單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃描檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測領域，尤其涉及一種鑒定單核細胞增多性李斯特菌（ Listeriamonocytogenes ）的方法。單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃描檢測方法，該方法包括以下步驟：1）PNA分子信標的設計；2）液相PNA分子信標的原位雜交；3）熒光掃描；4）熒光掃描結果的判斷。本發(fā)明PNA具有良好的細胞穿透性，與DNA和RNA特異性結合的高穩(wěn)定性，使本發(fā)明的檢測方法具有準確、靈敏的特點。同時將PNA探針結合分子信標標記和熒光掃描技術，在大幅降低假陽性、克服假陰性的情況下大幅提高檢測效率，最后用顯微鏡對陽性樣品進行確證，使檢測具有分子生物學和形態(tài)學的雙重保證，更加提高了鑒定的準確率。
【專利說明】單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃 描檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領域，尤其涉及一種鑒定單核細胞增多性李斯特菌 {Listeriamonocytogenes')該]卞法^

【背景技術】
[0002] 單核細胞增多性李斯特菌是李斯特菌屬中人畜共患型的食源性致病菌。感染后常 表現(xiàn)為腦膜腦炎、腦炎、骨髓炎、心肌炎、膿血癥、流產(chǎn)等，對嬰兒及免疫力低下的人群致死 率高達54%?90%。該菌在自然界中廣泛分布，環(huán)境適應性很強，可通過多種途徑進入食品 加工和生產(chǎn)過程污染食品，對消費者健康構成潛在威脅。
[0003] 肽核酸是1991年由丹麥科學家Nielsen等人設計的一種以中性酰胺鍵為骨架的 全新的DNA模擬物，可以序列特異地與DNA、RNA結合。其骨架為電中性，因此具有很高的 DNA或RNA親和性和良好的細胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。PNA探針結合原位熒光雜 交技術（FISH)與PCR等方法比較，PNA-FISH法的結果判斷基于熒光檢測和形態(tài)檢測兩部 分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。
[0004] 分子信標（molecularbeacon)是一種在5'和3'末端自身形成一個8個堿基左 右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的 熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。當熒光基團被激發(fā)時，發(fā)生熒光共振能量 轉移，使熒光分子發(fā)出的熒光被猝滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅，熒 光本底極低。當分子信標與序列完全互補的靶標分子結合形成雙鏈雜交體時，信標莖桿互 補區(qū)被拉開，熒光分子和猝滅分子距離增大，信標分子的熒光幾乎100%恢復，且所檢測到 的熒光強度與溶液中靶標的量成正比。
[0005] 傳統(tǒng)的PNA-FISH法檢測中，結果的判斷單純依靠顯微鏡觀察，這無疑是一大限速 步驟，因此在本發(fā)明中引入熒光掃描技術，通過儀器對對應波長熒光的掃描可以快速的對 檢測結果進行初篩，大大提高了檢測速率和通量。同時，為了防止由于加入過量探針而引起 的假陽性，我們在探針的兩頭分別標記了熒光基團和淬滅基團，形成分子信標結構。當探針 未與目標核酸序列結合時，由于PNA的電中性骨架，無需普通核酸分子信標所需的"莖桿" 設計，自然狀態(tài)下PNA分子信標兩頭的熒光基團和淬滅基團以自聚集的方式靠近，所激發(fā) 的熒光都被淬滅基團吸收，因此即便液相PNA熒光雜交液中有過量的游離狀態(tài)的PNA探針 也檢測不到熒光，不會產(chǎn)生假陽性。而那些與目標核酸結合的探針，由于探針伸展為線狀， 造成熒光基團和淬滅基團分離，發(fā)出熒光從而被檢測到。


【發(fā)明內容】

[0006] 為了解決上述的技術問題，本發(fā)明的目的是提供換一種單核細胞增多性李斯特菌 的肽核酸分子信標標記和熒光掃描檢測方法，該檢測方法具有準確、靈敏的特點。
[0007] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案： 單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃描檢測方法，該方法包括以 下步驟： 1) PNA分子信標的設計 在具有單增李斯特菌（Listeriamonocytogenes)特異性的PNA探針的5'端和3'端 分別標記報告熒光基團FAM和淬滅基團BHQ1 ; 2) 液相PNA分子信標的原位雜交 離心收集對數(shù)生長期的細菌，室溫固定，固定好的菌體，離心，棄上清，加入PNA分子 信標的雜交緩沖液室溫下重懸；同時設置兩組陰性對照： 對照一：不含PNA分子信標的雜交緩沖液重懸； 對照二：含RNase和PNA分子信標的雜交緩沖液重懸； 將上述重懸菌液、兩組陰性對照于薄壁PCR管中加洗滌緩沖液重懸； 3) 突光掃描 取上述三種的重懸液加入黑色孔板中，將熒光檢測系統(tǒng)的吸收光譜和激發(fā)光譜調整到 相應的波長，進行熒光掃描檢測； 4) 熒光掃描結果的判斷 將對照二設置為空白，值為〇,將掃描后數(shù)值大于〇的結果判斷為陽性；將對照一設置 為空白，將掃描后數(shù)值大于〇,且同時該孔在設置對照二為空白時掃描值又小于〇,同時滿 足上述2個條件的雜交液也判斷為陽性； 上述的方法不應用于疾病的診斷。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的步驟1)中PNA探針的序列為

【權利要求】
1. 單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃描檢測方法，其特征在于 該方法包括以下步驟： 1. PNA分子信標的設計 在具有單增李斯特菌(Wisteria 特異性的PNA探針的5'端和3'端 分別標記報告熒光基團FAM和淬滅基團BHQ1 ; 2) 液相PNA分子信標的原位雜交 離心收集對數(shù)生長期的細菌，室溫固定，固定好的菌體，離心，棄上清，加入PNA分子 信標的雜交緩沖液室溫下重懸；同時設置兩組陰性對照： 對照一：不含PNA分子信標的雜交緩沖液重懸； 對照二：含RNase和PNA分子信標的雜交緩沖液重懸； 將上述重懸菌液、兩組陰性對照于薄壁PCR管中加洗滌緩沖液重懸； 3) 突光掃描 取上述三種的重懸液加入黑色孔板中，將熒光檢測系統(tǒng)的吸收光譜和激發(fā)光譜調整到 相應的波長，進行熒光掃描檢測； 4) 熒光掃描結果的判斷 將對照二設置為空白，值為〇,將掃描后數(shù)值大于〇的結果判斷為陽性；將對照一設置 為空白，將掃描后數(shù)值大于〇,且同時該孔在設置對照二為空白時掃描值又小于〇,同時滿 足上述2個條件的雜交液也判斷為陽性； 上述的方法不應用于疾病的診斷。
2. 根據(jù)權利要求1所述的單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于步驟1)中PNA探針的序列為TAGTACAAAGGGTCG。
3. 根據(jù)權利要求1所述的單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于步驟2)中離心收集對數(shù)生長期的細菌，用含50%酒精/磷酸緩沖液 PBS固定緩沖液重懸，細菌濃度控制在0D6(I(I=1. 0-1. 5,室溫固定1小時后置于-20°C保存。
4. 根據(jù)權利要求1所述的單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于步驟2)中對照二的制備方法如下：用40呢/ml RNase，pH7. 5,重 懸，37°C溫育1小時，離心2000g，5min，棄上清后加入50W含300 pmole/ml PNA分子信標 的雜交緩沖液重懸。
5. 根據(jù)權利要求1所述的單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于步驟2)中將重懸菌液、兩組陰性對照于薄壁PCR管中，55°C水浴 1. 〇小時，加入200W洗滌緩沖液，預熱至55°C，55°C水浴20min，2000g離心5min，棄洗 滌緩沖液，再重復洗滌1次，加110?150耵洗滌緩沖液重懸。
6. 根據(jù)權利要求1所述的單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標標記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于該方法還包括將步驟4)熒光掃描結果判斷為陽性的對應步驟2) 中的重懸菌液取2?5W涂片，風干后熒光顯微鏡觀察熒光亮度及細菌的形態(tài)，對結果加以 確證。
【文檔編號】C12Q1/04GK104342493SQ201410537112
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月13日 優(yōu)先權日:2014年10月13日
【發(fā)明者】吳姍, 張曉峰, 吳昺, 虞惠貞, 李可 申請人:浙江省檢驗檢疫科學技術研究院