一種灰葡萄孢的早期快速分子檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種灰葡萄孢的早期快速分子檢測方法，其步驟：（1）運用2對特異性引物對待鑒定菌株的基因組DNA進行LAMP擴增，所述的2對特異性引物的序列是：BC-F3；BC-B3；BC-FIP；BC-BIP；（2）利用上述引物在恒溫條件下，進行LAMP擴增，取瓊脂糖凝膠電泳分析或用染料法進行觀察；（3）進行結(jié)果判斷，觀察電泳結(jié)果是否有梯形條帶出現(xiàn)或加入染料后產(chǎn)物是否為綠色，如果有梯形條帶出現(xiàn)或產(chǎn)物為綠色，說明DNA來源為灰葡萄孢，如果沒有梯形條帶出現(xiàn)或產(chǎn)物不變色，說明DNA來源不是灰葡萄孢。實現(xiàn)了對灰霉病發(fā)病早期的快速檢測，準確的預(yù)測預(yù)報。檢測灰霉病，具有操作簡單易行、耗時短、靈敏度高、特異性強，結(jié)果判斷簡單可靠，具有廣泛的實際應(yīng)用價值。
【專利說明】一種灰葡萄孢的早期快速分子檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病害的分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種灰葡萄孢的早期快速分子的 檢測方法，可用于植物灰霉病的早期快速診斷及流行預(yù)測。

【背景技術(shù)】
[0002] 由灰葡萄孢ciflerea)引起的灰霉病是一種在全世界廣泛分布的重要 植物病害。它可以侵染包括茄科、豆科和薔薇科等數(shù)百種植物，在多種蔬菜的生產(chǎn)種植過程 中也常造成嚴重的危害，可使蔬菜的產(chǎn)量減少20%以上，嚴重時可達60%以上。隨著作物種 植面積的不斷增加，塑料大棚的使用也越來越多，而在大棚中灰葡萄孢的生長繁殖速度更 快，這導(dǎo)致灰霉病的發(fā)生更加嚴重，而且灰霉病一旦發(fā)生，可迅速產(chǎn)生大量的分生孢子進行 傳播擴散，難以有效防治，從而造成更大的經(jīng)濟損失。因此灰霉病是限制多種作物和蔬菜品 質(zhì)和產(chǎn)量提高的主要因素之一。
[0003] 對于多種植物病害來說，在病害發(fā)生的早期進行針對性防治效果較好，因此針對 特定病害發(fā)展快速特異的早期分子檢測手段至關(guān)重要。這種早期檢測技術(shù)有基于PCR的快 速檢測技術(shù)，也有基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（LAMP)而建立起來的快速特異檢測技術(shù)，LAMP 技術(shù)的引物設(shè)計比普通PCR要復(fù)雜得多，它是針對目標基因的6個不同區(qū)域設(shè)計出來4條 特異性引物，其中包括一對外引物及一對內(nèi)引物，但LAMP技術(shù)相對于PCR技術(shù)具有靈敏度 高和特異性強的特點；LAMP技術(shù)對擴增設(shè)備要求簡單、反應(yīng)時間短，通常在60分鐘內(nèi)可完 成整個擴增反應(yīng)，反應(yīng)過程中不需要專業(yè)的PCR儀，只需要簡單的水浴鍋即可，易于農(nóng)戶操 作，而且擴增所需費用低；同時LAMP的擴增結(jié)果通過添加燃料的方法可直接用肉眼觀察， 方便快捷。目前對于大多數(shù)的重要植物病害均開發(fā)出了一些基于PCR或LAMP的早期分子 檢測技術(shù)，其中也包括針對灰葡萄孢的早期檢測技術(shù)。但對于已報道的檢測技術(shù)來說，基于 PCR技術(shù)設(shè)計的灰葡萄孢檢測方法靈敏度有限，可檢測的DNA為微克級，而基于LAMP技術(shù)的 灰葡萄孢檢測方法靈敏度雖可達納克級，但并未對葡萄孢屬其它種及其近緣屬進行特異性 檢測區(qū)分。而已有報道顯示葡萄孢屬真菌包括灰葡萄孢、蠶豆葡萄孢、擬蠶豆葡萄孢等多個 種的病原真菌，在田間這些病原菌并不能有效進行區(qū)分，從而延誤病害的有效防治，因此需 要借助特異性強、靈敏度高且簡單易行的檢測技術(shù)進行早期的檢測區(qū)分。
[0004] 本發(fā)明依據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李國慶課題組通過RAro方法擴增獲得的灰葡萄孢特異 性片段進行LAMP的引物設(shè)計，發(fā)明了可用于科學(xué)研究及田間實踐灰葡萄孢分子檢測方法。 利用本發(fā)明進行灰葡萄孢的早期檢測，具有操作簡單易行、耗時短、靈敏度高、特異性強，結(jié) 果判斷簡單可靠的特點，具有廣泛的實際應(yīng)用價值，將其應(yīng)用于灰霉病病的預(yù)測預(yù)報中，必 將有利于田間灰霉病的綜合管理，促進多種作物的增產(chǎn)增收。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種田間灰霉病發(fā)病早期的快速分子的檢測方法，實 現(xiàn)了對灰霉病發(fā)病早期的快速檢測，為灰霉病的田間綜合管理提供了科學(xué)、準確的預(yù)測預(yù) 報。檢測灰霉病，具有操作簡單易行、耗時短、靈敏度高、特異性強，結(jié)果判斷簡單可靠的特 點，具有廣泛的實際應(yīng)用價值。
[0006] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種灰葡萄孢的早期快速分子的檢測方法，其步驟是： 1.依據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李國慶課題組通過RAro方法擴增獲得的灰葡萄孢特異性片段為 革巴標，利用在線軟件Primer Explorer 5. 0設(shè)計LAMP引物，每一組LAMP引物包括兩條外引 物（F3，B3)，上游內(nèi)引物（FIP)，下游內(nèi)引物（BIP)。本發(fā)明使用的引物序列如下 ： BC-F3 :5' -AATGATCGCCTACACAGC-3' BC-B3 :5' -AGCTACCACCGAGAACAA-3， BC-FIP :5' -TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3 BC-BIP :5' -TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG-3' 利用該引物在恒溫（64°C )條件下，進行LAMP擴增，反應(yīng)體系及程序如下： 表I. LAMP的反應(yīng)體系（25 μ L)

【權(quán)利要求】
1. 一種灰葡萄孢的早期快速分子檢測方法，其步驟是： (1)通過RAro方法擴增獲得的灰葡萄孢特異性片段為靶標，利用在線軟件Primer Explorer 5. 0設(shè)計LAMP引物，每一組LAMP引物包括兩條外引物F3, B3,上游內(nèi)引物FIP， 下游內(nèi)引物BIP，所述的2對特異性引物的序列分別是： BC-F3 :5' -AATGATCGCCTACACAGC-3' BC-B3 :5' -AGCTACCACCGAGAACAA-3， BC-FIP ：5, -TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3 BC-BIP :5' -TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG-3'， 利用該引物在恒溫條件下，進行LAMP擴增，LAMP反應(yīng)體系及條件； (2 )利用步驟（1)的引物在恒溫條件下，進行LAMP擴增，取5 μ L產(chǎn)物于2. 0 %質(zhì)量體 積比瓊脂糖凝膠電泳分析或用染料法進行觀察； (3)進行結(jié)果判斷，觀察電泳結(jié)果有梯形條帶出現(xiàn)或加入染料后產(chǎn)物為綠色，有梯形條 帶出現(xiàn)或產(chǎn)物為綠色，DNA來源為灰葡萄孢，沒有梯形條帶出現(xiàn)或產(chǎn)物不變色，DNA來源不 是灰匍萄抱。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰一種灰葡萄孢的早期快速分子檢測方法，其特征在于，所 述的利用引物在恒溫條件下，進行LAMP擴增，LAMP反應(yīng)體系及條件是： LAMP的反應(yīng)體系（25 μ L):
反應(yīng)程序為：64°C 45 min，85°C 5 min。
【文檔編號】C12Q1/04GK104293957SQ201410543134
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月14日
【發(fā)明者】程家森, 李斌, 姜道宏, 付艷蘋, 謝甲濤, 李國慶 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)