一種埃博拉病毒快速分型鑒別檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種埃博拉病毒快速分型鑒別檢測的試劑盒，特別是涉及一種利用多重實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)鑒別本迪布焦埃博拉病毒(BDBV)、扎伊爾埃博拉病毒(EBOV)、蘇丹埃博拉病毒(SUDV)和塔伊森林埃博拉病毒(TAFV)。本試劑盒主要包括RT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)酶系、DEPC H2O，以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒通過多種熒光通道分別檢測的方式，應(yīng)用一步法實時熒光PCR反應(yīng)模式，能準確快速檢測并鑒別出埃博拉病毒的四種型別，可廣泛應(yīng)用于埃博拉病毒病的早期鑒別診斷、疫情防控、檢驗檢疫等多個領(lǐng)域。
【專利說明】一種埃博拉病毒快速分型鑒別檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種埃博拉病毒型別鑒定檢測的試劑盒，特別是涉及一種利用多重實 時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)一管反應(yīng)即可鑒別出埃博拉病毒四種致病性型別的試劑盒。本 試劑盒主要包括RT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)酶系、DEPC H2O,以及分隔并 集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒能準確區(qū)分4種致病性型別的埃博拉病 毒即：扎伊爾型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉病毒、塔伊森林型埃博 拉病毒，可廣泛應(yīng)用于埃博拉病毒病臨床早期診斷、重癥病例預(yù)警、口岸檢驗檢疫、疫情防 控、媒介控制及科學(xué)研究等多個領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 埃博拉病毒?。‥VD ;以往稱為埃博拉病毒性出血熱）是嚴重的、往往致命的人類 疾病。在1976年首次發(fā)生于剛果民主共和國（前扎伊爾）埃博拉河流域，因其引起病人全 身性出血癥狀，故命名為埃博拉出血熱。世界衛(wèi)生組織（WHO)已經(jīng)將其列為對人類危害最 嚴重的傳染病之一，并規(guī)定有關(guān)其活病毒的研究必須在生物安全4級實驗室中進行。EVD的 病原體是埃博拉病毒，主要通過體液、血液、分泌物進行傳播。埃博拉病毒通過干擾感染者 機體凝血平衡，導(dǎo)致血管壁破壞或功能受損，血小板不能凝血，在2-21天內(nèi)出現(xiàn)出血性休 克或器官衰竭,死亡率很高。
[0003] 埃博拉病毒隸屬于絲狀病毒科（Filoviridae)，絲狀病毒屬（Filovirus)，是非 分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒。埃博拉病毒屬包括五種不同的型別：本迪布焦埃博拉病毒 (BDBV)、扎伊爾埃博拉病毒（EBOV)、雷斯頓埃博拉病毒（RESTV)、蘇丹埃博拉病毒（SUDV)和 塔伊森林埃博拉病毒（TAFV)。除雷斯頓埃博拉病毒對人呈隱形感染外，其余4亞型對人都 有致死性。本迪布焦埃博拉病毒、扎伊爾埃博拉病毒和蘇丹埃博拉病毒與非洲埃博拉病毒 病大型疫情相關(guān)，而雷斯頓埃博拉病毒和塔伊森林埃博拉病毒則與之無關(guān)。
[0004] 埃博拉病毒病病人樣本具有極端生物危害風(fēng)險；只有在最高級別的生物防護條件 下才可進行檢測。埃博拉病毒感染可通過若干類型的實驗室檢測獲得明確診斷，如：抗體捕 獲酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)、抗原檢測試驗、血清中和試驗、常規(guī)RT-PCR檢測、Real time RT-PCR檢測、電子顯微鏡檢查和病毒分離培養(yǎng)。但是，血清學(xué)試驗、病毒培養(yǎng)具有靈敏度低、 免疫交叉反應(yīng)以及周期長等缺點；而常規(guī)RT-PCR又容易產(chǎn)生污染，造成假陽性的產(chǎn)生。多 重實時熒光PCR技術(shù)是將PCR技術(shù)和多色熒光標記探針相結(jié)合的先進技術(shù)，該方法具有快 速、特異、靈敏、自動化程度高等特點，結(jié)合防污染技術(shù)處理，特別適合于大規(guī)模、快速診斷 的需求。該技術(shù)采用多色熒光對多條種特異性探針進行標記，配合多重PCR技術(shù)，可以在 同一個PCR反應(yīng)管中對多個病毒同時進行擴增，各色熒光的增長信號與相應(yīng)PCR產(chǎn)物的增 長量成等比關(guān)系，并被自動化熒光檢測儀收集，最后可通過分析熒光增長曲線達到檢測病 原體類型的目的。由于，熒光PCR技術(shù)具有擴增片段短，引物、探針具有雙重特異等優(yōu)點，因 此，將多重實時熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于埃博拉病毒分型的快速檢測，能夠節(jié)約時間、減少取材 數(shù)量、提高檢測鑒別效率，能在短時間內(nèi)判斷疑似病例或可疑媒介是否感染致病性埃博拉 病毒及同時確診所感染的型別，便于臨床及時采取必要的防控和治療措施，防止這些病毒 繼續(xù)傳播，并提高診療效率，為快速診斷、有效監(jiān)測和針對性治療提供支持和依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)中的多重實時熒光PCR方法，對埃博拉病毒的四種 致病性型別（本迪布焦型、扎伊爾型、蘇丹型和塔伊森林型）核酸進行擴增，根據(jù)標記的四 色熒光的擴增情況，來鑒別埃博拉病毒的致病性型別。本發(fā)明的試劑盒可廣泛地運用于由 埃博拉病毒引發(fā)的埃博拉出血熱或疑似埃博拉出血熱患者的樣本檢測和實驗室診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用多重實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)進行對四種 致病性埃博拉病毒型別的鑒別試劑盒，利用本試劑盒可以準確區(qū)分本迪布焦埃博拉病毒、 扎伊爾埃博拉病毒、蘇丹埃博拉病毒和塔伊森林埃博拉病毒。
[0007] 在對GENBANK上所有已知的埃博拉病毒各致病性型別的核酸序列進行比對的基 礎(chǔ)上，分別尋找各型別核酸序列的特異性保守區(qū)，并針對保守區(qū)設(shè)計靶核苷酸引物和探針。 這些引物探針在含有耐熱DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶、高質(zhì)量脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs)的 RT-PCR反應(yīng)酶系以及含有Mg2+等成份的RT-PCR反應(yīng)液中，通過熒光PCR儀實現(xiàn)體外核酸 的循環(huán)擴增。
[0008] 本發(fā)明所涉及的試劑盒主要包括：DRT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反 應(yīng)酶系、DEPC H2O，陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝 盒。
[0009] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是引物探針混合液由四種致病性埃博拉病毒特異性 的正、反向引物，特異性的探針組成，其特征在于本迪布焦埃博拉病毒特異性的正向和反 向引物的序列分別是5'-TTGGAAAGTAATGCGGTAAAATA-3'（SEQIDN0 :l)和5'-GCAGCCA ATGTTCTCTTGATGT-3'（SEQIDN0:2) ;本迪布焦埃博拉病毒特異性的探針的序列是5'-C TACTCCCTGCTGCCTCGAGTGGAAA-3'（SEQ ID N0:3)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團 FAM和熒光淬滅基團BHQl ;扎伊爾埃博拉病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是 5' -GATGCCAACGAYGCTGTGAT-3'（SEQ ID N0:4)和 5' -TGCAAGAGGATGGAGACGAA-3'（SEQ ID NO :5)，扎伊爾埃博拉病毒特異性的探針的序列是5' -TCAGTGGCTCAAGCTCGTTTTTCAGGT-3'（ SEQID NO :6)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團HEX和熒光淬滅基團BHQl ;蘇丹埃博拉 病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5' -TGGTGTTGTTGACCCGTATG-3'（SEQID NO: 7)和5'-CGTCGTCCAAATTGAAGAGAT-3'（SEQID NO :8)，蘇丹埃博拉病毒特異性的探針的序列 是5'-CCTGACTACGAGGATTCGGCTGAAG-3'（SEQIDN0:9)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生 基團Texas Red和熒光淬滅基團BHQ2 ;塔伊森林埃博拉病毒特異性的正向和反向引物的序 列分別是 5' -CAACAACAAACACAGTCTTACAGG-3'（SEQID NO :10)和 5' -TTATCCCTGGCGTATTCTT GA-3'（SEQID NO :11)，塔伊森林埃博拉病毒特異性的探針的序列是5'-CTCCACACAAAACAATG ACAATCCTGC-3'（SEQ ID勵：12)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團075和熒光淬滅基團 BHQ2〇
[0010] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是引物探針混合液中引物濃度均為〇. 2mmol/L，探 針濃度均為0. lmmol/L。
[0011] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是RT-PCR反應(yīng)液由TriS-HCl (50mmol/L，pH8. 0)、 MgCl2 (8mmol/L)、KCl (250mmol/L)組成。
[0012] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是RT-PCR反應(yīng)酶系由熱啟動Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、 dNTPs組成。逆轉(zhuǎn)錄酶可選擇mMLV等常用逆轉(zhuǎn)錄酶。熱啟動Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs均可 采用市售產(chǎn)品，如Qiagen公司的產(chǎn)品，其中每人份RT-PCR反應(yīng)酶系中熱啟動Taq酶的用量 為8U，逆轉(zhuǎn)錄酶用量為3U，dNTPs用量為IOmmol。
[0013] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是PCR擴增的條件為：50°C 15分鐘，95°C 15分鐘； 95 °C 10秒，58 °C 35秒，40個循環(huán)（58 °C時收集熒光信號）。
[0014] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是試劑盒提供了質(zhì)控品，分別為陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì) 控品。陰性質(zhì)控品為健康人血漿，陽性質(zhì)控品為人工合成的含有四種致病性埃博拉病毒目 的基因的全長RNA，選擇濃度為4. OX 105copies/mL的RNA，并以等體積比混合均勻制備成 陽性質(zhì)控品。試劑盒中進行待檢標本檢測可同時進行兩種質(zhì)控品的檢測，僅當陽性質(zhì)控品 檢測時FAM、HEX、Texas Red及CY5通道熒光信號均呈陽性，陰性質(zhì)控品檢測四個通道熒光 信號均呈陰性時，待檢標本的檢測結(jié)果才有效。
[0015] 本發(fā)明的試劑盒擴增待檢標本由市售的熒光定量PCR儀自動完成，操作簡單，耗 時少，且最大限度地減少了污染的發(fā)生。檢測結(jié)果可用于埃博拉病毒分型、輔助臨床診斷及 常規(guī)監(jiān)測等多個領(lǐng)域研究。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點為：①對埃博拉病毒四種型別核酸擴增水平進行檢 測，可反映出樣本中埃博拉病毒感染的狀態(tài)及確認是何種型別埃博拉病毒感染，可用于埃 博拉病毒病的監(jiān)測和防控及臨床診斷，有助于埃博拉病毒病的早期診斷和治療；②分別針 對埃博拉病毒病4種致病性型別病毒核酸特異性序列設(shè)計專用引物、探針，保證檢測的特 異性和準確性，也具有較高通量，操作簡便、相對降低成本的優(yōu)點，更適用于多數(shù)患者檢測； ③一份樣本一次檢測即可鑒別四種型別的感染情況，檢測過程只需I. 5h，相比一個樣本進 行4次檢測或只進行埃博拉病毒通用型熒光法檢測，大大減少了工作量，提高了檢測效率； 相對于已有的核酸雜交法檢測技術(shù)，檢測所需時間縮短了一半以上；④試劑采用人工體外 合成的RNA作為陽性質(zhì)控品，即可以對試劑進行質(zhì)控，比質(zhì)粒作為質(zhì)控更具有效性和科學(xué) 性；⑤試劑采用RT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)酶系的大包裝設(shè)置，適合多種 熒光檢測設(shè)備，具有適用性更加廣泛的特點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1顯示PCR擴增的反應(yīng)條件。
[0018] 圖2顯示試劑盒陰性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中沒有S型擴增曲線，說明FAM、HEX、 Texas Red及CY5通道熒光信號均呈陰性。
[0019] 圖3顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中FAM通道的擴增曲線為S型，說明 該通道的熒光信號呈陽性。
[0020] 圖4顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中HEX通道的擴增曲線為S型，說明 該通道的熒光信號呈陽性。
[0021] 圖5顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中Texas Red通道的擴增曲線為S型， 說明該通道的熒光信號呈陽性。
[0022] 圖6顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中CY5通道的擴增曲線為S型，說明 該通道的熒光信號呈陽性。
[0023] 圖7顯示本迪布焦埃博拉病毒標準品的擴增曲線。圖中FAM通道的擴增曲線為S 型，說明試劑盒能夠檢測出本迪布焦埃博拉病毒RNA。
[0024] 圖8顯示扎伊爾埃博拉病毒標準品的擴增曲線。圖中HEX通道的擴增曲線為S型， 說明試劑盒能夠檢測出扎伊爾埃博拉病毒RNA。
[0025] 圖9顯示蘇丹埃博拉病毒標準品的擴增曲線。圖中Texas Red通道擴增曲線均為 S型，說明試劑盒能夠檢測出蘇丹埃博拉病毒RNA。
[0026] 圖10顯示塔伊森林埃博拉病毒標準品的擴增曲線。圖中Cy5通道擴增曲線均為 S型，說明試劑盒能夠檢測出塔伊森林埃博拉病毒RNA。
[0027] 圖11顯示登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III型、登革病毒IV型、乙型 腦炎病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒、漢灘病毒、漢城病毒樣本的擴增曲線。圖 中無擴增曲線，說明該樣本中不含有致病性埃博拉病毒核酸。

【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 實施例1埃博拉病毒分型鑒別檢測試劑盒及其使用
[0030] 1制備包括下列組成成分的試劑盒：引物探針混合液（25 μ 1/管）1管，RT-PCR反 應(yīng)液（250 μ 1/管），RT-PCR反應(yīng)酶系（75 μ 1/管）1管，陽性質(zhì)控品（200 μ 1/管）1管，陰 性質(zhì)控品（200 μ 1/ 管）1 管，DEPC H2O(2000 μ 1/ 管）1 管。
[0031] 2目的基因全長RNA的制備
[0032] 由委托公司合成并純化4種型別全長目的基因 RNA，通過紫外分光光度儀測得濃 度，然后計算其RNA拷貝數(shù)，并將4種RNA用DEPC H2O分別稀釋至I. OX 105C〇pieS/mL? I. OX 102copies/mL 的標準品。
[0033] 3實時熒光定量PCR擴增及檢測
[0034] 3. 1試劑準備：按比例取相應(yīng)量的引物探針混合液1 μ 1、RT-PCR反應(yīng)液5 μ 1、 RT-PCR反應(yīng)酶系3 μ I、DEPC H2Ol 1 μ 1，充分混勻后備用。
[0035] 3. 2加樣：向PCR反應(yīng)管中，分別加入陰、陽性質(zhì)控品、目的基因全長RNA溶液 5 μ 1，蓋緊管蓋，放入儀器樣品槽。
[0036] 3. 3 編輯：（ΑΒΙ Prism 7500 熒光定量 PCR 儀）
[0037] 打開Setup窗口，按對應(yīng)順序設(shè)直陰、陽性質(zhì)控品和待測標本，并在Name欄中設(shè) 置樣品名稱。選中所有設(shè)置樣品孔，雙擊，選擇Add Detector,選擇Reporter為FAM和 Quencher 為 none，再選擇 Reporter 為 HEX 和 Quencher 為 none ;再選擇 Reporter 為 Texas Red和Quencher為none ;然后選擇Reporter為Cy5和Quencher為none后關(guān)閉窗口。在 Passive Reference中選擇（none)。打開instrument窗口設(shè)置循環(huán)條件：50°C 15分鐘， 95°C 15分鐘；94°C 10秒，58°C 35秒，40個循環(huán)（見附圖1)。所有設(shè)置完成后保存文件，運 行。
[0038] 3. 4結(jié)果分析：
[0039] 反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。在Results下打開Ampplot窗口。選擇分析的目 的樣品所在位置。將Baseline數(shù)值改為start :3，stop :10，并打開manual設(shè)定Threshold : 1.5±100000。雙擊 Rn 坐標上數(shù)值打開 Graph settings 窗口，將 Post Run Settings 中 Log 改為 Linear，OK 后打開 Analysis preferences 窗口，在 Analysis 菜單下選擇 Analyze 自動分析結(jié)果。
[0040] 實施例2應(yīng)用埃博拉病毒分型鑒別檢測試劑盒檢測特異性樣品
[0041] 選取經(jīng)過病毒培養(yǎng)方法分別鑒定為登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III 型、登革病毒IV型、基孔肯雅病毒、乙型腦炎病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒、 漢灘病毒、漢城病毒陽性的血清樣本各1例作為特異性樣本，對所有樣本進行核酸提取， PCR擴增及結(jié)果分析步驟參照實施例1進行，同時進行陰，陽性質(zhì)控品的檢測。
[0042] 檢測結(jié)果：陰性質(zhì)控品的擴增曲線不呈S型（見附圖2)，陽性質(zhì)控品的擴增曲線 為明顯S型曲線（見附圖3,4, 5,6)，陰、陽性質(zhì)控品均符合試劑盒的質(zhì)控要求，因此待檢標 本的檢測結(jié)果是有效的。由待檢標本的檢測結(jié)果可知本試劑盒對登革病毒I型、登革病毒 II型、登革病毒III型、登革病毒IV型、基孔肯雅病毒、乙型腦炎病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜 合征布尼亞病毒、漢灘病毒、漢城病毒無非特異擴增（見附圖11)。
[0043] 本次試驗中9例標本的檢測結(jié)果與病毒培養(yǎng)鑒定結(jié)果完全吻合，說明利用本試劑 盒檢測及鑒別埃博拉病毒型別是可行的。本試劑盒操作簡便，檢測時間短，可實現(xiàn)高通量檢 測，加之其價格低廉，有望應(yīng)用于埃博拉病毒病的臨床檢測、檢驗檢疫以及疫情監(jiān)測。
【權(quán)利要求】
1. 一種埃博拉病毒分型鑒別檢測試劑盒，包括：1)RT_PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、 RT-PCR反應(yīng)酶系、DEPC H20，陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管 的包裝盒，其中引物探針混合液由埃博拉病毒四種型特異性的正、反向引物，埃博拉病毒四 種型特異性的探針組成，其特征在于： 1) 本迪布焦埃博拉病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是 5' -TTGGAAAGTAATGCGGTAAAATA-3' 和 5' -GCAGCCAATGTTCTCTTGATGT-3'，本迪布焦埃博拉病 毒特異性探針的序列是5'-CTACTCCCTGCTGCCTCGAGTGGAAA-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒光 發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團BHQ1 ;該對引物探針可特異性地檢測本迪布焦埃博拉病毒， 對其他型別埃博拉病毒無交叉反應(yīng)； 2) 扎伊爾埃博拉病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是 5' -GATGCCAACGAYGCTGTGAT-3' 和 5' -TGCAAGAGGATGGAGACGAA-3'，扎伊爾埃博拉病毒特異 性探針的序列是5' -TCAGTGGCTCAAGCTCGTTTTTCAGGT-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生 基團HEX和熒光淬滅基團BHQ1 ;該對引物探針可特異性地檢測扎伊爾埃博拉病毒，對其他 型別埃博拉病毒無交叉反應(yīng)； 3) 蘇丹埃博拉病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是 5' -TGGTGITGTTGACCCGTATG-3' 和 5' -CGTCGTCCAAAITGAAGAGAT-3'，蘇丹埃博拉病毒特異性 探針的序列是5' -CCTGACTACGAGGATTCGGCTGAAG-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團 Texas Red和熒光淬滅基團Eclipse ;該對引物探針可特異性地檢測蘇丹埃博拉病毒，對其 他型別埃博拉病毒無交叉反應(yīng)； 4) 塔伊森林埃博拉病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是 5' -CAACAACAAACACAGTCTTACAGG-3' 和 5' -TTATCCCTGGCGTAITCTTGA-3'，塔伊森林埃博拉病 毒特異性探針的序列是5' -CTCCACACAAAACAATGACAATCCTGC-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒 光發(fā)生基團Cy5和熒光淬滅基團Eclipse ;該對引物探針可特異性地檢測塔伊森林埃博拉 病毒，對其他型別埃博拉病毒無交叉反應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于所用探針3 '端可采用TAMRA、BHQ1、 BHQ2、Eclipse、Dabcy 1中任一熒光淬滅基團標記，所述2)中所用探針5 '端可采用VIC、 HEX、YELLOW中任一熒光基團標記，所述3)中所用探針5 '端可采用ROX、Texas Red中任一 突光基團標記，所述4)中所用探針5 '端可米用CY5、CY5. 5中任一突光基團標記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于引物探針混合液中引物濃度均為 0. 2mmol/L，探針濃度均為 0. lmmol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于RT-PCR反應(yīng)液由pH值為8. 0?8. 8 的 50mmol/L Tris_HCl、3 ?8mmol/L MgCl2、150 ?350mmol/L KC1 組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中RT-PCR反應(yīng)酶系由熱啟動Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、 dNTPs組成，特征在于每人份RT-PCR反應(yīng)酶系中熱啟動Taq酶的用量為5?10U ;逆轉(zhuǎn)錄酶 用量為 1. 5 ?5U ;dNTPs 為 6 ?12mmol。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴增的條件為：50°C 15分鐘，95°C 15 分鐘；94°C 15秒，58°C 35秒，45個循環(huán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，還提供了陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，其特征在于陰性質(zhì) 控品為健康人血漿，陽性質(zhì)控品為含有埃博拉病毒四種型別的目的基因RNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，陽性質(zhì)控品為基因合成方式制備的含四種型別埃博拉病 毒目的全長的RNA。
【文檔編號】C12Q1/70GK104328216SQ201410530911
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】周其偉, 楊海星, 李麗梅, 周阿濤, 高秀潔 申請人:中山大學(xué)達安基因股份有限公司