一種改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性t細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基及其使用方法。向RPMI1640培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積10-12％的經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿，CD3/CD28抗體共表達(dá)的免疫磁珠，重組人白細(xì)胞介素2、2-巰基乙醇、雷帕霉素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、慶大霉素。將分離的細(xì)胞懸液接種在U型底的96孔板中，一般每1-2天可以分孔擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)間為3-4周。該培養(yǎng)體系中所有試劑均為GMP級(jí)別或臍血自體來(lái)源，避免動(dòng)物源性成分帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，可作為第三方無(wú)關(guān)供者直接用于臨床疾病治療；使用改良培養(yǎng)基擴(kuò)增的Treg細(xì)胞在生長(zhǎng)速度，純度，活性和淋巴細(xì)胞抑制功能等方面較傳統(tǒng)培養(yǎng)體系更優(yōu)越，有望作為第三方無(wú)關(guān)供者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)用于臨床疾病治療。
【專利說(shuō)明】一種改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及改良的人臍帶血來(lái)源的⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程中擴(kuò)增培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一組具有抑制自身免疫反應(yīng)、阻止損傷性免疫病理發(fā)生和維持機(jī)體免疫平衡作用的T細(xì)胞亞群，可用于預(yù)防和治療免疫排斥、移植物抗宿主病(GVHD)以及自身免疫性疾病。⑶4+⑶25+T細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞家族中最主要的一群，由Sakaguchi等[SakaguchiS, SakaguchiN, AsanoM, et al.1mmunologicalself toler-ancemaintainedby activated T cells express1n IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdownof singlemechanismof sel-f toIerancecau-sesvar1us autoimmune disease[J].JImmunol, 1995，155 (3): 1151-1164.]在1995年首先發(fā)現(xiàn)，它是IL-2受體的A鏈，持續(xù)表達(dá)于抗原誘導(dǎo)的活化T細(xì)胞表面，約占正常人外周血⑶4+T細(xì)胞的5%?10%。⑶4+⑶25+T細(xì)胞通過(guò)抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化、增殖，抑制了 B細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的異常表達(dá)，從而維持了機(jī)體的免疫平衡，其數(shù)量和功能的異?？蓪?dǎo)致多種自身免疫病的發(fā)生。在臨床應(yīng)用中，使用Treg細(xì)胞將成為一種很有潛力的預(yù)防和治療上述疾病的干預(yù)措施。
[0003]臍血內(nèi)含有豐富的造血干/祖細(xì)胞，自上世紀(jì)90年代以來(lái)，臍血干細(xì)胞移植技術(shù)在全世界得到快速發(fā)展，世界各國(guó)臍血庫(kù)應(yīng)運(yùn)而生，將原本自然流失的臍帶血，經(jīng)分離檢測(cè)深低溫保存，以備臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)臍血中同樣也含有Treg細(xì)胞，在數(shù)量上明顯多于成人外周血[GodfreyWR, Spoden DJ, GeYG, et al.Cord blood CD4+CD25+-derivedTregulatorycell linesexpressFoxP3 protein andmanifestpo-tent suppressor funct1n[J].Blood, 2005, 105(2):750-758.]。而且其來(lái)源廣泛、無(wú)創(chuàng)傷性、免疫原性低，使得臍血來(lái)源的Treg細(xì)胞較成人外周血來(lái)源的Treg細(xì)胞在細(xì)胞治療過(guò)程中具有更多的優(yōu)勢(shì)。但是一個(gè)臍血單位所分離出的Treg細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床需求的。而且新生兒臍帶血細(xì)胞是很少受到抗原刺激的初始T細(xì)胞，僅少量發(fā)育成熟，所以其表達(dá)Foxp3比例卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于成人外周血[WingK, LindgrenS, KollbergG, et al.CD4Tcellactivat1n bymy-elinoligodendrocyte glycoprotein is suppressed by adult but not cord bloodCD25+Tcells[J].Eur JImmunol，2003，33 (3):579-587.]。所以，如何將幼稚且易于分離的臍帶血CD4+CD25+Treg細(xì)胞的功能誘導(dǎo)成熟無(wú)疑對(duì)治療自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)性疾病及抑制同種異體移植排斥等臨床應(yīng)用具有重要意義。Treg僅占臍血(CB)有核細(xì)胞總數(shù)的5%(〈3X 16 細(xì)胞)[Lin SJ, Lu CH, Yan DC, et al.Expans1n of regulatory T cells fromumbilical cord blood and adult peripheral blood CD4+CD25+T cells[J].TmmunolRes.2014 Feb 11.Epub ahead of print]。為滿足臨床治療的要求，就需要在短期內(nèi)大量擴(kuò)增出純度高、活性好、功能強(qiáng)、產(chǎn)量穩(wěn)定的人臍血源性T調(diào)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞；而在Treg真正大規(guī)模用于臨床治療之前還有很多挑戰(zhàn)需要克服，目前還沒有一種最佳的能大量提供高純度、有活性、功能強(qiáng)的人臍血源性Treg細(xì)胞培養(yǎng)方法，所以如何通過(guò)建立優(yōu)化的能用于臨床治療的最佳Treg培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)方式成為T調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)用最迫切的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的旨在建立一種改良的能經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)提供有純度高、活性好、功能強(qiáng)、產(chǎn)量穩(wěn)定的人臍血來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞培養(yǎng)基及其使用方法。
[0005]一種改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，向RPMI1640培養(yǎng)基中添加經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿、⑶3/⑶28抗體共表達(dá)的免疫磁珠、重組人白細(xì)胞介素2、2_巰基乙醇和雷帕霉素。
[0006]具體是向RPMI1640培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積10_12 %的經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿。培養(yǎng)基中重組人白細(xì)胞介素2濃度為500-1000IU/mL、2-巰基乙醇濃度為50-100pmol/L、雷帕霉素濃度為 100_150nmol/L。
[0007]培養(yǎng)基中還含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸、慶大霉素。
[0008]培養(yǎng)基中4-羥乙基哌嗪乙磺酸濃度為20-25mmol/L、慶大霉素濃度為10_20 μ g/
mLo
[0009]所述的⑶3/⑶28抗體共表達(dá)的免疫磁珠初始添加數(shù)量與細(xì)胞比例為1:3-1:4，每隔1-2天繼代培養(yǎng)一次，繼代時(shí)CD3/CD28抗體共表達(dá)的免疫磁珠數(shù)量與細(xì)胞比例為1:2。
[0010]所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的使用方法，包括以下步驟:
[0011]I)用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)⑶25+免疫磁珠陽(yáng)性分離獲得富含⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；
[0012]2)用所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)獲得的⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0013]上述方法具體是收集⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，每5X 15個(gè)細(xì)胞用250 μ I含10-12%經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿，800IU/mL重組人白細(xì)胞介素2，50 μ M 2-巰基乙醇，10nM雷帕霉素的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，按與細(xì)胞數(shù)比例1:3_1:4加入⑶3/⑶28抗體共表達(dá)的免疫磁珠進(jìn)行培養(yǎng)；3-4天形成細(xì)胞集落后，打散細(xì)胞用含10-12%經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿，800IU/mL重組人白細(xì)胞介素2，50 μ M 2-巰基乙醇，10nM雷帕霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，然后進(jìn)行繼代擴(kuò)增，CD3/CD28抗體共表達(dá)的免疫磁珠與細(xì)胞的數(shù)目比例為1:2 ;以后每隔1-2天繼代一次。
[0014]將所述的培養(yǎng)基配制的細(xì)胞懸液接種在U型底的96孔板中，置于37°C、5% CO2,95%空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞在種板后第3-4天，每孔吹打混勻細(xì)胞后開始分3-4孔，分孔后細(xì)胞數(shù)量至少為2 X 15個(gè)細(xì)胞/孔，用所述的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液體積補(bǔ)充至200-250微升/孔進(jìn)行培養(yǎng)，之后再每1-2天分孔一次(分孔條件與前相同)，培養(yǎng)總時(shí)間為3-4周。
[0015]用冷凍保護(hù)劑重懸經(jīng)300rpm，10 min離心的擴(kuò)增后⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，分裝入冷凍管于液氮-196°C保存，所述的冷凍保護(hù)劑由10%二甲基亞砜，90%的自體臍帶血血漿組成。
[0016]本發(fā)明所述的經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿是獲取⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞時(shí)得到的血漿。
[0017]重組人白細(xì)胞介素2縮寫為rhIL-2 ;
[0018]2-巰基乙醇縮寫為2-ME ；
[0019]雷帕霉素英文為Rapamycin ；
[0020]4-羥乙基哌嗪乙磺酸縮寫為HEPES。
[0021]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:從臍帶血中分離的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有限，在之前擴(kuò)增體系基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，尤其是首次采用經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿作為培養(yǎng)基成分，然后在其他組分的協(xié)同作用下，在短時(shí)間內(nèi)能夠獲得滿足臨床需求的高質(zhì)高量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞制品，并在液氮中長(zhǎng)期保存，作為第三方無(wú)關(guān)供者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)用于臨床疾病治療，如移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病等。
[0022]本發(fā)明選用的各種原料作用如下:
[0023]重組人白細(xì)胞介素2(rhIL_2):為多肽類免疫增強(qiáng)劑。是一種淋巴因子，能刺激T細(xì)胞增殖分化，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞活性，激活產(chǎn)生淋巴因子的殺傷(LAK)細(xì)胞和腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)，刺激B細(xì)胞增殖分化和分泌抗體，誘導(dǎo)干擾素和多種細(xì)胞因子的分泌。
[0024]2-巰基乙醇(2-ME):是一種有機(jī)化合物，其化學(xué)式為H0CH2CH2SH，它兼具乙二醇(H0CH2CH20H)和乙二硫醇(HSCH2CH2SH)的官能團(tuán)，為揮發(fā)性液體，具有較強(qiáng)烈的刺激性氣味。通常用于二硫鍵的還原，可以作為抗氧化劑使用。
[0025]雷帕霉素(Rapamycin):是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑。雷帕霉素通過(guò)不同的細(xì)胞因子受體阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，阻斷T淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞由Gl期至S期的進(jìn)程，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。
[0026]與以往技術(shù)相比的有益效果
[0027]I,培養(yǎng)體系中所有試劑均為GMP級(jí)別或臍血自體來(lái)源,避免動(dòng)物源性成分帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，可作為第三方無(wú)關(guān)供者直接用于臨床疾病治療；
[0028]2，使用改良體系擴(kuò)增的Treg細(xì)胞在生長(zhǎng)速度，純度，活性和淋巴細(xì)胞抑制功能等方面較傳統(tǒng)培養(yǎng)體系更優(yōu)越。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為普通培養(yǎng)基和本發(fā)明改良培養(yǎng)基分別擴(kuò)增后的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯微鏡下圖像，放大倍數(shù)100X ；
[0030]圖2為對(duì)照組培養(yǎng)基和本發(fā)明改良培養(yǎng)基分別擴(kuò)增后的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增曲線；
[0031]圖3為使用對(duì)照組和改良組培養(yǎng)基分別在體外擴(kuò)增14天的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫表型分析；
[0032]圖4為使用對(duì)照組和改良組培養(yǎng)基分別在體外擴(kuò)增14天的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制效果；
[0033]圖5為凍存及復(fù)蘇后經(jīng)Annexin V-PI染色、流式分析人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡活性。

【具體實(shí)施方式】
[0034]在以下實(shí)施例中，本院產(chǎn)科30例正常分娩足月胎兒的臍靜脈血，結(jié)扎剪斷臍帶后立即進(jìn)行臍靜脈穿刺采血，肝素抗凝。該實(shí)驗(yàn)得到了中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，所采用的操作方法和操作步驟等，都是依據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員熟知的方法設(shè)計(jì)、實(shí)施的。
[0035]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，列舉以下實(shí)施例，但其對(duì)本發(fā)明的范圍無(wú)任何限制。
[0036]所述突光標(biāo)記的鼠抗人抗體購(gòu)自美國(guó)eB1sciense或BD公司；固定/破膜液及稀釋液、固定/破膜緩沖液購(gòu)自eB1sciense或BD公司；Ficol1-Plus淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自GE生物公司FC500流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特公司。分選⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞選用 MACS Milteny B1tec 公司的 CD25 Microbeads 11 (human)磁珠分離試劑盒，CD3/0)28抗體共表達(dá)的免疫磁珠(0)30)28 Microbeads)購(gòu)自Invitrogen公司。細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)因子購(gòu)自Life technology和Sigma等全球各大生物試劑公司。
[0037]實(shí)施例1.臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞分離、純化
[0038]本院產(chǎn)科收集30例正常分娩足月胎兒的臍靜脈血，結(jié)扎剪斷臍帶后立即進(jìn)行臍靜脈穿刺米血，肝素抗凝，一般米血量為50-100ml。
[0039]收集至50ml離心管，2500rpm離心10分鐘，取上層血漿層(作為本發(fā)明培養(yǎng)基成分的臍帶血自體血漿)備用，并以3倍體積的PBS稀釋下層血細(xì)胞層。血細(xì)胞重懸后，以1mll.077-1.080g/ml密度的淋巴分離液置于50ml離心管下層，40ml血細(xì)胞懸液輕柔加在上層，兩層之間有明顯界限，20°C，2000-2200rpm離心25分鐘，吸取中間云霧層獲得單個(gè)核細(xì)胞。PBS洗滌2次后計(jì)數(shù)細(xì)胞。
[0040]離心收集待分離細(xì)胞，每17個(gè)細(xì)胞用90 μ I的MACs Buffer緩沖液重懸，每17個(gè)細(xì)胞加入10μ I的CD25 Microbeads II，調(diào)整細(xì)胞密度至17個(gè)/100 μ 1，4°C孵育15分鐘。
[0041]每17個(gè)細(xì)胞用2ml的MACs Buffer緩沖液終止染色，300 X g離心10分鐘，，每18個(gè)細(xì)胞用500 μ I的MACs Buffer緩沖液重懸待用。
[0042]將LS分離柱安裝入磁場(chǎng)中，加入Iml MACs Buffer緩沖液X 3次洗柱，在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱。
[0043]加入細(xì)胞懸液過(guò)柱，在重力作用下自然流盡，收集流出分離柱的液體。
[0044]加入MACs Buffer緩沖液3ml X 3次洗柱，在重力作用下自然流盡，繼續(xù)收集流出分離柱的液體，此液體中所含細(xì)胞為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0045]將LS分離柱移出磁場(chǎng)，在分離柱下接無(wú)菌離心管，往分離柱中加入5ml MACsBuffer緩沖液，用活塞將附在分離柱上的細(xì)胞壓入離心管中。重復(fù)該步驟一遍，計(jì)數(shù)細(xì)胞后300 Xg離心10分鐘，得到的細(xì)胞為⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0046]實(shí)施例2.臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞條件性擴(kuò)增
[0047]1，改良組:收集⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞每5 X 15個(gè)細(xì)胞用250μ I含10-12%自體血漿，800IU/ml IL-2，50uM 2-ME, 10nM Rapamycin 的 RPMI1640 條件培養(yǎng)基重懸，加入與細(xì)胞數(shù)比例 1:3-1:4 的 CD3CD28 Microbeads。
[0048]培養(yǎng)3-4天形成細(xì)胞集落后，打散細(xì)胞以用250μ I含10-12%自體血漿，800IU/mlIL-2，50uM 2-ME, 10nM Rapamycin.，與 CD3CD28 Microbeads 的 RPMI1640 條件培養(yǎng)基進(jìn)行繼代分孔擴(kuò)增，⑶3⑶28 Microbeads與細(xì)胞的比例為1: 2，分孔初始時(shí)細(xì)胞數(shù)約為2 X 15個(gè)/孔。
[0049]之后再每隔1-2天分孔一次(分孔條件與前相同)，總的擴(kuò)增時(shí)間為3-4周，計(jì)數(shù)體外擴(kuò)增7、14、21、28天細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。
[0050]2，對(duì)照組:收集⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞每5 X 15個(gè)細(xì)胞用250μ I含10% -12%FBS,800IU/ml IL-2, 50uM 2-ME, 10nM Rapamycin 的 RPMI1640 條件培養(yǎng)基重懸，加入與細(xì)胞數(shù)比例 1:3-1:4 的 CD3CD28 Microbeads。
[0051]培養(yǎng)3-4天后形成細(xì)胞集落后，打散細(xì)胞以用25(^1含10%?85，800幾/1111 IL-2，與CD3CD28 Microbeads的RPMI1640條件培養(yǎng)基進(jìn)行分孔繼代擴(kuò)增，CD3CD28 Microbeads與細(xì)胞的比例為1:2。分孔初始時(shí)細(xì)胞數(shù)約為2X 15個(gè)/孔.
[0052]之后再每隔3-4天分孔一次(分孔條件與之前相同)，擴(kuò)增總時(shí)間為3-4周，計(jì)數(shù)體外擴(kuò)增7、14、21、28天細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。
[0053]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:改良組臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增的速度明顯快于對(duì)照組，
[0054]實(shí)施例3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞表型。
[0055]1.2.1收集使用對(duì)照組和改良組培養(yǎng)基在體外擴(kuò)增14天的⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞重懸至2 X 15個(gè)細(xì)胞/100 μ I。
[0056]1.2.2免疫熒光染色及細(xì)胞內(nèi)因子染色:分別加入⑶4-FITC，⑶4-ΡΕ、CD45-PE-Cy5，CD19_PE_Cy5，CD25_PE_Cy5，HLA-DR-PE, CD62L-PE, GITR-PE, CD127-PE, CD45-RO-PE, CD45-RA-PE-Cy5，CTLA-PE各5-20 μ I至本發(fā)明培養(yǎng)的各孔中，充分混勻，4°C避光孵育30min,力口入冷PBS洗漆I次，1600 r/min,離心5min,棄上清，如需細(xì)胞內(nèi)染色，加入新鮮配制的固定/破膜液0.5mL, 4°C避光60min，用固定/破膜緩沖液ImL洗滌I次后100 μ I重懸細(xì)胞，之后直接加入Foxp3-PE-Cy7和CTLA-PE各5 μ 1，4°C避光60min,用固定/破膜緩沖液2mL洗滌2次，棄上清，加入0.5mLPBS,充分混勻，4h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0057]1.2.3 FCM檢測(cè)采用FC500流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分析應(yīng)用CellQuest軟件。
[0058]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:改良組⑶4+⑶25+雙陽(yáng)細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(94.79% vs 74% )；改良組⑶127+細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(2% vs 19.09% );改良組HLA-DR細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(72.48% vs 24.56% )改良組⑶62L+細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(31.24% vs27.61% );改良組GITR+細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(69.99% vs 74.18% );改良組Foxp3+細(xì)胞比例與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0059]實(shí)施例4.臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞混合實(shí)驗(yàn)。
[0060]正常第三者的CD25_Responsor 細(xì)胞懸液用 CellTrace?CFSE Cell Proliferat1nKit處理，培養(yǎng)液洗滌3次后用培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液作為反應(yīng)細(xì)胞(2X 16個(gè)/ml，I X 15個(gè)/孔)，經(jīng)亞致死劑量輻照的正常人的PBMC細(xì)胞懸液作為刺激細(xì)胞(4 X 16個(gè)/ml，4 X 15個(gè)/孔)，分別取本發(fā)明體外擴(kuò)增的CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液與反應(yīng)細(xì)胞以不同比例進(jìn)行共培養(yǎng)(2 X 106/ml，Treg:Tresp = 1:64，1:32，1:16，1: 8，1: 4，1: 2，1:1)，加入 96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)體系總體積250 μ I/孔；另設(shè)單獨(dú)刺激細(xì)胞孔和單獨(dú)反應(yīng)細(xì)胞孔，均為三復(fù)孔。C02孵葙培養(yǎng)5天，收集細(xì)胞后采用FC500流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)以下公式計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。
[0061]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:改良組培養(yǎng)的臍帶血調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞對(duì)于T淋巴細(xì)胞的抑制效應(yīng)明顯高于對(duì)照組，特別是在Treg細(xì)胞數(shù)量較少的情況下(Treg=Tresp ^ 1/16)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0062]實(shí)施例5.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
[0063]凍存:用冷凍保護(hù)劑重懸經(jīng)300g，10 min離心的擴(kuò)增后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后，分裝入2ml凍存管至自動(dòng)程序降溫盒于液氮_196°C保存，所述的冷凍保護(hù)劑由10%二甲基亞砜，90%的自體血漿組成。
[0064]復(fù)蘇:準(zhǔn)備37°C溫水浴，將液氮-196°C保存的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞迅速置于水浴中不停震蕩，直至細(xì)胞融化成懸液。迅速將細(xì)胞加入15ml離心管中，用1640RPMI完全培基洗滌一遍后，Annexin V-PI雙染后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞的凋亡活性。
[0065]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:凍存及復(fù)蘇后經(jīng)Annexin V-PI染色、流式分析Treg細(xì)胞活率為96.1%，活性較高。
【權(quán)利要求】
1.一種改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，其特征在于，向RPMI1640培養(yǎng)基中添加經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿、⑶3/⑶28抗體共表達(dá)的免疫磁珠、重組人白細(xì)胞介素2、2_巰基乙醇和雷帕霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，其特征在于，向RPMI1640培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積10-12%的經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基中重組人白細(xì)胞介素2濃度為500-1000IU/mL、2-巰基乙醇濃度為50-100pmol/L、雷帕霉素濃度為100-150nmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基中還含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸、慶大霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基中4-羥乙基哌嗪乙磺酸濃度為20-25mmol/L、慶大霉素濃度為10-20 μ g/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，其特征在于所述的CD3/CD28抗體共表達(dá)的免疫磁珠初始添加數(shù)量與細(xì)胞比例為1:3-1:4，每隔1_2天繼代培養(yǎng)一次，繼代時(shí)CD3/CD28抗體共表達(dá)的免疫磁珠數(shù)量與細(xì)胞比例為1:2。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的使用方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)CD25+免疫磁珠陽(yáng)性分離獲得富含⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 2)用所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)獲得的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的使用方法，其特征在于，收集⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，每5X105個(gè)細(xì)胞用250μ 1含10-12%經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿，800IU/mL重組人白細(xì)胞介素2，50 μ Μ 2-巰基乙醇，ΙΟΟηΜ雷帕霉素的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，按與細(xì)胞數(shù)比例1:3-1:4加入⑶3/⑶28抗體共表達(dá)的免疫磁珠進(jìn)行培養(yǎng)；3_4天形成細(xì)胞集落后，打散細(xì)胞用含10-12%經(jīng)肝素抗凝的自體臍帶血血漿，800IU/mL重組人白細(xì)胞介素2，50 μ Μ 2-巰基乙醇，ΙΟΟηΜ雷帕霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，然后進(jìn)行繼代擴(kuò)增，CD3/CD28抗體共表達(dá)的免疫磁珠與細(xì)胞的數(shù)目比例為1:2;以后每隔1_2天繼代一次。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的使用方法，其特征在于，將所述的培養(yǎng)基配制的細(xì)胞懸液接種在U型底的96孔板中，置于37°C、5% C02、95%空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞在種板后第3-4天，每孔吹打混勻細(xì)胞后開始分3-4孔，分孔后細(xì)胞數(shù)量至少為2X 105個(gè)細(xì)胞/孔，用所述的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液體積補(bǔ)充至200-250微升/孔進(jìn)行培養(yǎng)，之后再每1-2天分孔一次，培養(yǎng)總時(shí)間為3-4周。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的改良的人臍血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的使用方法，其特征在于，用冷凍保護(hù)劑重懸經(jīng)300rpm，lOmin離心的擴(kuò)增后⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，分裝入冷凍管于液氮-196°C保存，所述的冷凍保護(hù)劑由10%二甲基亞砜，90%的自體臍帶血血漿組成。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK104357389SQ201410541887
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】王維, 易受南, 馬小倩, 張娟 申請(qǐng)人:湖南賽諾生物科技有限責(zé)任公司