懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法
【專利摘要】懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，是一種利用細胞培養(yǎng)反應器培養(yǎng)金線蓮細胞來生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法。本方法首先對金線蓮種子無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中未分化的單細胞，進一步培養(yǎng)成單細胞系，最后進行細胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細胞分裂生長，并防止細胞聚集結(jié)塊生長，同時選擇適合的光照強度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達。本發(fā)明能夠大幅度縮短細胞培養(yǎng)周期，提高金線蓮生物堿產(chǎn)品收率，且工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】 懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物堿生產(chǎn)技術，尤其涉及金線蓮生物堿的生產(chǎn)技術，具體為一種采用細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法。

【背景技術】
[0002]金線蓮生物堿類化合物是金線蓮的主要成分之一，金線蓮對支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、風濕性關節(jié)炎、急慢性肝病、高血壓、動脈硬化、腦血栓等均有輔助功效。金線蓮生物堿的藥理作用主要表現(xiàn)在消炎、解毒、護肝、預防心血管疾病的作用。隨著社會發(fā)展，人們對健康的關注越來越高，其需求量也會越來越大，但傳統(tǒng)金線蓮生物堿的提取方法是用金線蓮屬植物的根、莖、葉等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足未來市場對金線蓮精深加工的需求。
[0003]隨著植物細胞工程技術的發(fā)展，用細胞進行人工培養(yǎng)擴增提取植物的代謝產(chǎn)物，可以不受土地面積、氣候環(huán)境、地域、病蟲害等限制影響，適于工業(yè)化生產(chǎn)。利用細胞工程技術生產(chǎn)金線蓮生物堿的技術，在國內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在生產(chǎn)過程中存在很多難題問題，如生物量增速低、目標產(chǎn)物收率低、生產(chǎn)周期長等。關于利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)金線蓮細胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的研究還沒有報道，因此開發(fā)一種高效生產(chǎn)金線蓮生物堿類天然產(chǎn)物的方法是十分有意義的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所解決的技術問題在于提供一種利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，以解決上述【背景技術】中的研究空白。
[0005]本發(fā)明所解決的技術問題采用以下技術方案來實現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，是一種利用細胞培養(yǎng)反應器培養(yǎng)金線蓮單細胞系群來生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑來激活細胞生長并縮短細胞培養(yǎng)周期，同時選擇適合的光照強度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達。具體步驟見如下闡述:
(O單細胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用50-80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
(2)單細胞系培養(yǎng):
將收集到的單細胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細胞接種量為25±2g/L，光強度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當細胞密度達到10000-20000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細胞群放大培養(yǎng):
將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.l-2mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine, 6_節(jié)氛基嘿呤)0.l_2mg/L,中性果膠酶50-100mg/L,中性纖維素酶10-50mg/L，鮮細胞接種量為30±2g/L，光強度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補料液和NaOH溶液流加量保持PH在5.6±4;
(4)當細胞密度達到60000-80000個/ml即可停止培養(yǎng)，時間為15-18天，采用低速離心或其他方法收集金線蓮細胞，再常規(guī)方法提取金線蓮生物堿。
[0006]本發(fā)明工藝技術優(yōu)點
本發(fā)明中，首先對金線蓮種子無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中的單細胞，進一步培養(yǎng)成單細胞系，最后進行細胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細胞分裂生長，并防止細胞聚集結(jié)塊，保證營養(yǎng)和溶氧供應均勻、充分，同時選擇適合的光照強度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達。本發(fā)明能夠大幅度縮短細胞培養(yǎng)周期，提高產(chǎn)品收率，且工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【具體實施方式】
[0007]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。實施例所描述的具體的工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制本發(fā)明的權(quán)利要求，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0008]具體實施例1
1、培養(yǎng)階段
(1)單細胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
(2)單細胞系培養(yǎng)
將收集到的單細胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細胞接種量為25g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當細胞密度達到10000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.5mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine,6-節(jié)氨基嘌呤)0.5mg/L,中性果膠酶50mg/L,中性纖維素酶10mg/L，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4 ;
(4)當細胞密度達到60000個/ml即停止培養(yǎng),時間15天,采用100rpm低速離心收集金線蓮細胞，將收集到的金線蓮細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆? 2、提取階段
(1)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
(2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
(3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿；
(4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300?，時間為15min，最終形成懸濁液，將懸濁液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.019g，收率為
0.39%0。
[0009] 具體實施例2
1、培養(yǎng)階段
(O單細胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用60微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
(2)單細胞系培養(yǎng)
將收集到的單細胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細胞接種量為40g/L，光強度為20001ux，色溫為6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當細胞密度達到20000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)L0mg/L,6-BA(6-Benzylaminopurine,6_節(jié)氨基嘌呤)1.0mg/L,中性果膠酶80mg/L,中性纖維素酶20mg/L，鮮細胞接種量為40g/L，光強度為40001ux，色溫為6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4 ;
(4)當細胞密度達到70000個/ml即停止培養(yǎng)，時間18天，采用過濾法收集金線蓮細胞，將收集到的金線蓮細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆茫?br> 2、提取階段
(1)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
(2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次
0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
(3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總霍山石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗霍山石斛生物堿；
(4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300?，時間為15min，最終形成懸濁液，將懸濁液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.0225g,收率為0.45%0。
[0010] 對比例I
選取播種生長8個月的霍山石斛組培苗，將組培苗洗凈浙干后殺青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆茫?br> (1)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
(2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
(3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總霍山石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗霍山石斛生物堿，重0.161g ；
(4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300?，時間為15min，最終形成懸濁液，將懸濁液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.021g，收率為
0.42%0。
[0011 ] 實驗例I總生物堿含量的測定
1、對實施例提取的生物堿進行分析，具體分析方法如下。標準曲線的繪制:
精密稱取鹽酸麻黃堿對照品0.0lg，置于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，得含鹽酸麻黃堿濃度為100mg/L的對照品溶液.精密量取鹽酸麻黃堿對照品標準溶液
1,2, 3, 4, 5mL置于干燥的分液漏斗中，分別補水至5mL,再精確加入5mLpH5.4朽1檬酸2朽1檬酸鈉緩沖液，ImL0.1%溴麝香草酚藍溶液，氯仿10mL，振搖混勻待用.精確量取ImL于1mL容量瓶中用氯仿定容至刻度，搖勻.另取5mL二次純化水，同法操作，作為空白對照液，在412nm進行測定，以取樣量為橫坐標，吸收值為縱坐標，得回歸方程A= 0.0093C-0.0015,r=0.9998 (n=5).結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在15-100 μ g/mL范圍內(nèi)線性良好；
2、樣品的測定:精密稱取本實驗制得的生物堿樣品50mg適當稀釋后，按上述方法進行測定。
[0012]結(jié)論:
通過上述的培養(yǎng)和提取，可以很清楚的判定本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)法在細胞培養(yǎng)15-18天后生產(chǎn)的金線蓮生物堿在收率上可以接近甚至超過同期播種生長8個月的組培苗生產(chǎn)的金線蓮生物堿。
【權(quán)利要求】
1.懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，其特征在于，是一種利用細胞培養(yǎng)反應器對金線蓮細胞培養(yǎng)，添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑激活細胞生長并縮短細胞培養(yǎng)周期，來生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，具體步驟為: (1)單細胞制備 取金線蓮蒴果消毒后進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞,并離心過濾除雜,收集單細胞； (2)單細胞系培養(yǎng) 將收集到的單細胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細胞接種量為25土2g/L，光強度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當細胞密度達到10000-20000個/mL，即可放大培養(yǎng)； (3)細胞群放大培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的單細胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基中加入:NAA 0.l-2mg/L,6-BA 0.l_2mg/L，果膠酶 50_100mg/L，纖維素酶 10_50mg/L，鮮細胞接種量為30±2g/L，光強度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補料液和NaOH溶液流加量保持pH在.5.6 + 4 ； (4)當細胞密度達到60000-80000個/ml即可停止培養(yǎng)，時間為15-18天，釆用低速離心或過濾法收集金線蓮細胞，再常規(guī)方法提取金線蓮生物堿。
【文檔編號】C12P1/00GK104450787SQ201410537117
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】鄧輝, 陳乃富, 劉文中, 陳存武, 韓邦興, 余茂耘 申請人:皖西學院