高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，將高黑芥子酶活性益生菌菌株以2-5%接種量接種到50-100mLMRS液體培養(yǎng)基中37℃擴(kuò)大培養(yǎng)24-48h，以使細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期，無菌的30-40%甘油與菌懸液各1mL加入滅菌的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20℃冰箱保存0.5-1h后，立即放入冷凍罐中，使溫度均勻下降，然后放入液氮罐中保存。本發(fā)明重點(diǎn)考慮到溫度的驟然變化對菌體細(xì)胞的損傷影響，使菌體在面對低溫保存環(huán)境下，能最大限度保護(hù)菌體細(xì)胞崩解而造成的酶活性降低。本方法操作簡單，酶活性保持在高水平，而且花費(fèi)少。
【專利說明】高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種益生菌保藏方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 益生菌通常被定義為一類對宿主健康有益的活性微生物。一般認(rèn)為其主要包括 三大類：第一大類乳酸桿菌類，常見的有嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、酪乳桿菌、詹氏乳桿 菌、拉曼乳桿菌；第二大類雙歧桿菌類，有長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌，此外 卵形雙歧桿菌和短雙歧桿菌也都是比較常見的；第三大類革蘭氏陽性球菌類，主要包括糞 鏈球菌、乳酸乳球菌等。另外，不少學(xué)者把酵母菌也歸為是益生菌的一種。
[0003] 顧名思義益生菌就是對人體有很強(qiáng)的益生功效的一類細(xì)菌。其具體表現(xiàn)在以下幾 個(gè)方面：益生菌可以有效地調(diào)節(jié)人體腸道，并對腹瀉起到一定的預(yù)防作用。如果能及時(shí)補(bǔ)充 益生菌就可使人體腸道中的該益生菌成為優(yōu)勢菌種，從而對致病菌的生長形成抑制作用， 這樣便有助于保持人體腸道的正常功能；益生菌有助于緩解過敏癥狀。過敏是由于人體的 免疫系統(tǒng)過于敏感誤把正常物質(zhì)當(dāng)成有害物質(zhì)造成的，常見的有花粉過敏、過敏性皮炎和 哮喘等。一般認(rèn)為益生菌抗過敏機(jī)制為抑制Th2細(xì)胞活性，提高Thl細(xì)胞活性使兩者達(dá)到 動態(tài)平衡來達(dá)到緩解過敏癥狀的目的。對于嬰幼兒來說，這是一個(gè)福音。嬰幼兒發(fā)生過敏 反應(yīng)時(shí)，考慮到其年齡較小及正處于最重要的發(fā)育期，傳統(tǒng)的藥物治療過敏由于不可避免 的副作用必須認(rèn)真考慮，而益生菌由于是人體腸道的有機(jī)組成部分故而是抗過敏的有效手 段。不僅如此，益生菌還可以以酸奶、乳飲料等多種載體的形式進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)，可接受性 強(qiáng)；益生菌有助于有效緩解乳糖不耐癥，益生菌可分泌P-半乳糖苷酶，可將乳糖分解為 乳酸，從而有效改善乳糖不耐癥。除此之外，益生菌還能降低人體膽固醇、預(yù)防肥胖、預(yù)防腫 瘤、增強(qiáng)人體免疫功能，對于高血壓也有一定的緩解功效。
[0004] 實(shí)驗(yàn)室常用的益生菌保藏方法有：斜面劃線法、液體石蠟覆蓋法、甘油低溫冷凍法 和冷凍干燥保藏法。四種保藏方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，斜面劃線法最為簡單，將需要保存的益生菌 劃線接種到MRS固體斜面上，待菌株充分生長后，放入4°C冰箱中即可。該方法雖較簡單，實(shí) 驗(yàn)室也經(jīng)常用得到，但該方法的缺點(diǎn)就是保藏期較短，一般只有1-2個(gè)月，且保藏的益生菌 容易被污染；液體石蠟覆蓋法的保存期較長，可以達(dá)到1-2年。此方法的操作相對而言也算 比較簡單，但要注意隨時(shí)堅(jiān)直放置，以使液體石蠟隨時(shí)保持對菌體的覆蓋；甘油低溫冷凍法 的保藏時(shí)間較長且不易產(chǎn)生變異，菌株損失率低，是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常選用的方法；冷凍干燥保藏 法，較為復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高，但是具有保存時(shí)間較的優(yōu)點(diǎn)長，最長可達(dá)數(shù)十年，因此 被譽(yù)為最有效的保藏方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種甘油低溫冷凍保藏高黑芥子酶活性益生菌菌株的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種甘油低溫冷凍保藏高黑芥子酶活性益生菌菌株的方法，其具體實(shí)施步驟如下： 將高黑芥子酶活性益生菌菌株以2-5%接種量接種到50-100mL MRS液體培養(yǎng)基中37°C 擴(kuò)大培養(yǎng)24-48h，以使細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期，無菌的30-40%甘油與菌懸液（60-70%)各ImL 加入滅菌的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20°C冰箱保存0. 5-lh后，立即放 入冷凍罐(裝有90vol. %異丙醇+10vol. %酒精）中，使溫度均勻下降（24h內(nèi)），然后放入液 氣罐中保存。
[0007] 本發(fā)明中，所述高黑芥子酶活性益生菌的篩選方法如下： 一、將待測益生菌于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，于37°C恒 溫培養(yǎng)24h，如此反復(fù)活化2-3次即可使菌株恢復(fù)活力。
[0008] 本步驟中，所述益生菌為桿菌類益生菌(乳桿菌和雙歧桿菌)。
[0009] 本步驟中，所述改良MRS液體培養(yǎng)基的配制方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸取物 l〇g、酵母提取物5. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、 七水硫酸錳0.05g，溶于水，然后加 Iml吐溫80,用水調(diào)至1000ml。
[0010] 二、初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液5mL 培養(yǎng)待篩菌株，培養(yǎng)時(shí)間48h，培養(yǎng)溫度30°C，觀察菌株生長情況，能夠正常生長的菌株用 于下一步實(shí)驗(yàn)。
[0011] 本步驟中，所述含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液 的配制方法如下：無菌IOOmmoVL黑芥子硫苷酸鉀與改良MRS液體培養(yǎng)基以1:20的體積 比混合。
[0012] 三、復(fù)篩：配置葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為lOmmol/L的改良MRS培養(yǎng)液， 將待篩選菌株按常規(guī)接種量接種到該改良MRS培養(yǎng)液30°C過夜培養(yǎng)12-18h，然后離心取 菌體，加入IOmL MES緩沖液沖洗菌體，再次離心后將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，將菌 懸液與lOmmol/L黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液按照1-1. 5:1的體積比混合，在30°C培養(yǎng) 24-48h，最后離心取上清液在340nm處測定吸光度，篩選出吸光度值差異在0. 2以上的菌 株。
[0013] 本步驟中，所述lOmmol/L葡萄糖、lOmmol/L黑芥子硫苷酸鉀改良MRS的配制 方法如下：①lOmmol/L葡萄糖改良MRS的配制：蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取 物5. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、七水硫酸錳 0. 05g，1.8g葡萄糖溶于水，然后加Iml吐溫80,用水調(diào)至1000ml。②10mmol/L葡萄糖改 良MRS與無菌lOOmmol/L黑芥子硫苷酸鉀以20:1的體積比混合。
[0014] 本發(fā)明采用自制的冷凍配方及冷凍罐，重點(diǎn)考慮到溫度的驟然變化對菌體細(xì)胞的 損傷影響，使菌體在面對低溫保存環(huán)境下，能最大限度保護(hù)菌體細(xì)胞崩解而造成的酶活性 降低。本方法操作簡單，酶活性保持在高水平，而且花費(fèi)少。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù) 方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明 的保護(hù)范圍中。
[0016] 一、高黑芥子酶活性益生菌菌株的篩選 1、益生菌的初篩 本實(shí)驗(yàn)所用待測菌株為乳桿菌包括：嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏 乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、棒狀乳桿菌、副干酪乳桿菌、雙歧桿菌。
[0017] 將待篩選的乳酸桿菌接種于含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L，不含葡萄糖的改 良MRS液體培養(yǎng)基5mL中培養(yǎng)待篩菌株，培養(yǎng)時(shí)間為48h，溫度為30°C。培養(yǎng)結(jié)束后觀察到 乳酸桿菌的生長情況，能夠正常生長的菌株用于下一步實(shí)驗(yàn)。
[0018] 2、益生菌的復(fù)篩 將初篩得到的菌接種到葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為10 mmol/L的改良MRS培養(yǎng) 液中301：過夜培養(yǎng)（12-1811)后離心（41：，10111111，700(^)，加入1011111^3緩沖液（30臟〇1/1 MES, Bmmol /T, MgCl2, 2mmol/L Vc，NaOH調(diào)節(jié) pH=6. 5,121°C高壓蒸汽滅菌 15min)反復(fù)沖洗菌 體后再次離心（4°C，10min，7000g)，將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，菌懸液與含10 mmol/ L黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液各ImL混合，30°C分別培養(yǎng)24 h和48 h。最后離心（4°C， lOmin，IOOOOg)取上清液在340 nm處測定吸光度（用含5mmol/L黑芥子硫苷酸鉀的MES 緩沖液調(diào)零），與Oh的吸光度值作差，若二者差值越大，則表明黑芥子硫苷酸鉀被益生菌分 解，說明待篩益生菌菌株黑芥子酶的活性越大。
[0019] 綜合考慮初篩和復(fù)篩的情況，認(rèn)為益生菌副干酪乳桿菌具有較高較穩(wěn)定的黑芥子 酶活性，是希望得到的益生菌。
[0020] 二、菌株保藏 1、甘油低溫冷凍保藏法 (1) 30%甘油配制（L):取300ml甘油和700ml無菌水混勻，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0021] (2)實(shí)驗(yàn)方法：益生菌菌株副干酪乳桿菌以2%接種量接種到50mL MRS液體培養(yǎng) 基中37°C擴(kuò)大培養(yǎng)24h，以使細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期，無菌的30%甘油與菌懸液各ImL加入滅 菌的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20°C冰箱作中期保存。
[0022] 2、冷凍干燥保藏法 (1)5%蔗糖溶液配制（L):稱取50g蔗糖加無菌水至IL充分溶解，121°C高壓蒸汽滅 菌 30min。
[0023] (2)實(shí)驗(yàn)方法：益生菌菌株副干酪乳桿菌以2%接種量接種到IL MRS液體培養(yǎng)基中 37°C擴(kuò)大培養(yǎng)24h，使菌株進(jìn)入穩(wěn)定期后離心取菌泥，加入等體積無菌保護(hù)劑5%蔗糖溶液 震蕩混勻后，轉(zhuǎn)移到無菌平皿中用塑料封口膜密封后放入_20°C冰箱預(yù)凍12h，預(yù)凍完成后 在封口膜上扎若干個(gè)小孔便于透氣，然后轉(zhuǎn)移到真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥12h。冷凍干燥 完成后將菌體制成菌粉，將菌粉轉(zhuǎn)移到菌粉保藏用密封袋中密封，整個(gè)過程均為無菌操作。 最后將密封袋放入-20°C冰箱作長期保存。
[0024] 3、活化 將保存一個(gè)月的菌種進(jìn)行活化，取出保藏的菌株在無菌條件下使用接種環(huán)挑取少量菌 粉或適量菌懸液接種到改良的MRS液體培養(yǎng)基中，每種保存方法取三個(gè)平行，37°C恒溫培 養(yǎng)24h，這一代菌株稱作活化的第一代。取該菌株于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS 液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫培養(yǎng)24h，該菌株被稱為第二代，再按此方法活化一代的菌株稱 為第三代。觀察兩種保存方法每一代菌株的生長情況，并記錄。甘油低溫冷凍保藏法和冷 凍干燥保藏法菌株活化生長情況如下表1所示。
[0025] 表1副干酪乳桿菌活化生長情況

【權(quán)利要求】
1. 一種高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述方法步驟如下： 將高黑芥子酶活性益生菌菌株以2-5%接種量接種到50-100mL MRS液體培養(yǎng)基中37°C 擴(kuò)大培養(yǎng)24-48h，以使細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期，無菌的30-40%甘油與菌懸液各lmL加入滅菌 的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20°C冰箱保存0. 5-lh后，立即放入冷凍罐 中，使溫度均勻下降，然后放入液氮罐中保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述高黑 芥子酶活性益生菌的篩選方法如下： 一、 將待測益生菌于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，于37°C恒 溫培養(yǎng)24h，如此反復(fù)活化2-3次即可使菌株恢復(fù)活力； 二、 初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液5mL培 養(yǎng)待篩菌株，培養(yǎng)時(shí)間48h，培養(yǎng)溫度30°C，觀察菌株生長情況，能夠正常生長的菌株用于 下一步實(shí)驗(yàn)； 三、 復(fù)篩：配置葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為10mm〇l/L的改良MRS培養(yǎng)液，將待 篩選菌株按常規(guī)接種量接種到該改良MRS培養(yǎng)液30°C過夜培養(yǎng)12-18h，然后離心取菌體， 加入lOmLMES緩沖液沖洗菌體，再次離心后將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，將菌懸液與 10mmol/L黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液按照1-1. 5:1的體積比混合，在30°C培養(yǎng)24-48h， 最后離心取上清液在340nm處測定吸光度，篩選出吸光度值差異在0. 2以上的菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述益生 菌為桿菌類益生菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述改良 MRS液體培養(yǎng)基的配制方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5. 0g、乙酸鈉
5. 〇g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、七水硫酸錳0. 05g，溶于水，然 后加 lml吐溫80,用水調(diào)至1000ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述 含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液的配制方法如下：無菌 100mm 〇l/L黑芥子硫苷酸鉀與改良MRS液體培養(yǎng)基以1:20的體積比混合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述 10mmol/L葡萄糖、10mmol/L黑芥子硫苷酸鉀改良MRS的配制方法如下：①10mmol/L葡萄糖 改良MRS的配制：蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸鈉
2.(^、磷酸氫二鉀2.(^、七水硫酸鎂0.28、七水硫酸錳0.058，1.88葡萄糖溶于水，然后加 lml吐溫80,用水調(diào)至1000ml。
7. ②10mm〇l/L葡萄糖改良MRS與無菌100mm〇l/L黑芥子硫苷酸鉀以20:1的體積比混 合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述30% 甘油配制方法為：取300ml甘油和700ml無菌水混勻，121 °C高壓蒸汽滅菌30min。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述冷凍 罐中裝有90%異丙醇+10%酒精。
【文檔編號】C12R1/01GK104293669SQ201410530160
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】單毓娟, 張?zhí)m威, 李寶龍, 任明華, 宋微, 雷鵬, 何燦霞, 田思聰 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)