香樟延伸因子CcEF1a基因片段序列及克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了香樟延伸因子CcEF1a基因片段序列及克隆方法，基于對NCBI已經(jīng)登錄的其他物種EF1a基因cDNA全長進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)其基因序列的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，以香樟葉片中總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，用常規(guī)PCR進(jìn)行體外擴增，獲得香樟CcEF1a基因片段的cDNA序列。設(shè)計相應(yīng)的qRT-PCR引物，測序檢測其擴增產(chǎn)物的特異性，建立了基于SYBR GreenI染料技術(shù)的qRT-PCR方法，從而為香樟CcEF1a基因作為內(nèi)參基因，為利用qRT-PCR技術(shù)研究香樟其它功能基因或逆境相關(guān)基因提供有效的方法。
【專利說明】香樟延伸因子CcEFIa基因片段序列及克隆方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及香樟延伸因子CcEFla基因片段序列及克隆 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 香樟（Cinnamomum camphora)，樟科（Lauraceae)，常綠喬木，是貴重家具、高級建 筑、造船和雕刻等理想的用材。近年來，香樟在園林綠化中的應(yīng)用越來越多，成為城市中重 要的園林綠化樹種，但是耐寒性差這一不良性狀限制了香樟的地理分布及其在園林綠化中 的應(yīng)用。研究香樟抗寒相關(guān)基因從而通過基因工程技術(shù)獲得抗寒性增強的香樟新品種是一 個有效途徑，基因工程育種與傳統(tǒng)育種相比具有較強的目的性、育種周期短并且克服遠(yuǎn)緣 雜交不親和的優(yōu)點，因而具有重大的實際價值。
[0003] 近年來，CBF/DREBl(CRT/DREbinding factor)轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是對植物冷馴化 機制具有重要調(diào)節(jié)作用的一類基因；該基因能夠能感受上游傳遞的低溫信號，在低溫誘導(dǎo) 下迅速合成，并在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多個抗逆基因，從而提高植物的耐寒性，因而成為近年來 研究的重點。因而對該家族基因的克隆和分子重組為實現(xiàn)育種目標(biāo)提供了新思路。CBF/ DREBl途徑廣泛存在于各個物種中，近年來科學(xué)家們相繼從平榛、巨桉等木本植物中分離 CBF/DREB1家族基因，本實驗室也已經(jīng)從香樟中克隆到兩個CBF/DREB1家族基因（數(shù)據(jù)未公 布），要深入研究這些基因的抗寒相關(guān)性及表達(dá)模式，一般通過實時定量PCR手段進(jìn)行基因 的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。
[0004] 抗寒相關(guān)基因的表達(dá)模式的研究需要一個在低溫脅迫處理條件下表達(dá)量相對恒 定的持家基因作為內(nèi)參，從而實現(xiàn)該基因的定量和標(biāo)準(zhǔn)化。傳統(tǒng)持家基因像甘油醛-3-磷 酸脫氫酶（GAPDH)、肌動蛋白（ACT)和延伸因子（EFla)因為其組成型表達(dá)而被廣泛認(rèn)為是 比較可靠的內(nèi)參基因。EFla(elongat ion factor I alpha)是真核生物延伸因子的一個亞 基，延伸因子是一類在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮作用的蛋白，幫助肽鏈的延伸。EFla基因被認(rèn)為在 黃瓜、矮牽牛和大白菜中最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，很多研究者在研究抗寒相關(guān)基因DREB基因 的表達(dá)模式中應(yīng)用了 EFla基因作為內(nèi)參基因。然而，目前位止，國內(nèi)外還沒有見到香樟延 伸因子EFla相關(guān)文獻(xiàn)的報道，GenBank中也沒有與香樟延伸因子EFla相關(guān)的基因序列登 錄，其作為內(nèi)參基因應(yīng)用于其他基因表達(dá)變化的研究也尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供香樟延伸因子CcEFla基因片段序列及克隆方法，本發(fā)明 的有益效果是為香樟CcEFla基因作為內(nèi)參基因，在利用qRT-PCR技術(shù)研究香樟其它功能基 因或逆境相關(guān)基因的表達(dá)分析提供有效的方法。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供香樟延伸因子CcEFla基因片段，所述基因的 GenBank登錄號為KM086740,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 香樟延伸因子CcEFla基因片段所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明提供的一種香樟CcEFla基因的克隆方法：提取香樟葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 第一鏈cDNA作為模板，采用簡并引物EFIaF和EFIaR進(jìn)行RT-PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)A-T 克隆，并將陽性克隆測序，獲得目的基因的cDNA序列。其中引物序列為：
[0009] EFlaF:5'-ATGGGYAARGARAAGWYYCAYATCAAC-3'（SEQ ID NO. 3);
[0010] EFlaR:5,-GAAATCCACATCTGYTGGAA-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0011] 所獲得目的片段大小為1297bp。
[0012] 進(jìn)一步，所述PCR擴增的反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，56°C退 火30s，72°C延伸lmin20s，共30個循環(huán)；72°C總延伸lOmin。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供香樟CcEFla的qRT-PCR引物，建立了基于SYBR Green I 染料技術(shù)的qRT-PCR方法，從而為香樟CcEFla基因作為內(nèi)參基因，在利用qRT-PCR技術(shù)研 究香樟其它功能基因或逆境相關(guān)基因提供有效的方法。
[0014] qRT-PCR擴增香樟延伸因子CcEFla基因部分序列的方法為：提取香樟葉片總 RNA，利用試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，以CcEFla-RTF和 CcEFla-RTR為引物，采用SYBR Green I法進(jìn)行定量PCR擴增，其定量PCR引物CcEFla-RTF 和CcEFla-RTR序列為：
[0015] CcEFla-RTF :5' -TCCAAGGCACGGTATGAT-3'（SEQ ID NO. 5);
[0016] CcEFla-RTR :5, -CCTGAAGAGGGAGACGAA-3,（SEQ ID NO. 6)。
[0017] 所獲得目的片段大小為232bp。
[0018] 進(jìn)一步，所述定量PCR擴增反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性15s，60°C 退火30s，72°C延伸lmin，共40個循環(huán)；溶解曲線在65?95°C之間，每0. 05s升高0. 5°C。
[0019] 本發(fā)明香樟延伸因子CcEFla基因片段作為內(nèi)參基因應(yīng)用于香樟其它功能基因或 逆境相關(guān)基因的定量PCR檢測。
[0020] 本發(fā)明是基于對NCBI已經(jīng)登錄的其他物種EFla基因cDNA全長進(jìn)行分析的基礎(chǔ) 上，根據(jù)其基因序列的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，以香樟葉片中總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一 鏈為模板，用常規(guī)PCR進(jìn)行體外擴增，獲得香樟CcEFla基因片段的cDNA序列。設(shè)計相應(yīng) 的qRT-PCR引物，測序檢測其擴增產(chǎn)物的特異性，建立了基于SYBR Green I染料技術(shù)的 qRT-PCR方法，從而為香樟CcEFla基因作為內(nèi)參基因，在利用RT-qPCR技術(shù)研究香樟其它功 能基因或逆境相關(guān)基因的表達(dá)分析提供有效的方法。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：
[0022] 1.本發(fā)明首次從香樟中克隆到了延伸因子CcEFla基因片段。
[0023] 2.本發(fā)明首次設(shè)計了 CcEFla基因的qRT-PCR引物，并檢測了特異性，可以直接應(yīng) 用于基因的表達(dá)分析，優(yōu)化了 qRT-PCR擴增程序，大大提高了檢測效率、縮短了檢測時間， 提高了檢測結(jié)果的可信度。
[0024] 3.本發(fā)明首次對香樟CcEFla基因進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果表明，其在低溫脅迫下的 葉片中表達(dá)量相對穩(wěn)定，可以在相應(yīng)基因表達(dá)分析中作為內(nèi)參基因。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1香樟延伸因子CcEFla基因的PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0026] 圖2香樟延伸因子CcEFla基因的熔解曲線；
[0027] 圖3香樟延伸因子CcEFla基因低溫處理下各個樣品cDNA進(jìn)行qRT-PCR的平均Ct 值（Ct值與表達(dá)量負(fù)相關(guān)）。

【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0029] 本發(fā)明以園林植物香樟為研究材料，提供1個香樟延伸因子CcEFla基因片段，可 作為香樟功能基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，同時提供香樟CcEFla的qRT-PCR引物，建立了基 于SYBR GreenI染料技術(shù)的qRT-PCR方法，從而為香樟CcEFla基因作為內(nèi)參基因，在利用 qRT-PCR技術(shù)研究香樟其它功能基因或逆境相關(guān)基因的表達(dá)分析提供有效的方法。
[0030] 實施例1:香樟延伸因子CcEFla基因的克隆
[0031] I. 1香樟葉片總RNA的提取
[0032] 香樟總RNA的提取根據(jù)EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊公 司）說明書進(jìn)行操作，涉及RNA的實驗所用槍頭和離心管等耗材均為無RNA酶污染（Axygen 公司）。所提RNA加入30 μ L RNase Free水（試劑盒中自帶），充分溶解后于-80°C保存。
[0033] I. 2RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄 PCR)
[0034] cDNA第一條鏈的合成根據(jù)TaKaRa公司的PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作說明，反轉(zhuǎn)錄2 μ g總RNA，合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于香樟延伸 因子基因EFla基因的克隆。用于qRT-PCR定量分析的各個cDNA樣品稀釋10倍作為反應(yīng) 模板。
[0035] 1 · 3PCR擴增引物序列
[0036] EFla 的上游引物：5' -ATGGGYAARGARAAGWYYCAYATCAAC-3'（EFlaF :SEQ ID NO. 3);
[0037] EFla的下游引物：5'-GAAATCCACATCTGYTGGAA-3'（EFlaR :SEQ ID NO. 4)。
[0038] 1.4常規(guī)PCR擴增
[0039] PCR 反應(yīng)
[0040] a.反應(yīng)體系為20 μ L:
[0041] ddH20 14.4 μ L IOx Buffer 2.0 μ L dNTP Mix (2.5 ηιΜ) 0.4μL
[0042] EFlaF 1.0μL EFlaR 1.0μL cDNA IOuL EasyTaq(北京全式金公司) 0.2μL Total 20 μ L
[0043] b.反應(yīng)條件：
[0044] 94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin20s，共 30 個循環(huán)； 72°C總延伸 lOmin。
[0045]I. 5用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物（圖I)，DL2000為TaKaRa公司生產(chǎn)。圖 1中：M代表DL2000DNA Marker，1-3泳道為CcEFla基因的PCR產(chǎn)物。
[0046] I. 6PCR產(chǎn)物的膠回收
[0047] 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，紫外燈下切下目的條帶，用Axygen(吳江康寧生命科學(xué) 有限公司）瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。
[0048] I. 7PCR產(chǎn)物的克隆，A-T克隆
[0049] (1)連接反應(yīng)
[0050] 回收的目的產(chǎn)物與TaKaRa公司生產(chǎn)的pMD19-T Vectorl6°C連接過夜，反應(yīng)體系 如下：
[0051] Solutionl 5 P L PCR回收產(chǎn)物 4.5UL pMDi9-T 0.5 U L Total 10 μ L
[0052] (2)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
[0053] 將上述連接產(chǎn)物加于50 μ L Trans5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金公司） 中，輕輕混勻，冰浴30min，42°C熱激90s，冰浴5min，緩慢加入400 μ L新鮮液體LB，37°C， 180rpm 50min，吸取100μ L菌液涂于添加有Amp 100mg/L的LB平板上，置于37°C恒溫培養(yǎng) 箱中，倒置過夜培養(yǎng)12_16h。
[0054] (3)陽性重組子的篩選及鑒定
[0055] 隨機挑取上述轉(zhuǎn)化平板中的陽性菌以PMD19-T載體通用引物M13上、下游引物進(jìn) 行菌落PCR，將PCR擴增產(chǎn)物置于1. 0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測正確的陽性菌接種于Iml 添加有Amp 100mg/L的液體LB中搖菌培養(yǎng)，送往上海生工測序，得到香樟延伸因子EFla 的cDNA序列（具體序列間SEQ ID NO. 1)，推導(dǎo)獲得相應(yīng)氨基酸序列（具體序列間SEQ ID NO. 2) 〇
[0056] 1. 8.測序結(jié)果及序列分析
[0057] 測序結(jié)果經(jīng)分析并去除兩端引物序列，獲得了 1個大小為1297bp的cDNA序列片 段，編碼432個氨基酸。將獲得片段的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行BLAST 分析，結(jié)果顯示該基因片段的核苷酸序列與BLAST結(jié)果的其它物種EFla的核苷酸序列的相 似性均在80%以上，其中與梅花EFla相似性最高，相似度為87%;氨基酸序列的相似性均 在96%以上，其中與大戟科木薯、蓖麻、小油桐以及棕櫚科的油棕的EFla氨基酸序列的相 似度均達(dá)到98 %。推測本實驗所獲得的基因片段是香樟EFla基因片段，命名為CcEFla，提 交 Genbank，登錄號為 KM086740。
[0058] 將得到的香樟EFla基因片段的氨基酸序列NCBI中已經(jīng)登錄的其它物種EFla氨 基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，EFla基因的氨基酸序列相當(dāng)保守，本實驗結(jié)果也進(jìn)一 步證明延伸因子EFla是高度保守的蛋白質(zhì)。
[0059] 此外，利用MEGA5. 03軟件對香樟EFla推導(dǎo)的氨基酸序列與橡膠樹、毛果楊、油棕、 煙草等14個物種的EFla蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，香樟與大戟科木薯、橡膠以及棕 櫚科油棕聚為一支，表明它們在氨基酸水平上親緣關(guān)系較近，也充分說明EFla基因在不同 物種行使相近的功能，通過生物信息學(xué)分析本實驗所獲得基因片段應(yīng)為香樟延伸因子基因 (CcEFla)。
[0060] 實施例2:香樟CcEFla基因在低溫脅迫下葉片中的穩(wěn)定性分析
[0061] 2.1樣品制備
[0062] 所有實驗材料香樟葉片均選用1年生香樟無性系EL6生根組培苗，確保其遺傳 背景一致。該材料在含有30g/L蔗糖和8. Og/L瓊脂的MS基本培養(yǎng)基中生根，培養(yǎng)溫度 (25±1) °C，光照強度25001x，光照時間16h/d。組培苗生根處理2mon左右，其不定根狀況 生長良好，并有5-7片葉片形成，選取約200株健壯的香樟組培苗進(jìn)行4°C低溫處理，分別于 0、0. 5、1、2、4、6、12、24、48和72h隨機取其葉片用于RNA的提取，材料收獲后立即用液氮速 凍，-80°C保存直至RNA提取，RNA的提取方法見實施例1中I. 1所述。
[0063] 2. 2qRT_PCR擴增引物合成
[0064] qRT-PCR 擴增上游引物：5' -TCCAAGGCACGGTATGAT-3'（CcEFla-RTF :SEQ ID NO. 5)；
[0065] qRT-PCR擴增下游引物：5'-CCTGAAGAGGGAGACGAA-3'（CcEFla-RTR :SEQ ID NO. 6)。
[0066] 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0067] 2. 3qRT-PCR
[0068] cDNA 第一條鏈的合成根據(jù) TaKaRa 公司的 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作說明，利用Oligo dT Primer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，起始RNA模板 為2μ g，將獲得的反轉(zhuǎn)cDNA產(chǎn)物稀釋10倍作為qRT-PCR的反應(yīng)模板。反應(yīng)采用SYBR Green I 法，利用羅氏公司的 FastStart Universal SYBR Green Master (Roche)試劑盒， 在伯樂CFX96實時定量檢測系統(tǒng)（BIO RAD)上進(jìn)行?；虮磉_(dá)分析軟件為Bio-Rad CFX manager2.0,每一樣品重復(fù)三次。實驗得到溶解曲線（melting curve),如圖2所示，橫坐標(biāo) 代表在溶解曲線擴增階段，從65°C到95°C之間的溫度范圍；縱坐標(biāo)代表熒光信號（RFU)改 變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)，即擴增反應(yīng)完成后，SYBR Green I熒光染料結(jié)合到CcEFla目的片段的 雙鏈DNA，通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測每一步的熒光信號，隨著反應(yīng)中DNA的熔解，熒光信 號降低，峰值指對應(yīng)溫度下熒光信號急劇降低的拐點處的導(dǎo)數(shù)值。
[0069] 依據(jù)各樣品對應(yīng)的平均Ct值，利用EXcel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得CcEFla基因在 不同樣品中的表達(dá)差異。圖3中：橫坐標(biāo)代表4°C低溫處理的時間；縱坐標(biāo)代表Ct值是指 反應(yīng)體系累計足夠的擴增產(chǎn)物，至可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時的循環(huán)數(shù)，主要由擴增反 應(yīng)體系中的模板的初始濃度決定，柱狀圖和誤差線代表每個取樣時間點3個重復(fù)樣品的平 均Ct值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。表1為CcEFla基因在低溫處理0_72h的各個樣品cDNA進(jìn)行qRT-PCR 的(^值。
[0070] a. qRT-PCR 反應(yīng)體系為 10 μ L :
[0071] ddH20 3.4 μ L 2x Power Taq PCR Master Mix 5.0 μ L CcEFla-RTF 0.3 μ L CcEFla-RTR 0.3 μ L cDNA 1.0 PL Total IOpL
[0072] b.反應(yīng)條件：
[0073] 94°C預(yù)變性5min ;94°C變性15s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共40個循環(huán)；溶解 曲線在65?95°C之間，每0. 05s升高0. 5°C。
[0074] 2. 4香樟CcEFla基因低溫脅迫下葉片中的表達(dá)分析實驗結(jié)果
[0075] 本發(fā)明按照qRT-PCR反應(yīng)程序?qū)? μg香樟葉片總RNA進(jìn)行定量PCR擴增，并結(jié)合 熔解曲線及測序判斷擴增產(chǎn)物的特異性。一般理想的熔解曲線應(yīng)該是單峰型曲線，如果出 現(xiàn)兩個或兩個以上的峰，說明有引物二聚體或者非特異擴增產(chǎn)生，從引物的熔解曲線來看， 其呈單峰型曲線，熔解峰在80°C，高于引物二聚體的峰值（75°C左右），無雜峰，說明本發(fā)明 涉及的qRT-PCR引物（SEQIDN05和6)，擴增條帶單一，沒有非特異擴增出現(xiàn)，進(jìn)一步將擴 增產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明該對引物的擴增產(chǎn)物特異性強。
[0076] 表I CcEFla基因在低溫處理0_72h的各個樣品cDNA進(jìn)行qRT-PCR的Ct值
[0077]

【權(quán)利要求】
1. 香樟延伸因子CcEFla基因片段，基因的GenBank登錄號為KM086740,其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. 香樟延伸因子CcEFla基因片段所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -種香樟延伸因子CcEFla基因部分序列的克隆方法，其特征在于：提取香樟葉片總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA作為模板，采用簡并引物EFlaF和EFlaR進(jìn)行RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)A-T克隆，并將陽性克 隆測序，獲得目的基因的cDNA序列；其中引物序列為： EFlaF ：5, -ATGGGYAARGARAAGWYYCAYATCAAC-3, (SEQ ID NO. 3)； EFlaR:5' -GAAATCCACATCTGYTGGAA-3'（SEQ ID N0.4)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述PCR擴增的反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin20s，共 30 個循環(huán)；72°C 總延伸l〇min。
5. -種qRT-PCR擴增香樟延伸因子CcEFla基因部分序列的方法，其特征在于：提 取香樟葉片總RNA，利用試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，以 CcEFla-RTF和CcEFla-RTR為引物，采用SYBRGreenI法進(jìn)行定量PCR擴增，其定量PCR引物 CcEFla-RTF 和 CcEFla-RTR 序列為： CcEFla-RTF:5' -TCCAAGGCACGGTATGAT-3' （SEQ ID N0.5); CcEFla-RTR :5' -CCTGAAGAGGGAGACGAA-3'（SEQ ID NO. 6)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所用RT-qPCR反應(yīng)條件如下： 94°C預(yù)變性5min ;94°C變性15s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共40個循環(huán)；溶解曲線 在65?95°C之間，每0. 05s升高0. 5°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香樟延伸因子CcEFla基因片段，其特征在于：香樟延伸因子 CcEFla基因片段作為內(nèi)參基因應(yīng)用于香樟其它功能基因或逆境相關(guān)基因的定量PCR檢測。
【文檔編號】C12N15/29GK104357454SQ201410529725
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】杜麗, 李勇鵬, 姚瑤, 張力維 申請人:南陽師范學(xué)院