一種s-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋，其特征在于：以S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(AdoMetDC)的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將PDB ID為3DZ5的AdoMetDC晶體結(jié)構(gòu)中的第68位丙酮?；肞DB ID 1JL0的AdoMetDC晶體結(jié)構(gòu)中的第68位色氨酸殘基替代，以替代后的AdoMetDC晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過Pocket蛋白質(zhì)藥物口袋分析軟件，確定在alpha亞基和beta亞基兩條鏈之間形成的藥物口袋為S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋，并將該藥物口袋應(yīng)用于AdoMetDC抑制劑的篩選、設(shè)計和改造。
【專利說明】一種S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域,涉及S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(s-adenosylmeth1ninedecarboxylase ；AdoMetDC),具體涉及人源S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的的小分子抑制劑的篩選和設(shè)計口袋。

【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)是生物體的主要組成成分之一，是完成各種生命活動的主要物質(zhì)。在各種蛋白質(zhì)中，蛋白酶對生命活動至關(guān)重要，幾乎所有生物體內(nèi)的生化反應(yīng)過程都由蛋白酶進行催化。生物體內(nèi)各種蛋白酶的活性具有嚴格的調(diào)控機制，一旦其調(diào)控機制出現(xiàn)問題，造成蛋白酶的活性過高、過低或者是完全失活，都會造成相應(yīng)的各類疾病。因此，通過藥物來調(diào)控蛋白酶的活性，使其恢復和保持在正常水平，具有非常重要的理論意義和現(xiàn)實意義。以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計，是設(shè)計以蛋白質(zhì)為靶標的藥物的一個非常重要的手段。
[0003]多胺(polyamines)是一類從氨基酸代謝產(chǎn)生的帶正電的陽離子小分子，在所有生物體中都存在，對細胞生長、分化、存活及正常生物學功能等都不可缺少。多胺帶多正電荷的特性，使它們能通過與帶負電荷的生物大分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細胞膜等)形成靜電作用，從而調(diào)控非常廣泛的生物學過程，包括染色體結(jié)構(gòu)形成、DNA合成與穩(wěn)定、DNA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白質(zhì)磷酸化、核糖體生成、離子通道和膜表面受體的調(diào)控、自由基清除等。天然的多胺有很多種。在哺乳動物中，天然存在的有三種，即putrescine(腐胺),spermidine (精脒),spermine.(精胺)，它們對哺乳動物正常生長和發(fā)育必不可少。由于多胺具有重要的生物學功能，其細胞內(nèi)水平受到嚴格的調(diào)控。在快速繁殖的細胞(如腫瘤細胞)中，多胺水平也會上升和失調(diào)。多胺水平升高，伴隨著細胞增殖加快、凋亡減少、以及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達水平升高等。因此，多胺的調(diào)控，成為腫瘤治療和藥物研發(fā)中的一個重要手段。
[0004]AdoMetDC是多胺體內(nèi)合成的一個關(guān)鍵酶，對于精胺和精脒的合成至關(guān)重要，因為精胺和精脒的氨丙基來源于AdoMetDC的脫羧反應(yīng)。因此，合成AdoMetDC抑制劑，抑制精胺和精脒的生成，是目前很受關(guān)注的一個腫瘤治療途徑。同時，由于病原微生物也需要維持正常的多胺水平，因此AdoMetDC抑制劑也成為針對病原微生物的一個重要藥物靶標。
[0005]當前，AdoMetDC的抑制劑MGBG(米托胍腙)已經(jīng)被用于臨床中的抗白血病治療和癌癥的化療輔助藥物。但MGBG會導致嚴重的線粒體損傷，因此毒副作用非常大。AdoMetDC的抑制劑CGP 48664(SAM486A)已經(jīng)進入I期和II期臨床評估。因此，開發(fā)出具有更好效果的AdoMetDC新型抑制劑具有重要意義和價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是確定AdoMetDC蛋白酶的新型藥物結(jié)合口袋,用于AdoMetDC的新型抑制劑篩選和設(shè)計。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是，以人源AdoMetDC的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過比較不同晶體結(jié)構(gòu)，并結(jié)合蛋白質(zhì)藥物口袋分析軟件，找出并確定可以用于藥物設(shè)計的結(jié)合口袋，并對該口袋進行小分子藥物的篩選和驗證。
[0008]按照以上方案，首先比較分析不同的人源AdoMetDC晶體結(jié)構(gòu)。由于人源AdoMetDC在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中，是一個單鏈的蛋白。在腐胺的結(jié)合下，發(fā)生自催化，在Glu67和Ser68間發(fā)生斷裂，形成alpha亞基和beta亞基兩條鏈，同時Ser68會轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€對其活性至關(guān)重要的丙酮?；?br> [0009]本發(fā)明的技術(shù)方案是確定一個在Glu67和Ser68間的肽鍵斷裂后，Ser68轉(zhuǎn)變?yōu)楸；暗腶lpha亞基和beta亞基形成的口袋,作為新型AdoMetDC抑制劑篩選和設(shè)計的口袋。為了達到該目的，將I3DB ID為3DZ5的AdoMetDC晶體結(jié)構(gòu)中的第68位丙酮?；?，用PDB ID為IJLO的AdoMetDC晶體結(jié)構(gòu)中的第68位色氨酸殘基進行替代。替代前，將兩個晶體結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件Pymol中進行結(jié)構(gòu)比對，以使兩個結(jié)構(gòu)的原子坐標一致，然后將PDB文件中第68位殘基對應(yīng)的坐標行進行替換。這個經(jīng)過坐標替換后的新的AdoMetDC結(jié)構(gòu)，如圖1所示。
[0010]以上述結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，利用Pocket蛋白質(zhì)藥物口袋分析軟件，對Glu67和Ser68區(qū)域的口袋進行了分析。通過Pocket軟件的輔助，我們確定了該區(qū)域的一個藥物設(shè)計口袋。該藥物設(shè)計口袋的示意圖如圖2所示。
[0011]本發(fā)明的實驗對象是人源AdoMetDc，但由于不同來源的AdoMetDC之間具有同源性，因此我們的抑制劑同樣能夠作用于其它非人源的AdoMetDC，以及其它的AdoMetDC的同功能蛋白酶。
[0012]本發(fā)明的殘基坐標替換法產(chǎn)生的這個AdoMetDC藥物口袋，主要是用于AdoMetDC抑制劑的篩選、設(shè)計和改造。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為經(jīng)過68位殘基坐標替換后的AdoMetDC結(jié)構(gòu)不意圖。黑色的為alpha亞基，淺灰色的為beta亞基。Glu67和Ser68分別顯示為棒狀模型。
[0014]圖2為口袋示意圖。
[0015]圖 3 為 4_(2_{[(5-phenyl_2-furyl)methyl]amino}ethyl)benzenesulfonamide的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖 4 為 4_(2_{[(5-phenyl_2-furyl)methyl]amino}ethyl)benzenesulfonamide在藥物口袋卡通構(gòu)象示意圖。
[0017]圖 5 為 4_(2_{[(5-phenyl_2-furyl)methyl]amino}ethyl)benzenesulfonamide對AdoMetDC的活性抑制效果。
[0018]圖6為
2-[({3-nitro-lH-l, 2, 4-triazol-l-yl}acetyl)amino]-4, 5-dimethyl-3-th1phenecarboxamide的結(jié)構(gòu)不意圖。
[0019]圖7為
2-[ ({3-nitro-lH-l, 2, 4-triazol-l-yl} acetyl) amino] -4, 5-dimethyl-3-th1phenecarboxamide在藥物口袋卡通構(gòu)象示意圖。
[0020]圖8 為
2-[ ({3-nitro-lH-l, 2, 4-triazol-l-yl} acetyl) amino] -4, 5-dimethyl-3-th1phenecarboxamide對AdoMetDC的活性抑制效果。
[0021]圖 9 為 3, 3-dichloro-6, 8-bisnitro-2, 4(1H, 3H)-quinolined1ne 的結(jié)構(gòu)不意圖。
[0022]圖 10 為 3，3-dichloro-6, 8_bisnitro-2，4(1H, 3H)-quinolined1ne 在藥物口袋卡通構(gòu)象示意圖。
[0023]圖 11 為 3，3-dichloro-6, 8-bisnitro-2, 4(1H, 3H)-quinolined1ne 對 AdoMetDC的活性抑制效果。

【具體實施方式】
[0024]實施例1
按照以上方案，我們利用AutoDockVina軟件，通過將SPECS小分子數(shù)據(jù)庫中的小分子對接到我們確定的AdoMetDC 口袋中，通過AutoDockVina軟件給出的打分進行評價，最低打分低于-7.0的小分子用于實驗驗證。
[0025]如圖2所示中如圖所示,黑色的為alpha亞基,淺灰色的為beta亞基,深灰色為藥物口袋的表面顯示示意圖。組成該口袋的氨基酸殘基用棒狀模型顯示。該口袋主要由以下氨基酸殘基(氨基酸殘基+完整AdoMetDC序列中位置編號)形成:His5，Phe6, Phe7, Glu8，Gly9, ThrlO, Glull, Gln48, Cys49, Ser50, Ile52, Val64, Leu65, Ser66, Glu67, Ser68, Ser69，Lys80, Thr81, Cys82, Gly83, Thr84, Thr85, Tyrl93, Metl94, Thr221, Met222, Phe223, Asn224，Pro225, Cys226, Gly227, Tyr228, Ser229, Ile242, His243, Ile244, Thr245, Pro246, Glu247，Phe250, Tyr252, Val253, Ser254.所涉及的小分子抑制劑為 4- (2- {[ (5-phenyl-2-furyl) methyl] amino} ethyl)benzenesulfonamide,其結(jié)構(gòu)不如圖3所不。
[0026]上述小分子抑制劑經(jīng)過AutoDockVina軟件對接，給出的最低打分構(gòu)象在AdoMetDC藥物口袋中的卡通構(gòu)象如圖4所不,深灰色的為alpha亞基,淺灰色的為beta亞基，該藥物顯示為棒狀模型。
[0027]通過對該小分子的活性檢測發(fā)現(xiàn)，該小分子具有明顯的AdoMetDC活性抑制效果，結(jié)果如圖5所示。小分子用DMSO溶解，因此用DMSO做對照。AdoMetDC活性高，則NADH減少，光吸收下降。小分子抑制AdoMetDC活性，則使光吸收下降減少。
[0028]所述的活性檢測方法為用1.5mL的EP試管，將二氧化碳測定試劑的R1715uL、R2235uL進行混合，然后添加2uL濃度為500mM的腺苷甲硫氨酸，最后添加AdoMetDC蛋白酶終濃度為luM，使總體積為lOOOul，啟動反應(yīng)。反應(yīng)時，在37度水浴中進行孵育，l-30min后，將溶液轉(zhuǎn)至透明96孔板(200uL/孔)，利用酶標儀等儀器檢測體系在340nm波長處的光吸收。通過比較不加AdoMetDC的對照體系，對反應(yīng)活性進行判斷。
[0029]實施例2
本發(fā)明所涉及的小分子抑制劑為 2_[ ({3-nitro-lH-l, 2, 4-triazol-l-yl} acetyl) amino]-4, 5-dimethyl-3-th1phenecarboxamide,其結(jié)構(gòu)不意圖如圖 6。
[0030]上述小分子抑制劑經(jīng)過AutoDockVina軟件對接，給出的最低打分構(gòu)象在AdoMetDC藥物口袋中的卡通構(gòu)象如圖7所不,深灰色的為alpha亞基,淺灰色的為beta亞基，該藥物顯示為棒狀模型。
[0031]通過對該小分子的活性檢測發(fā)現(xiàn)，該小分子具有明顯的AdoMetDC活性抑制效果，結(jié)果如圖8所示。小分子用DMSO溶解，因此用DMSO做對照。AdoMetDC活性高，則NADH減少，光吸收下降。小分子抑制AdoMetDC活性，則使光吸收下降減少。具體活性檢測步驟見實施例1中所述。
[0032]實施例3
本發(fā)明所涉及的小分子抑制劑為 3，3-dichloro-6, 8-bisnitro_2, 4 (1H, 3H) -quinolined1ne,其結(jié)構(gòu)示意圖如圖9。
[0033]上述小分子抑制劑經(jīng)過AutoDockVina軟件對接，給出的最低打分構(gòu)象在AdoMetDC藥物口袋中的卡通構(gòu)象如圖10所不,深灰色的為alpha亞基,淺灰色的為beta亞基，該藥物顯示為棒狀模型。
[0034]通過對該小分子的活性檢測發(fā)現(xiàn)，該小分子具有明顯的AdoMetDC活性抑制效果，結(jié)果如圖11所示。小分子用DMSO溶解，因此用DMSO做對照。AdoMetDC活性高，則NADH減少，光吸收下降。小分子抑制AdoMetDC活性，則使光吸收下降減少。具體活性檢測步驟見實施例1中所述。
【權(quán)利要求】
1.一種3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋，其特征在于:以3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(八(1016^)0的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將？08 10為3025的晶體結(jié)構(gòu)中的第68位丙酮?；茫?8 10 1幾0的八(10140(:晶體結(jié)構(gòu)中的第68位色氨酸殘基替代，以替代后的八(10140(:晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過？04的蛋白質(zhì)藥物口袋分析軟件，確定在31？匕亞基和136^亞基兩條鏈之間形成的藥物口袋為3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋，其特征在于:所述的在31？匕亞基和“仏亞基兩條鏈之間形成的藥物口袋是在3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶上的861-68轉(zhuǎn)變成丙酮酰基之前。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋，其特征在于:所述的31？匕亞基和“仏亞基兩條鏈是在3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶與腐胺的結(jié)合下，8-腺苷甲硫氨酸脫羧酶發(fā)生自催化反應(yīng)，61^167和361*68間的肽鍵斷裂,形成的亞基和1361:8亞基兩條鏈。
4.一種3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋在篩選或設(shè)計或改造人源3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的抑制劑上的應(yīng)用。
5.一種3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋在篩選或設(shè)計或改造非人源3-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的抑制劑上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/527GK104357545SQ201410530674
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】劉森, 廖陳曾 申請人:三峽大學