檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，它包括豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因擴增試劑以及檢測用基因芯片。本發(fā)明檢測試劑盒可以準確、有效的檢測繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬流行性乙型腦炎病毒，且特異性強、靈敏度高、耗時短，檢測快速，應用前景良好。
【專利說明】檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜 合征病毒的試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病 毒的試劑盒。

【背景技術】
[0002] 多病原混合感染是當前豬場疫病的普遍現(xiàn)象，豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬流行 性乙型腦炎這三種豬病毒引起的疾病癥狀相似且常常呈混合感染，是當前危害養(yǎng)豬業(yè)的3 種重要病毒性疾病，因此早期鑒別診斷并及時了解流行狀況對控制這3種病的流行顯得尤 其重要。目前對這3種病的診斷多采用病原的分離及常規(guī)的血清學方法，但需時間較長。最 近國外和國內(nèi)均建立了病原的分離鑒定、免疫膠體金技術、酶聯(lián)免疫吸附試驗、血清中和實 驗、聚合酶鏈反應等，但是還不能更加快速的檢測多種病原的混合感染。
[0003] 基因芯片技術是近年來新興起的一種生物高新技術，該技術可以同時定量或定性 的檢測成千上萬個基因信息，具有無選擇性、客觀、高通量的特點。基因芯片計劃開展后， 許多部門、大學、重點實驗室及制藥公司參與了該項目的研發(fā)，我國相繼也成立了一大批 基因芯片公司。隨著基因組數(shù)據(jù)的增長以及分子生物學相關學科的快速發(fā)展，基因芯片技 術得到迅猛發(fā)展和廣泛應用。但生物芯片技術發(fā)展時間較短，很多技術還處于初級研發(fā)階 段，要成為實驗室研究或臨床可以普遍采用的技術仍有諸多關鍵問題亟待解決。（1)基因芯 片的特異性的提高；(2)增加信號檢測的靈敏度；（3)簡化樣品制備和標記操作；(4)設備 與操作人員的要求較高；（5)應用標準的統(tǒng)一。
[0004] 目前，昊時友等，"豬病毒性繁殖障礙綜合征基因芯片診斷方法的建立"，中國畜牧 獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次學術研討會，2007年公開了檢測日本乙型腦炎病毒、 豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等6種病毒的基因芯片，但是該文件中沒有芯片靈敏 度試驗，不能說明其可以靈敏地檢出乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性強、靈敏度高的可同時檢測豬流行 性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑 盒，它包括豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因擴增試劑 以及檢測用基因芯片；
[0007] 擴增豬流行性乙型腦炎病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :7?8和/或SEQ ID NO : 9?10所示引物對；擴增豬瘟病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :11?12和/或SEQ ID NO: 13?14所示引物對；擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :15?16 和/或SEQ ID NO :17?18所示引物對；引物對中，上游引物與下游引物的比例是1:1 ;
[0008] 所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；其中，探針包括SEQ ID NO :1或2所示任意一個或者兩個寡核苷酸片段，SEQ ID NO :3或4所示任意一個或者 兩個寡核苷酸片段，以及SEQ ID NO :5或6所示任意一個或者兩個寡核苷酸片段。
[0009] 優(yōu)選地，所述擴增試劑還包括熒光染料標記的dNTP。進一步優(yōu)選地，所述熒光染料 為Cy3熒光染料或者Cy5熒光染料。
[0010] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括SEQ ID NO :20?21所示引物對；所述基因芯片還包括 定位探針，定位探針是SEQ ID NO :19所示的基因片段。
[0011] 優(yōu)選地，所述固相載體為氨基化基片。
[0012] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO :7?8和/或SEQ ID NO :9?10所示引物對、SEQ ID NO :11?12和/或SEQ ID NO :13?14所示引物對以及SEQ ID NO :15?16和/或SEQ ID NO :17?18所示引物對，與SEQ ID NO :1或2所示任意一個或者兩個基因片段、SEQ ID NO :3或4所示任意一個或者兩個基因片段以及SEQ ID NO :5或6所示任意一個或者兩個 基因片段在制備檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑 盒中的用途；
[0013] 所述引物對為擴增試劑，上游引物與下游引物的摩爾比是1:1 ;SEQ ID NO :1?6 所示基因片段為檢測探針。
[0014] 優(yōu)選地，所述擴增試劑還包括熒光染料標記的dNTP。進一步優(yōu)選地，所述熒光染料 為Cy3熒光染料或者Cy5熒光染料。
[0015] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括SEQ ID NO :20?21所示引物對以及SEQ ID NO : 19所 示的定位探針。
[0016] 優(yōu)選地，所述探針固定在氨基化基片上。
[0017] 本發(fā)明試劑盒可以有效檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜 合征病毒，敏感性高，三種病毒的最低檢測濃度均為20pg/μ 1，特異性強，耗時短，檢測快 速，具有良好的應用前景。
[0018] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明權利要 求書記載的內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1基因芯片四個重復檢測區(qū)的分布及矩陣排列情況；
[0020] 圖2兩種點樣針點樣效果；
[0021] 圖3不同點樣緩沖液點樣效果；
[0022] 圖4不同濕度下點樣效果；
[0023] 圖5不同靶基因濃度和探針濃度對雜交信號強度的影響；
[0024] 圖6不同烘焙時間處理結果；
[0025] 圖7不同水合時間處理結果；
[0026] 圖8不同紫外交聯(lián)時間處理結果；
[0027] 圖 9 基因芯片檢測 PRRSV、CSFV、JEV、PPV、PRV、PEDV、TGEV 的掃描結果。

【具體實施方式】
[0028] 一、實驗材料和儀器
[0029] 毒株：
[0030] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)毒株、豬瘟病毒（CSFV)毒株和豬流行性乙型腦 炎病毒（JEV)毒株，購自中國獸藥監(jiān)察所。
[0031] 試劑：
[0032] 總RNA抽提試劑盒，為天根（北京）生化科技有限公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time),為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；小量質粒提取試 劑盒、小量膠回收試劑盒，均為OMEGA(美國）生物技術公司產(chǎn)品。
[0033] Baio?氨基載玻片、Baio? 2 X點樣緩沖液、Baio?預雜交緩沖液、Baio? 雜交緩沖液，均購自上海百傲科技有限公司；Cy3-dCTP:25nmol，PA53021，Lot300989， Amersham Biosciences，UK ;洗液 I :0· 1% SDS 2 XSSC ;洗液 II :0· I % SDS 0· 2 XSSC ;洗 液III :0. 2 XSSC ;洗液4 :雙蒸水。
[0034] 儀器：
[0035] 超凈工作臺：SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司；
[0036] 超純水儀：Milli Qplus，法國產(chǎn)；
[0037] 梯度 PCR 儀：PX 2, Thermo hybaid，美國產(chǎn)；
[0038] 高速冷凍離心機3K18型：SigmaR，德國產(chǎn)；
[0039] Mini-SUB凝膠電泳裝置：Bio-RadR，意大利產(chǎn)；
[0040] 電泳儀：POWER Pac300, Bio-RADR,意大利產(chǎn)；
[0041] 凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)2000型：Bio-RADR，意大利產(chǎn)；
[0042] 恒溫搖床：Thermo Forma,美國產(chǎn)；
[0043] 核酸蛋白檢測儀：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3〇10 ;
[0044] 分子雜交儀：Thermo,美國產(chǎn)；
[0045] 多樣品圍欄、多樣品圍欄粘貼工具、多樣品圍欄蓋片，芯片雜交盒均為北京博奧生 物公司；
[0046] 晶芯? SmartArrayer?48,微陣列芯片點樣系統(tǒng)：Capitalbio Corporation，北京 博奧生物公司；
[0047] 晶芯? LuxScantmIOK微陣列芯片掃描儀：Capitalbio Corporation,北京博奧生 物公司；
[0048] 真空機：SinBo，香港；
[0049] CO2恒溫培養(yǎng)箱：Thermo，美國產(chǎn)。
[0050] 實施例1本發(fā)明試劑盒的制備
[0051] 1、材料和儀器
[0052] 同前述實驗材料和儀器。
[0053] 2、實驗方法
[0054] 2. IPCR引物、檢測探針的制備
[0055] (1)設計病原特異性探針：通過對GenBnak中收錄的豬流行性乙型腦炎病毒、豬癌 病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸序列對位排列分析，選定保守區(qū)域序列JEV C、Μ、E、 NS1、NS5 ;CSFV 5' UTR、3' UTR、Npro、Erns、E2 ;PRRSV 5' UTR、0RFlb、0RF5、0RF6、0RF7。針 對保守序列設計檢測探針，從中挑選出特異性強的探針序列。
[0056] (2)設計探針序列的特異性引物：針對上述保守探針序列，利用生物信息學軟件 Primer5設計特異性引物。特異性引物由大連寶生物公司合成。
[0057] (3)探針制備：用小量病毒/液體樣本RNA/DNA抽提試劑盒提取豬流行性乙型腦 炎病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒，利用上述特異性引物對三種病原核酸進行 PCR擴增，純化濃度測定。
[0058] PCR擴增體系中優(yōu)化的參數(shù)及其濃度
[0059]

【權利要求】
1. 一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒， 其特征在于：它包括豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因 擴增試劑以及檢測用基因芯片； 擴增豬流行性乙型腦炎病毒基因的試劑包括SEQ ID N0:7?8和/或SEQ ID N0:9? 10所示引物對；擴增豬瘟病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :11?12和/或SEQ ID NO :13? 14所示引物對；擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :15?16和/或 SEQ ID NO :17?18所示引物對；引物對中，上游引物與下游引物的比例是1:1 ; 所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；其中，探針包括SEQ ID NO :1或2所示任意一個或者兩個寡核苷酸片段，SEQ ID NO :3或4所示任意一個或者兩個 寡核苷酸片段，以及SEQ ID NO :5或6所示任意一個或者兩個寡核苷酸片段。
2. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述擴增試劑還包括熒光染料標記的 dNTP〇
3. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述熒光染料為Cy3熒光染料或者Cy5 熒光染料。
4. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括SEQ ID NO :20?21 所示引物對；所述探針還包括SEQ ID NO :19所示定位探針。
5. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述固相載體為氨基化基片。 6. SEQ ID NO :7 ?8 和 / 或 SEQ ID NO :9 ?10 所示引物對、SEQ ID NO :11 ?12 和 / 或SEQ ID NO :13?14所示引物對以及SEQ ID NO :15?16和/或SEQ ID NO :17?18所 示引物對，與SEQ ID NO :1或2所示任意一個或者兩個基因片段、SEQ ID NO :3或4所示任 意一個或者兩個基因片段以及SEQ ID NO :5或6所示任意一個或者兩個基因片段在制備檢 測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒中的用途； 所述引物對為擴增試劑，上游引物與下游引物的摩爾比是1:1 ;SEQ ID NO :1?6所示 基因片段為檢測探針。
7. 根據(jù)權利要求6所述的用途，其特征在于：所述擴增試劑還包括熒光染料標記的 dNTP〇
8. 根據(jù)權利要求7所述的用途，其特征在于：所述熒光染料為Cy3熒光染料或者Cy5熒 光染料。
9. 根據(jù)權利要求6所述的用途，其特征在于：所述試劑盒還包括SEQ ID NO :20?21 所示引物對以及SEQ ID NO :19所示的定位探針。
10. 根據(jù)權利要求6或9所述的用途，其特征在于：所述探針固定在氨基化基片上。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293980SQ201410515902
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權日:2014年9月29日
【發(fā)明者】文心田, 黃小波, 曹三杰, 姜來生, 文翼平, 伍銳, 黃寧, 胡中凱, 肖馳, 張煥容 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學