微小核苷酸has-miR574-3p在高血壓診斷中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微小核苷酸has-miR574-3p在高血壓診斷中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明收集高血壓前期，高血壓患者和正常人的血漿對全基因組miR表達譜進行研究。研究結(jié)果揭示了一系列miRs與高血壓前期和高血壓相關(guān)，這些差異表達的miRs有助于闡釋高血壓發(fā)病的分子機制；為高血壓前期和高血壓的進展評估提供分子標記物；為有效控制血壓，治療高血壓前期和高血壓提供全新的治療靶點，同時采用單一miR或結(jié)合多個miRs的拮抗劑、模擬劑，為高血壓前期和高血壓的治療提供全新的手段。
【專利說明】微小核苷酸has-miR574-3p在高血壓診斷中的應用
[0001] 本申請是申請日2013年11月26日，申請?zhí)?01310605650. 4,發(fā)明創(chuàng)造名稱為"微 小核苷酸在高血壓診斷和制備降血壓藥物中的應用"的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及微小核苷酸新用途，具體地說，是微小核苷酸（microRNA) has-miR574_3p在高血壓診斷中的應用。

【背景技術(shù)】
[0003] 高血壓（hypertension)是一種常見的以動脈血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)的慢 性疾病，指在靜息狀態(tài)下動脈收縮壓> HOmmHg和/或舒張壓> 90mmHg。而收縮壓在 120-139mmHg和/或舒張壓在80-89mmHg之間稱為高血壓前期或正常高值。
[0004] 高血壓是心腦血管病最主要的危險因素，其腦卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性腎 臟病等主要并發(fā)癥，不僅致殘、致死率高，而且嚴重消耗醫(yī)療和社會資源，給家庭和國家造 成沉重負擔。大量長期的臨床觀察表明高血壓前期也是心腦血管疾病和腎病的獨立危險因 素。我國人群50年來高血壓患病率的明顯上升趨勢。根據(jù)2002年調(diào)查數(shù)據(jù)，我國18歲以 上成人高血壓患病率為18. 8%，估計目前我國約有2億高血壓患者，每10個成年人中就有2 人患有高血壓，約占全球高血壓總?cè)藬?shù)的1/5。高血壓前期在我國的發(fā)病率約為44%-60%， 以中青年為主；其中45%的高血壓前期在十年內(nèi)發(fā)展為高血壓，是我國高血壓患者的"后備 軍"。國內(nèi)外的實踐證明，高血壓是可以預防和控制的疾病，降低高血壓患者的血壓水平，可 明顯減少腦卒中及心臟病事件，顯著改善患者的生存質(zhì)量，有效降低疾病負擔。
[0005] 微小核苷酸（microRNA，miR)通常由15-22個核苷酸組成，是一類短鏈的，保守的 非編碼RNAs。miR對基因表達具有重要的調(diào)控功能，主要通過降解目標mRNA或抑制其翻譯 而達到抑制基因轉(zhuǎn)錄后表達的效應。miR介導的基因表達調(diào)控特點是一個miR通常有多個 靶基因，涉及多個信號通路；而一個基因可同時受到多個miR的調(diào)控，因此miR相關(guān)的基因 表達調(diào)控具有網(wǎng)絡狀及相關(guān)對話的特點。miR的生物學效應涉及廣泛的生物學過程，包括 細胞增殖、分化、生長、凋亡等。miRNAs表達異常涉及多種病理生理狀態(tài)的發(fā)生機制，包括 器官發(fā)育、衰老、腫瘤、心臟疾病、神經(jīng)退行性病變等。因此，miRs是理解疾病發(fā)生發(fā)展的重 要分子生物學環(huán)節(jié)，同時亦是相關(guān)疾病治療的重要靶點?；趍iRs的治療模式主要包括兩 方面的途徑：miR拮抗劑（miRantagonists)或抑制劑（microRNAinhibitors)和miR模 擬劑（microRNAmimics)。miR拮抗劑主要用于抑制在疾病狀態(tài)下內(nèi)源性miRs表達或功能 的上調(diào)，而miR模擬劑主要是用來恢復疾病過程中內(nèi)源性miRs表達或功能的下調(diào)。通過對 miR的調(diào)節(jié)，可對其調(diào)控的一系列靶基因的表達進行協(xié)同有效的調(diào)節(jié)，從而起到對疾病的干 預效應。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備 診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應用。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是，提供微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備評估高血壓的疾 病進展的醫(yī)療器械中的應用。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是，提供微小核苷酸hsa-miR574-3p作為靶點在篩選降血壓 及靶器官保護的藥物中的應用。
[0009] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：微小核苷酸hsa-miR574-3p 在制備診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應用，所述的診斷高血壓的醫(yī)療器械以微小核苷酸作為 診斷分子標記物。
[0010]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備評估高血壓的疾病進展的醫(yī)療器械中的應用，所述的醫(yī)療器械以微小核苷酸作為診 斷分子標記物。
[0011]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：微小核苷酸hsa-miR574-3p作為靶點在篩選降血壓及靶器官保護的藥物中的應用。
[0012] 本發(fā)明優(yōu)點在于： 本發(fā)明收集高血壓前期，高血壓患者和正常人的血漿對全基因組HIiR表達譜進行研 究。研究結(jié)果揭示了一系列miRs與高血壓前期和高血壓相關(guān)，這些差異表達的miRs有助 于闡釋高血壓發(fā)病的分子機制；為高血壓前期和高血壓的進展評估提供分子標記物；為有 效控制血壓，治療高血壓前期和高血壓提供全新的治療靶點，同時采用單一miR或結(jié)合多 個miRs的拮抗劑、模擬劑，為高血壓前期和高血壓的治療提供全新的手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1.在正常vs高血壓前期，正常vs高血壓和高血壓前期vs高血壓兩兩比較分 析中具有顯著差異(/?〈〇. 05)的miRs進行交集。
[0014] 圖2.在正常vs高血壓前期，正常vs高血壓和高血壓前期vs高血壓兩兩比較分 析中表達差異倍數(shù)大于2的miRs進行交集。

【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0016] 實施例1 在本實施方案中，本發(fā)明主要通過miR表達譜芯片的研究手段，探討并明確了高血壓 前期及高血壓形成過程中差異表達的miRs。這一研究首次揭示高血壓前期及高血壓相關(guān) 的表達變化的miRs，不僅有助于更加全面地闡明高血壓發(fā)病的分子機制，同時為高血壓疾 病進展的評估提供了一系列全新的分子標志物，并提供了一系列全新的基于miR的治療靶 點，為基于miR的降低血壓及高血壓病靶器官保護的治療手段的研發(fā)奠定了良好的基礎。
[0017] -、方法 1.臨床研究樣本收集 用于本發(fā)明的樣本全部來自本院，并且所有研究對象都認真閱讀并簽署知情同意書， 符合倫理學標準。研究對象均為男性，年齡在36-50歲之間。在不使用藥物的情況下，使 用水銀血壓計對研究對象動脈血壓進行測量，并重復三次。收縮壓< 120mmHg和舒張壓 < 90mmHg納入正常對照組；收縮壓彡HOmmHg和/或舒張壓彡90mmHg的研究對象納入高 血壓組；而使用24小時動態(tài)血壓計監(jiān)測全天平均收縮壓在120-139mmHg和/或舒張壓在 80-89mmHg的研究對象納入高血壓前期組。所有研究對象通過進行心電圖和其他生化指標 檢測排除患有心臟病，腎病和糖尿病，同時使用EDTA抗凝采血管收集2ml血液。收集的血 樣離心（3000轉(zhuǎn)/分）10分鐘，取上層血漿用于本研究。
[0018] 2.血漿miR表達譜芯片 米用mirVana?miRNAIsolationKit(Cat#AM1561,Ambion，Austin,TX，US)并 且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標準操作流程進行血漿樣品的totalRNA抽提，抽提所得total RNA經(jīng)AgilentBioanalyzer2100(Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US) 電泳質(zhì)檢合格后備用。實驗樣品RNA采用AgilentmiRNA芯片配套的試劑盒，miRNA CompleteLabelingandHybKit(Cat#519〇-〇456,Agilenttechnologies,Santa Clara,CA,US)，按照標準操作流程的標記部分對樣品中的miRNA分子進行熒光標記， 用于AgilenthumanmiRNAmicroarray進行全基因組miR表達譜分析。芯片試驗按照 AgilentmiRNA芯片配套提供的標準操作流程和配套試劑盒，miRNACompleteLabeling andHybKit(Cat#519〇-〇456,Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)的雜交部 分，進行樣品的雜交實驗。在滾動雜交爐中，Hybridization0ven(Cat#G2545A,Agilent technologies,SantaClara,CA,US), 55°C，20rpm，滾動雜交 20 小時。雜交完成后在洗 缸stainingdishes(Cat#121,ThermoShandon,Waltham,MA,US)中洗片，洗片所用的 試劑為GeneExpressionWashBufferKit(Cat#5188_5327,Agilenttechnologies, SantaClara,CA,US)。芯片結(jié)果米用AgilentMicroarrayScanner(Cat#G2565BA, Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)進行掃描，用FeatureExtraction software10.7(Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)讀取數(shù)據(jù)，軟件設置 Scanresolution=5μm,PMT100%，5% 最后米用GeneSpringSoftware11. 0(Agilent technologies,SantaClara,CA,US)進行歸一化處理，所用的算法為Quantile。
[0019] 3.統(tǒng)計學分析 對兩組樣品的芯片結(jié)果采用?檢驗及倍數(shù)差異（FoldChange，F(xiàn)C)計算篩選進行統(tǒng)計 學分析。
[0020] 二、結(jié)果 1.各組樣本臨床資料 對正常對照，高血壓前期和高血壓三組樣本臨床信息進行分析，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示， 表明高血壓組收縮壓和舒張壓明顯高于正常對照組和高血壓前期組，高血壓前期組明顯高 于正常對照組。高血壓組肌酐水平明顯高于高血壓前期和正常對照組，且與高血壓前期組 比較具有顯著差異。年齡，BMI指數(shù)，尿素，尿酸，甘油三酯，總膽固醇，HDL和LDL在三組間 都沒有顯著差異。
[0021] 表1.研究所用樣本臨床信息統(tǒng)計

【權(quán)利要求】
1. 微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應用，所述的診斷高 血壓的醫(yī)療器械以微小核苷酸作為診斷分子標記物。
2. 微小核苷酸hsa-miR574-3p在制備評估高血壓的疾病進展的醫(yī)療器械中的應用，所 述的醫(yī)療器械以微小核苷酸作為診斷分子標記物。
3. 微小核苷酸hsa-miR574-3p作為靶點在篩選降血壓及靶器官保護的藥物中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357555SQ201410543912
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】張騰, 陳瑜, 賈成林, 楊琴波, 王培偉, 李黎, 崔金剛, 杜宵燁, 寧冰冰, 劉麗 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院