濃集于脂質(zhì)囊泡中，得到原生細(xì)胞模型protocell ο
[0007]一種以原生細(xì)胞模型protocell為基因傳遞載體的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0008](I)用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)囊泡，將PCR組分液包裹在囊泡內(nèi)。
[0009](2)對(duì)脂質(zhì)囊泡包裹的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增:用0.02U/ μ L的DNase I消化除去外水相的PDNA模板，對(duì)所得包裹PCR組分液的脂質(zhì)囊泡進(jìn)行20個(gè)PCR循環(huán)，得到protocell模型；在protocell液中加入0.02U/ μ L的DNase I酶，室溫消化脂質(zhì)囊泡外的DNA片段5分鐘。
[0010]步驟(I)中所述的薄膜分散法制備脂質(zhì)囊泡可以采用以下步驟實(shí)現(xiàn):將磷脂混合后溶于氯仿，氮?dú)獯蹈?，加入PCR組分液，包括PDNA模板、聚合酶、引物和dNTPs ;充分渦旋震蕩制備脂質(zhì)囊泡，凍融3次，聚碳酸酯膜過(guò)濾。
[0011]步驟(I)中所述的逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)囊泡可以采用以下步驟實(shí)現(xiàn):以含有磷脂的氯仿為油相，PCR組分液為水相，按油相與水相的體積比為3:1，將水相加入油相中；充分渦旋震蕩成乳狀液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)緩慢除去氯仿，制備脂質(zhì)囊泡液，凍融3次，聚碳酸酯膜過(guò)濾。
[0012]上述制備方法制備的非病毒基因載體，通過(guò)進(jìn)一步配體修飾，使其具有特異靶向性，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率。
[0013]目前的非病毒基因載體多采用陽(yáng)離子材料，體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率低，毒性明顯，而中性電荷材料包載DNA效率低，不能用于基因傳遞。本發(fā)明借用protocell的思路和方法，在脂質(zhì)囊泡中“生產(chǎn)”DNA片段，使載體中包載的基因拷貝數(shù)大大增加，基因轉(zhuǎn)染效率也顯著提高。所采用的脂質(zhì)載體為中性磷脂，無(wú)正電荷成分，體內(nèi)傳遞效率高而毒性降低。本發(fā)明的制備方法設(shè)計(jì)合理，制備工藝簡(jiǎn)單，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是透射電鏡觀察protocell形態(tài)的結(jié)果圖。
[0015]圖2是在protocell中PCR擴(kuò)增DNA片段后，DNase I酶消化前、后的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比圖。
[0016]圖3是在中性或陽(yáng)性protocell中PCR擴(kuò)增DNA片段后的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比圖。
[0017]圖4(A)為protocell載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的的熒光蛋白表達(dá)效率圖。
[0018]圖4(B)為陽(yáng)離子DOTAP脂質(zhì)體與質(zhì)粒結(jié)合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)效率圖。
[0019]圖4(C)為protocell中進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)效率圖。
[0020]圖5是protocell與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1:
[0022]圖1為將protocell附著于TEM載樣銅網(wǎng)上，經(jīng)過(guò)2%乙酸鈾染色3分鐘后在TEM下觀察，結(jié)果可見protecell為200nm左右的類圓形納米粒。
[0023]實(shí)施例2:
[0024]圖2中，A為制備protocell后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用TE飽和酚:氯仿(1:1)混合物抽提、去除脂質(zhì)，水層中的DNA產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果可見，protocell中的DNA條帶亮度非常高，說(shuō)明PCR擴(kuò)增后，目標(biāo)DNA片段濃集于其中，具有較高濃度。圖2中，B為protocell經(jīng)PCR擴(kuò)增后，再加入0.02U/ μ L的DNase I酶，室溫消化5分鐘，用TE飽和酚:氯仿(1:1)混合物抽提、去除脂質(zhì)，結(jié)果可見，經(jīng)過(guò)酶消化后，protocell中的DNA片段濃度依然較高，說(shuō)明DNase I酶未能消化其中的DNA片段，protocell能夠保護(hù)內(nèi)部的基因物質(zhì)，使其免受外界消化酶的影響。
[0025]圖3中，A為用中性DOPC制備的中性protocell，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)TE飽和酚:氯仿(1:1)混合物抽提、去除脂質(zhì)后，進(jìn)行凝膠電泳鑒定表明，其中的DNA條帶濃度較高，說(shuō)明DOPC制備的protocell能夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用作基因傳遞載體。圖3中，B為DOTAP制備的陽(yáng)性protocell,經(jīng)PCR、提取電泳鑒定表明，其中沒(méi)有DNA條帶，說(shuō)明陽(yáng)性protocell中沒(méi)有產(chǎn)生DNA片段，不適合用于PCR擴(kuò)增，不能用作基因載體。
[0026]實(shí)施例3:protocell載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測(cè)定
[0027]將HEK293細(xì)胞(I X 15/孔)接種于24孔培養(yǎng)板，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，匯合度為60?80%。將制備好，并經(jīng)PCR擴(kuò)增的protocell溶液過(guò)濾除菌，稀釋成系列濃度(以總脂質(zhì)分別為10 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、500 μ Μ)，加入細(xì)胞中，再加入含10%血清的培養(yǎng)基，使每孔的總體積為500 μ L0以未包裹的PCR擴(kuò)增液為陰性對(duì)照，以DOTAP脂質(zhì)體為陽(yáng)性對(duì)照。將DOTAP脂質(zhì)體與pEGFP-Nl質(zhì)粒按照不同質(zhì)量比混合、孵育30min，得到復(fù)合物。將配好的復(fù)合物加入細(xì)胞中，每孔DNA的加入量為2 μ g。再加入10%血清的培養(yǎng)基，使每孔的總體積為500 μ L0 37°C CO2培養(yǎng)箱放置12小時(shí)，吸去轉(zhuǎn)染液，每孔加入新鮮配置的500 μ L含10%小牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。吸去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20分鐘，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。
[0028]圖4.A為對(duì)DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，直接轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，結(jié)果表明，其綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)不明顯，說(shuō)明DNA的PCR擴(kuò)增液不能直接用于基因傳遞；圖4.B為陽(yáng)離子DOTAP脂質(zhì)體與質(zhì)粒結(jié)合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果顯示具有一定的EGFP表達(dá)；圖4.C為在protocell中進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果表明EGFP表達(dá)效率最高，說(shuō)明protocell能夠保護(hù)DNA片段，增加DNA被細(xì)胞的攝取，提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。
[0029]實(shí)施例4:protocell與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性對(duì)比圖
[0030]將HEK293細(xì)胞(5 X 13/孔)接種于96孔培養(yǎng)板，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，匯合度為60?80%。PBS洗滌后加入不同濃度的protocell液，或陽(yáng)離子DOTAP脂質(zhì)體，再加入無(wú)血清培養(yǎng)基至200 μ L/孔，空白對(duì)照組加200 μ L無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，然后移去培養(yǎng)基，加入180 μ L無(wú)血清培養(yǎng)基和20 μ L MTT (5mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入10yL DMSO每孔，振搖lOmin，酶標(biāo)儀上，于570nm測(cè)定A值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生存率。
[0031]細(xì)胞生存率(％ ) = (A樣品/A空白)X 100%
[0032]圖5的結(jié)果表明隨著脂質(zhì)濃度的增加，protocell的細(xì)胞成活率均高于DOTAP脂質(zhì)體，說(shuō)明protocell的細(xì)胞毒性明顯小于DOTAP脂質(zhì)體。
[0033]上述實(shí)施例用來(lái)解釋說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明做出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種非病毒基因載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)囊泡，將PCR組分液包裹在囊泡內(nèi)； (2)對(duì)脂質(zhì)囊泡包裹的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增:用0.02U/ μ L的DNase I消化除去外水相的PDNA模板，對(duì)所得包裹PCR組分液的脂質(zhì)囊泡進(jìn)行20個(gè)PCR循環(huán)，得到protocell模型；在protocell液中加入0.02U/ μ L的DNase I酶，室溫消化5分鐘，去除囊泡未包封的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的薄膜分散法制備脂質(zhì)囊泡采用以下步驟實(shí)現(xiàn):將磷脂混合后溶于氯仿，氮?dú)獯蹈?，加入PCR組分液，包括pDNA模板、聚合酶、引物和dNTPs ;充分渦旋震蕩制備脂質(zhì)囊泡，凍融3次，聚碳酸酯膜過(guò)濾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述的逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)囊泡采用以下步驟實(shí)現(xiàn):以含有磷脂的氯仿為油相，PCR組分液為水相，按油相與水相的體積比為3:1，將水相加入油相中；充分渦旋震蕩成乳狀液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)緩慢除去氯仿，制備脂質(zhì)囊泡液，凍融3次，聚碳酸酯膜過(guò)濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法制備的非病毒基因載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的載體通過(guò)進(jìn)一步配體修飾，具有特異靶向性，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法制備的非病毒基因載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的載體通過(guò)進(jìn)一步配體修飾，具有特異靶向性，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104263756SQ201410513142
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】馬昆, 張嘉寧 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)